生物學(xué)利用MEGA5.0和Clustalx軟件構(gòu)建進(jìn)化樹

1、生物學(xué)利用 MEGA5.0禾口 Clustalxl .83軟件構(gòu)建進(jìn)化樹MEGA是一個關(guān)于序列分析以及比較統(tǒng)計的工具包，從3.1版本到后來的4.0版本一直都廣為大家熟悉，現(xiàn)在推出了 Mega5.0版本。功能比以前多有改進(jìn)。現(xiàn)主要介紹使用Mega5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的方法。供大家參考。用MEGA構(gòu)建進(jìn)化樹有以下步驟：1、測序:將克隆擴(kuò)增測序得到的 16S rDNA序列進(jìn)行測序。2、NCBI 上做 Blasthttp:/www. ncbi. nlm.n /blast/Blast.cgi找到相似度最高的幾個序列，確定一下你分離的細(xì)菌大約屬于哪個科哪個屬，如果相似度達(dá)到百分之百那基本可以確

2、定你分離得到的就是Blast到的那個，然后尋找相似性最高的細(xì)菌，通常把該屬的序列（Fasta格式文件）下載下來，或點擊Gen Ba nk登錄號，復(fù)制FSATA 格式，整合在一個*.txt文檔中（單獨建立一個文件夾存放，后面的很多文件會自動裝入該 文件夾），如>xxxxAGGCTTAACACA TGCAAGTCGAGCGGAGCGAGGGTGCTTGCACCTTAGCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA TGCTTAGGAA TCTGCCTA TTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGA ATGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGA T

3、CTTCGGACCTTGCGCTAA TAGATGAGCCTAAGTCGGA TTAGCTAGTTGGTGGG>gi|289469964|gb|GU388381.1| Acinetobacter tandoii strain DSM 14970 16S ribosomal RNA gene, partial seque neeACTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGGATGCTAATACCGCA TACGCCCTACGGGGGAAAGCAGGGGATCTTCGG ACCTTGCGCTAATAG

4、ATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTAC CAAGGCGACGA TCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGA 參考序列選擇注意事項：1、不選非培養(yǎng)（unclutured）微生物為參比；2、 不選未定分類地位的微生物，最相近的僅作參考；c,在保證同屬的前提下，優(yōu)先選擇16S rDNA全長測序或全基因組測序的種；d，每個種屬選擇一個參考序列，如果自己的序列中同一屬的較多，可適當(dāng)選擇兩個參考序列。3、使用clustalx1.83進(jìn)行序列比對打開壓縮文件 clustalx1.83，運(yùn)行其中的 clustalx.exe文件，如圖：掃自辭壓格式毎壓到

5、測試 査看點擊大小壓縮后犬水類型修改時人孑 dliyhaiff. h£.699l.oec文詩k2003-1 colpr ot. p-ar1,429S61艾件fT2003-1閔 ffQlprillt p«r36$1.5：丈件220C3-1eoldna. parE30文拌par2003-1£ clii&talx. hlml口 13421,200 3&D=elBL2003-1M flustAljc. hip64,3132O.7T2幫明文件2003-1Jcliistalx的豈36203, HI應(yīng)用程序2003-4File/load seque nces,將

6、整理好的*.txt序列文件導(dǎo)入clustalx1.83，如圖E 唇tluslLilKl. 03. Tip - ZIF JE縮丈唯 解赳大水為1, 7S1. 3S2手節(jié)M ClustalX (t. 83)-n.xMultiple Alignment Mode * Fonl Size; 1 0 _*271342056 00422&10 1&1579972 348161412 1&4652764 2S592705S 冊1弓11駐 3211E9371 2&5927064b bbbh-h-bbb9d- mg-gggg-g rCGCCCTTTAATrTAAAAGACTTGG

