現(xiàn)代色譜分析-HPLC1

1、l高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法原理相同，無本質(zhì)區(qū)別。l1. 新型高效輸液泵，使分析時間縮短l2. 高效固定相，分離效能高，選擇性好l3. 高靈敏度檢測器l1. 高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定、分子量大、不同極性的有機(jī)物；l2. 生物活性物質(zhì)、天然產(chǎn)物；l3. 合成與天然高分子l涉及石油化工、食品、藥品、生物化工、環(huán)境等領(lǐng)域。80的化合物可用HPLC分析。l1. 溶劑消耗大，成本高于GC, 梯度洗脫的操作也比GC的程序升溫復(fù)雜。l2. 缺少通用型檢測器。近年來ELSD應(yīng)用日益增多，有望成為通用型檢測器，但穩(wěn)定性尚需提高。l3. HPLC不能代替GC，對于柱效要求高的分析，仍需GC，如石油產(chǎn)品。l4. HPL

2、C 不能代替中、低壓色譜，如受壓易分解變性的具有生物活性的生化樣品。高效液相色譜進(jìn)樣口檢測器色譜圖色譜柱溶劑泵混合器 (HPLC)l1. 貯液瓶應(yīng)耐腐蝕，用玻璃、不銹鋼、氟塑料或特種塑料。l2. 溶劑使用前必須經(jīng)過0.45m濾膜過濾，過濾用液相色譜專用濾膜或4號微孔玻璃漏斗。l1. 氦脫氣法l2. 加熱回流l3. 抽真空l4. 超聲脫氣l5. 在線脫氣HP1100 on-line degasser12 mlSolenoid valvel要求：l1. 泵體材料耐腐蝕。優(yōu)質(zhì)耐酸不銹鋼，聚醚醚酮（PEEK)l2. 耐高壓。4050MPal3. 輸出流量范圍寬。填充柱: 0.110 ml/ min(分

3、析型），1100ml/min; 微徑柱：101000l/minl4. 輸出流量穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。l優(yōu)點(diǎn)：流量穩(wěn)定，無脈動l缺點(diǎn)：l （1）液缸體積有限，約100150ml, 不利于連續(xù)工作。l （2）不能用于梯度洗脫。單元泵工作原理單元泵工作原理Authoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) DamperPurge valveSealPistonBall Screw DriveMotor with EncoderGearOutlet Ball ValveActive Inlet Valvel1.可在高壓下連續(xù)輸液l2.

4、液缸容積小（幾十幾百微升），適合于梯度洗脫l3.存在脈動l4.柱塞與流動相直接接觸，易造成污染l又稱氣動放大泵四元泵工作原理Authoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) Vacuum ChamberMCGVAIVOBVDamperPurge ValveWasteto injection devicefrom solventbottlesMCGV 比例閥AIV 主動閥OBV 單向閥ToWasteSample Loop(Fixed Volume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectTo

5、ColumnPumpFrom PumpTo Waste手動進(jìn)樣器六通閥Agilent 1100 系列自動進(jìn)樣器系列自動進(jìn)樣器00.10.20.30.40.50.6Precision 10 25 50 100l1. 柱材料l 內(nèi)壁拋光、鈍化的不銹鋼管l2. 規(guī)格l a.內(nèi)徑4.6或3.9mm，柱長1030cm, 510m填料, 柱效500010000/ml b.內(nèi)徑4.6或3.9mm，柱長510cm, 35 m填料l c. 內(nèi)徑0.52mm微填充柱l d. 內(nèi)徑3050 m的毛細(xì)管柱l利用氧化還原反應(yīng)的檢測器氧化、還原反應(yīng)l高效液相色譜的一種檢測器l屬于電化學(xué)一類l由數(shù)個多孔石墨電極串連組成l在

6、一次試驗(yàn)中，可同時提供多個氧化還原反應(yīng)電勢庫 侖 陣 列 電 池 示 意 圖 Channel 1Channel 2Channel 3Channel 4CounterReferenceFritOutletInlet12.012.513.013.514.014.515.00.000.501.001.502.00Retention time (minutes)Response (A)CHLOROGENIC ACID CATECHIN4HPAC VANILLIC ACID CAFFEIC ACID SYRINGIC ACID lChemStation (Agilent 1100)lEmpower (W