7、TGCGCAACTiCCATGCAiGTCGGACGGTAGCACAGA GAGTTTGATC iTGGCTCASATTGI WtQCTGGfGGCAGGCC T 融 11CATGC 酣GTCG 審匚 mTq；.ACQCT2qGGfcGCCT.AAr A 2 ATQC A AGTC qiCQGT AQC ACAGiaGCTTQCT TTCTCGGGrTGACi3AGrGQCCGACGGGTGAGriATi3TCTi3CGC*TCTGCOCGAT*GAGGGG CTAGAAGAGTTTGATCATGQCTCiGArTGAA 匚 GUTEGCGGCAGGQC 丁盒直匚 ACTGC 扎GT WCSj

8、GGGTGAGTMT右 TCTGGGgATCTGCCCgAT 占 G1GGGG誹 TMCSCTGGA 血亡 GGT ATTGliC'XTG 3CGGCiGGCCTA ACAC AT' A A 電ZQ ；TAACA ；iACiGCTTGC TGQCGGGAGQCTiACACATi；CAACTCGACCGTAi；CACiCA4a*QCTTQCTCTTQQGGTQ ；占 TT'SAACGCTGGCGGCAGGCCr 占 AC 直 ETGCAAGTCGUACGGT盤 GC盒CAGG Tc匚占G 乂匚T型ACACATGCAALTCGAACg TAACAGGiAGCAGCrTuCr

9、 r. -t Ti-T'r-Tr-i-. -r-1 T'i-Ti-rri- t i r f, rr ._ r-r-人 t 人 l廣 £ lt t- sl 入 i rr. ATTG14CGCTGQCGGC1GCTGGCTATTGiAi接著點擊 Alignment/Do Complete Aligment CtlHtAlX 1JJmtE'J*口|*巳 fc弧+ 2*Y tH-MuMiplFtciduc# 3de Trw O4y g AAgrww* from Gode TreeMeet 就 SeouerKM r 申*1.Rei4j« Un#程序自動運(yùn)行，得

10、出結(jié)果，自動輸出*.aln和* .dnd為后綴的兩個文件，并自動存入你*.txt文件所在的文件夾內(nèi)。序列比對也可以直接用 MEGA來做。4、運(yùn)行程序 MEGA 5.0，如下圖所示:First braUsBi?TutorsEKamptesCitai ionIEGA icImm h5i 10426MEGA Web冋IReport a BugUpdates?Custofflize TedCai ” Pt首血ncei 點擊：File 導(dǎo)入 Clustal 程序得到的 *.aln 文件。再點 File/Convert to MEGA Format，打 開轉(zhuǎn)換文件對話框，從目的文件夾中選中Clustal對

11、比分析后所產(chǎn)生的*.aIn文件，轉(zhuǎn)換為*.meg文件。轉(zhuǎn)換時一路確認(rèn)相關(guān)界面。最后查看meg序列文件最后是否正常，命名新文件 存盤保存*.meg文件，*.meg文件會和aln文件保存在上述*.txt同一個文件夾中。5、關(guān)閉轉(zhuǎn)換窗口，回到主窗口，現(xiàn)在點面板上的"Click me to activate a data file打開剛才 ”的*.meg文件。 HEFiii line U冊存luiorial EwnplcgME&APieeierces 囚口 盃 2Q1H 214 mw如果為核酸序列，選擇 Nucleotide sequenee”，點擊"OK,得到以下圖示。/

12、OpiiansRun StatusEbail timefileSt-alusFrsL tiri'ie User?TTutorial2CH112U.oZC1-2Z 20111214 nw. iMEGA idrae H&l 10426選擇默認(rèn)的Standard,點擊OK后，如圖所示。TA <點擊程序中的，可以得到下圖05C T G G&4GATTG*ACG - I 料 |t I V A A »C Q -I - - 1 A . IT T a A A £ aT 1 A A T T T A A A A05可對所選擇的在另外一個窗口內(nèi)，出現(xiàn)以下數(shù)據(jù)文件點擊

13、選擇和編輯數(shù)據(jù)分類圖標(biāo),序列進(jìn)行編輯，完成后點擊close即可。0505昶讓 11414-9 II vMl1 l«ii| i1|Bi. Id#i IHLTtlil i m « tIl審.' I r ft H H < E W r I. 9 t扌 *r»*il s Ad-N T IVlftiPI hsi rQtai|ii!p4Vllfe i |rrftflijj.4i!liMUMr r 1 « I L >«-> kKTinrt i P f點擊*cl T!小1 fl審爲(wèi)| - 1 * |>i1 A 1* gA細(xì).1 -

14、A |Y Hpf PC > 1 « W< *»"芽-工V # I4 E帀Tir wa 44 w flVt ¥T «tE i k * I- *II t 1 411i 4 »h44 W Vi H¥ 4I4 i A 4vM9 t ta 0 Ii. a： r w ii * h h M T i i n N i. h | 4 V | u i V N h b * f I M L * « *PEa itit.W廳屯-W -LT* 少-uuiuKi嘆擊，可進(jìn)齊的序列* #«VT|d #* 廳KR4審 *j序列名

15、LI+JJ稱編輯05ok即可。序列編輯完成后，可進(jìn)行保存，點擊保存后出現(xiàn)以下界面，點擊1 A. U W 4 Ua ft ta棗*w t 4 vi Ci * |i * 葉.【*p i0 *w 1 t .9t*lV M-rf1 A 41 * |finD « «-.Qo 1卩If t ID B=tAp1 ft n 1Il 5F |r r I fc *infSvivupru'* Vfl* rE i 9 V< C 1F *|Q|4P 常P V i甲l£ fvIN 4» & W1 « R W 4 Vc i豊ft*rf0T i F $

16、PMI 1H>1巾v tV09* | T| 1打#fP f *a RV V i T « I-o * wf >Jk V- TA 1 * d* t '1 iF 1： f-L1w"rilflIA -if* a4y * i 'J fr v*H M L* p1 FQifl fr 9ir VTA p T一 P>tf M V f |2WhkIs Codkp 11 A 11Uv w o vP A9in：iP口戸1* A- 1 看 TA A f »Ki9 t具0 if f期中A1 T#1t f1 鼻 1 譬用A C p *f 0 1f p*1 if

17、ti 1¥44* Ta < l F-'ft 1<Q*Q>QM*IV4臺爲(wèi) N 如皿“ 2耳叮jC A r rI ft 4 V U陽F fT .if''XTtLa4 w th tA AL Iysmu 0 *1 M- 4 W > M4MHW1 H £r tb * Q ft事 p «W lb >K* # fl ¥ t 十a(chǎn)* i *中v« *#A Ml鼻”心*馨G Mw *1* r? tt* *e 輩1 4k ©13Q i aqFtMMinjrPg fW * V V d |ecuv &#

18、165; : " D 7 T TT "W p A-J A Jr rV寸i1« 4 W ft Wten* f.f4 fta *v # i #v h « «* 4 I w wIft p * *l 6» l TFrn ft：Q' II »4 W C14lb轉(zhuǎn)* k fL ID*l* » *審V “ AA-A和吋點I P1 « ' « t門J律??？衛(wèi)6* f-i構(gòu)建進(jìn)化樹的算法兩類主要方法簡要說明：獨立元素法(discrete character methods)是指進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钍怯?/p>

19、序列上的每個堿基/氨基酸的狀態(tài)決定的(例如：一個序列上可能包含很多的酶切位點，而每個酶切位點的 存在與否是由幾個堿基的狀態(tài)決定的，也就是說一個序列堿基的狀態(tài)決定著它的酶切位點狀態(tài)，當(dāng)多個序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析時，進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钜簿陀蛇@些堿基的狀態(tài)決定了)距離依靠法(distanee methods)是指進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钣蓛蓛尚蛄械倪M(jìn)化距離決定的。進(jìn)化樹枝條的長度代表著進(jìn)化距離。獨立元素法包括最大簡約性法(Maximum Parsim onymethods)和最大可能性法(Maximum Likelihood methods)；距離依靠法包括除權(quán)配對法(UPGMAM )和鄰位相連法(Neighbo