7、aters)lCLASS VP (Shimadzu)l杭州英譜lN-2000千譜lZD1（本研究所研制）l內(nèi)容：內(nèi)容：l固定相載體結(jié)構(gòu)l正相色譜固定相l(xiāng)鍵合相色譜固定相Particles of ColumnPackings50 mLarge PorousParticles30 mPellicularBeads3-10 mMicroparticulates2 m Active Surface正相 HPLC極性固定相有機(jī)流動相傳統(tǒng)目前硅膠氧化鋁氰基二醇基氨基吸附色譜鍵合相適用于:同分異構(gòu)體的分離.在有機(jī)/水流動相中不溶化合物的分離.適用于中等極性化合物分離.a.薄殼玻珠 b.無定性全多孔硅膠 c.

8、球形全多孔硅膠 d.堆積硅珠OSiOSiOSiOOHHOROHHOR 機(jī)理 H - 鍵固定相 硅膠 氧化鋁流動相有機(jī)溶劑 偶極矩small klarge ksaturated hydrocarbonsolefinsaromatic hydrocarbons, organic halidessulfidesethersnitro-compoundsesters, aldehydes, ketonesalcohols, aminessulfonesamidescarboxylic acids非極性sulfoxides極性被強(qiáng)烈吸附容易拖尾樣品被催化分解不易梯度洗脫含水量要控制正相色譜鍵合相OSiC

9、H3CyanoOSiCH2()nNH2CH2DiolAmineCNSiCHOHCHCHOOH22CH3(CH )2nSiCH3CH3SiSiCH3CH3l為了解決固定液的流失問題，將固定液通過化學(xué)反應(yīng)共價鍵合到硅膠（載體）表面的游離羥基上，生成化學(xué)鍵合固定相。l鍵合固定相對各種溶劑都有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，柱效高，使用壽命長，重現(xiàn)性好，可用于梯度洗脫。l鍵合固定相已取代傳統(tǒng)的液液分配色譜，成為HPLC中主要的固定相。Typical ColumnSiSiSiSiSiPacking SupportsChemically ModifiedSilica GelOHSiOSiOHOOSiOHOSi

10、OOSiOHPoresSilica GelSurface3CHCH3Si - O - Si - (CH2)17CH3鍵合固定相的“刷子”結(jié)構(gòu)鍵合相柱優(yōu)點(diǎn)固定相不易被流動相洗脫使用極性范圍寬無需飽和色譜柱非常容易進(jìn)行梯度洗脫柱子平衡非?？爝x擇性唯一柱容量大溶質(zhì)不易污染柱子lSiOC型lSiC型或SiN型lSiOSiC型lSiOH ROH SiOR H2Ol此類固定相柱效高，易水解、醇解，熱穩(wěn)定性差，只能用弱極性流動相用于分離極性化合物。 lSiOH SO2Cl2 SiCl（氯化硅膠）lSiCl RMgBr SiR （R=苯基或烷基）lSiCl NH2CH2CH2NH2 SiNHCH2CH2NH2

11、X 代表Cl、OH、OCH3、 OC2H5等，R 代表C8H17、C10H21、 C18H37、(CH2)nCN、 (CH2)nNH2、CH2OH、 CHOHCH2OH等此類固定相是目前最常用的鍵合固定相。l1. 表面覆蓋量（硅膠表面含碳量） 250(一般約為10）l2. 表面覆蓋率（單位表面上鍵合的有機(jī)官能團(tuán)的量與可反應(yīng)的硅羥基的量之比）l1. 表面覆蓋率越大，保留越強(qiáng)l2. 硅膠表面殘留硅羥基產(chǎn)生吸附作用，引起譜峰的拖尾和不對稱。l3. 氫鍵力順序：胺基氰基芳硝基二醇基醚基l4. 胺基柱具強(qiáng)極性，在酸性水溶液中作為弱陰離子交換劑，用于分離酚、羧酸、核苷酸；作為反相固定相可用于單糖、雙糖、多