20、r-joining )。(1) phyloge ny 宀 UPGMAmm-(2)用Bootstrap構(gòu)建進(jìn)化樹，MEGA的主要功能就是做 Bootstrap驗證的進(jìn)化樹分析， Bootstrap驗證是對進(jìn)化樹進(jìn)行統(tǒng)計驗證的一種方法，可以作為進(jìn)化樹可靠性的一個度量。 各種算法雖然不同，但是操作方法基本一致。進(jìn)化樹的構(gòu)建是一個統(tǒng)計學(xué)問題。我們所構(gòu)建出來的進(jìn)化樹只是對真實的進(jìn)化關(guān)系的評估或者模擬。如果我們采用了一個適當(dāng)?shù)姆椒?，那么所?gòu)建的進(jìn)化樹就會接近真實的進(jìn)化樹”。模擬的進(jìn)化樹需要一種數(shù)學(xué)方法來對其進(jìn)行評估。不同的算法有不同的適用目標(biāo)。一般來說，最大簡約性法適用于符合以下條件的多序列：i所要比較的

21、序列的堿基差別小，ii對于序列上的每一個堿基有近似相等的變異率，iii沒有過多的顛換/轉(zhuǎn)換的傾向，iv所檢驗的序列的堿基數(shù)目較多(大于幾千個堿基)；用最大可能性法分析序列則不需以上的諸多條件，但是此種方法計算極其耗時。如果分析的序列較多，有可能要花上幾天的時間才能計算完畢。具體構(gòu)建過程如下Phylogeny 參數(shù)的設(shè)置：點擊，選擇該菜單中的 Construct/test Neighbor-Joining tree,選擇前面轉(zhuǎn)換得到的*meg文件，得到下圖點擊OK對下圖的參數(shù)進(jìn)行設(shè)置:說明:系統(tǒng)進(jìn)化樹的測試方法Test of Phylogeny，通常要選擇 Bootstrap method，也可

22、以選擇不進(jìn)行測試；重復(fù)次數(shù)No. of bootstrap Replications通常設(shè)定至少要大于100比較好，隨機(jī)數(shù)種子可以自己隨意設(shè)定，不會影響計算結(jié)果。一般選擇500或1000。Model/Method通常選擇 Kimura 2-paramete r。設(shè)定完成，點compute,開始計算得到進(jìn)化樹構(gòu)建的結(jié)果。如下圖所示;Original free SDOfistrap consensus iret59Z7gi|27O342DS6|gb|G 051699 1| gi32221C03|gbkJN 175332 1| gi|l646S27S4|9b|EU2l673£.1|ZC1

23、22gi|1894'92194|gb|Ell727121 1|S gir3i8161412|gb|JN6i|4500 1| gi|151fi79972|9h|EF69J403.1gipCad22B1O|dbjlAS5?1245 1|Igill 9682357 |gb|EU9W42 1|S31 gi|1577603H|gb|EF668C11 1|I gi33O717793|ghklF792OaS.-|gi 339267731 gh|JF5aGg39.115E pgi|3J35288S0|gb|JF295Q53 1|1 gi|343526895|gbUF296055 1| gi |i 94

24、022222|gh lAFl 30959.2|I9i|3422210l3|gb|JN175342 l|bTL g,|3432O5&2J|reqNF? 0J39B0 1|gi|I21159371 |gb|HQ7O6113 1|gir329131195|gb|JF-19d01S .l|SB該窗口中有兩個屬性頁，一個是原始樹Original tree，個是 bootstrap驗證過的一致樹Bootstrap concensus tree。樹枝上的數(shù)字表示bootstrap驗證中該樹枝可信度的百分比。得到構(gòu)建的進(jìn)化樹后可以對該進(jìn)化樹進(jìn)行優(yōu)化。(本文參考網(wǎng)友的文章，同Mega的其它版本使用基本相

25、同，在此表示感謝。以下進(jìn)化樹的優(yōu)化部分直接引用)(1)利用該軟件可得到不同樹型，如下圖所示：B> soraiditC. c Lin ed（2radi3tion（3）circJe（2radi3tion（3）circJe（2radi3tion（3）circJe（2radi3tion（3）circJe除此之外，還可以有多種樹型，根據(jù)需要來選擇。（2radi3tion（3）circJe（2radi3tion（3）circJe2）顯示建樹的相關(guān)信息：點擊圖標(biāo)（2radi3tion（3）circJe（2radi3tion（3）circJe3）點擊優(yōu)化圖標(biāo)，可進(jìn)行各項優(yōu)化：rectangular tr

26、ee/circle tree/radiation tree。每種樹Tree欄中，可以進(jìn)行樹型選擇:都可以進(jìn)行長度，寬度或角度等的設(shè)定迂 Options岡Branch：可對樹枝上的信息進(jìn)行修改。3C百j-CWWjT'jB t-M-點主點壬R SMnrr PTi ik.-4 -JSwwrPgBJJ-a3mrftvAl-2SittVCEhftAl-S . IwrePccJiV-lF"l 3mrncA-l肌 *jL2> 1 KfliVS-EFiBiU SCMill-J 3«4«3113 54toV«-FOIjdh.4>l kkVdEtci.4

27、-"!Swrtt Ji就斗-1 BwtflrVtM-" i 3iHVWEDlbA4-Z 3w»rAwA9-> *4v<e Aveldil-A 3*v«rlvwl2-l3v»rWal2-JSrrvKMvvAJ-l!ItVfg *負(fù)）- JSwvHugawwrFIWl-J選中Branch,可對已 恂建吊樹枝上顯錄的 信息進(jìn)行欣*盍擊 Hide values lower iham軒入救據(jù)"可設(shè) 直支持車？歸以上的 數(shù)值才顯示！點壬placemen!下拉框 可選擇皺據(jù)信枚覧在 帕枝申的世肯.Lable:可對樹枝的名字進(jìn)行修改。Sw

28、virFtiH-iSwverr tetl-3-_- Saver Pt e 12-2選中Lab d總可對已構(gòu) 建的樹橈的名稱進(jìn)行 修飾.點擊Shape下拉框，可 選中殛械！Cdor下拉框可 選中顏色°SMiF«4Jll-4 SbVePIcII-S SwvwPTe-t-1 3«wePc*15-1 awtrftrii-i 3«vr<KeA£-i SwwrPtsl.1 ScMlilS SeaclLl'JiB71 T 3«v*rl¥«A4-3». 3&-vezAwJL1->-l9

29、1;wrivrK3-3 jwvirclveJi9-l'L JlVCJL±-JSavIv# 11- -swtriwl'l hi/VEi AAj-2 SWceIiwAj!-!O3.>d&AaTi Lln T 弔說至耳啟"已世干1匪口 朗用國它禰*晾£，R 可 4相廠沖的£Z 疔不冏用喊性辭， &工卸從ftM|r申iX 坪rum-即可選屮另生在懷二的 g聃.逢玄燈直色® tb債櫛!t川二舊薔稱0.擊即可.堆設(shè).吉曰3 巧壬3：Scale :標(biāo)尺設(shè)置Cutoff : cut off for consensus tr

30、ee。一般為 50%。9、進(jìn)化樹的分類優(yōu)化Place root on branch ：可以來回轉(zhuǎn)換。B昌電觀專唾煙臺確0 諄“I tr*B B ootstrdp ctnseniut tieeGXHP-2 E-GXGP EGXH不2 EGXHZI E尹 GXHB2 EGXBH-J EGXBHJ E- GXHXEGXWZ-2 EGXHPgGXXY EJ GXWM詁 nwv7怎 hRH | BeWth ttnWnftjs hn |9EEGWXE2 AME1CAM-TYPE PRRSVILV LsljFslQd19idGXNNGXWH2E3S-GfXCZIgxgl-GMSHFlip subtree :

31、 180度翻轉(zhuǎn)分枝，名字翻轉(zhuǎn)180度。Swab subtree：交換分枝，名字不翻轉(zhuǎn)。Compress/expa nd subtree與Set diverge nt time :可以把同一分枝的基因壓縮或擴(kuò)展。點擊 Compress/expand subtree后，在要壓縮的分枝處點擊，出現(xiàn)以下界面，在OK。name/caption中輸入文件名（例如 wwww），其他還有很多的選項，設(shè)置好了，點擊1Q130.05pGaz-i1»1G)CLZ2所得到的結(jié)果，可以在壓縮和擴(kuò)展之間轉(zhuǎn)換。gpT litfl 0cc4siia<p can sens ue lice10l GXBH19GX

32、FSE2GXWM-2 Eme鳥 Dignalh-eB | BcoisGXNNQW2 門:附P2EG池2EGXB0-2EOXBH-TEGXWZ-2EGXJ-FGKCY EGWVMI Ji10.調(diào)整進(jìn)化樹根據(jù)所的進(jìn)化樹的效果，要進(jìn)行調(diào)整，包括多余序列刪除、不足序列添加、種屬名稱標(biāo)注等等，還要根據(jù)投稿雜志要求在PHOTOSHOP中修改等。完成后的進(jìn)化樹應(yīng)包含充足的信息。參考網(wǎng)友的進(jìn)化樹完成圖如下：aiMsiice tranipin gciicaiwnile oxidise geneMininml i nhihim<y gfiecinraEboih MICHITS4 H20 mM. irs0/4

33、CR3(2)勺TS33 IS mM, araB/ACRJ(2)|i IS 12 20mUZACRJU)DeJ/ijj tsuru加膽刖祖 ATCC BAA-554 (ABO75CH7)ITS30 9» jtlM. ansB/ACR3(2)TS4D (5 mM rTS37 (21 *rsB-4- TS3 K (2« eMe araB 常J SY5 l?mM, aF5 " Cc.manwnujs 嘟血Itrufi別rain ViTtB IW5 (AM IS42S4) nwanwnas denitn/iesns strain I tO (AF2J3IS76 -TS24

34、U niMwrs曲 TS32(7 inM. ACRJ(2)T$35 口 niM. ACBM2)I (KI0.G2I 恤TS7 (10 mMb 4CJ?(2)j * Acrjcvunr.T jwnirc hrulli AAOOCi-】1啊1'_00?!"?5即100 SY8(13 mM, fciKMCJU. AchfiinHxlMurcrxyw.xjdang strain A19 |AF43931i4j 柿HcTrnr/TJjmDnns arwnjiraiydans (IC_00* II3B盟 ITS3 H mMe btsBl 血nthMofw吧rim忖踽-ICI6I (AK1

35、%254)IW)| TS4 116 mMlI Th刖吐宓幼;iriwM $葉詁 LGSJAJ-S 156A0) 91 IS23 (21 mM, ACXJ(J)iJ' SfimtrtmpdhMkNias 印.IC193 < AB 1962561 -| SY 2& rmM. ACR31JCJ(2)2 rTS15E2l tttM, SJicjwrnjpfioinorjj.? ip. Toyama-1 1A E51 *066；)100 TS2S 12 mH, ACJ?.1(JV4Cfl3(2» S¥2 (16 mM, 4rRJ(i XACR3t2)jTS2*

36、E16 mM, 4CKJ(i MCKJ(2) TSJ6 39 rtiM. AC站燈御Awvrm?Ei、RydE時山 ATCX 79Mi (NC_OUKS70 Ewrwmhw Mi K12 (NC_0W)I 刃Kk TS34(? ioM, arH)I- Ktehalh jWvjhi MGH 7SJ1S iJC CldUA) IVOiTS29 12 mM, raa/ACR3(2) L SHwsjk曲 sp. ANA-3 (NC 0CMIJ77)TS9 (6 mM, 4CRJ(2J TS44(23 mM r aoiH/rtC!f J (I yA CR312) SV6 3 mhl, usflTS5 9 mM* SY7燈eM.聰珈"：恥他 /SfudorthMUs 紳ri曲 KT?4d" (N<'bwfo咖rnft flwrwvfflj Ff-S (NC_tift4l2*FSY4 (5 mM, ara&：4Cfi3(2)f WrTSStfnMnj4yp- TS42 32 mM】制