12、糖的分離。不能用于分離羰基化合物。l5. 氰基柱為質(zhì)子受體，中等極性，分離選擇性與硅膠類似，對酸性、堿性樣品可獲得對稱的色譜峰。l6. 芳硝基柱呈弱極性，對芳香族化合物和多環(huán)芳烴有良好的分離能力。l7. 二醇基鍵合相呈弱極性，可用于分離有機(jī)酸及其齊聚物，還可作為分離蛋白質(zhì)的凝膠過濾色譜固定相。l8. 醚基鍵合相也呈弱極性，可分離能形成氫鍵的化合物，如酚類、硝基化合物，也可作為凝膠過濾色譜固定相。l1. 穩(wěn)定性la.表面覆蓋率越高越穩(wěn)定lb.反相鍵合相穩(wěn)定性高于正相鍵合相l(xiāng)c.與流動相pH有關(guān)，通常應(yīng)保持在28之間l2. 重現(xiàn)性l不同廠家，不同批號產(chǎn)品分離特性不同l3. 選擇性l同一種鍵合固定相

13、，用兩種極性參數(shù)相近的流動相時，分離結(jié)果會相差很大。如在ODS柱上分離山梨酸和苯甲酸，40甲醇水溶液作流動相時無法分離，而用32.5%四氫呋喃水溶液能完全分離。l4. 再生la.對正相柱，可用1:1甲醇氯仿沖洗lb.對反相柱，用甲醇再生，若效果不好，可用丙酮、二甲基甲酰胺或0.01mol/L無機(jī)酸進(jìn)行再生。色譜柱保護(hù)色譜柱保護(hù) 過濾所有的溶劑和樣品過濾所有的溶劑和樣品 使用保護(hù)柱使用保護(hù)柱 儀器在使用完畢，要沖洗整個系統(tǒng)，移走系統(tǒng)中緩沖液儀器在使用完畢，要沖洗整個系統(tǒng)，移走系統(tǒng)中緩沖液 柱子在不使用時，兩端密封保存柱子在不使用時，兩端密封保存 在適當(dāng)?shù)娜軇┲斜４嬷釉谶m當(dāng)?shù)娜軇┲斜４嬷?注意

14、色譜柱的注意色譜柱的pH值使用范圍值使用范圍 不要高壓沖洗柱子不要高壓沖洗柱子 不要高溫下過長時間使用硅膠鍵合相不要高溫下過長時間使用硅膠鍵合相操作條件操作條件流動相對色譜柱壽命的影響H111111R2R2R2普通鍵合普通鍵合StableBond穩(wěn)定鍵合穩(wěn)定鍵合低低 pH (1-3) - 由于酸催化水解導(dǎo)致鍵合相的流失由于酸催化水解導(dǎo)致鍵合相的流失*H3O+* 易水解的硅氧鍵易水解的硅氧鍵COLUMN VOLUMES1008060402000100020003000400050006000%k REMAINING操作條件操作條件流動相對色譜柱壽命的影響鍵合相水解速度隨溫度的升高而加大鍵合相水解

15、速度隨溫度的升高而加大StableBond CN (二異丙基苯基二異丙基苯基 CN)普通鍵合普通鍵合 CN (二甲基丙基二甲基丙基CN)低低pH 的淋洗液的淋洗液 高溫高溫(60C)操作條件操作條件流動相對色譜柱壽命的影響H普通鍵合普通鍵合Eclipse XDB (Extra Densely Bonded超高密度鍵合超高密度鍵合)高高 pH (7-14) - 硅膠溶解硅膠溶解pH 升高升高溫度升高溫度升高磷酸鹽磷酸鹽 硼酸鹽硼酸鹽 有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑色譜柱的良好使用規(guī)范色譜柱的良好使用規(guī)范l使用新鮮的水溶液,要注意使用生物穩(wěn)定劑,如疊氮化鈉l儲存色譜柱時,要將緩沖液沖洗干凈,并保存在適合的溶劑中

16、,如乙腈l避免操作不當(dāng)損壞色譜柱,如:猛敲,跌落或過緊擰接頭l運(yùn)輸中變干了的色譜柱要完全浸濕l如果樣品中含有無需考慮而保留強(qiáng)的組分時,必須進(jìn)行前處理l定期用強(qiáng)極性溶劑沖洗色譜柱l 清楚了解色譜柱填料適用的:l了解樣品溶劑對溶解度及分離的影響l pH范圍，溫度，化學(xué)適應(yīng)性l 溶劑使用前必須過濾預(yù)柱和保護(hù)柱預(yù)柱和保護(hù)柱由泵輸送的流動相預(yù)柱進(jìn)樣器保護(hù)柱分析柱至檢測器預(yù)柱凈化流動相HP Part No.: 79916KT-102保護(hù)柱凈化樣品截留或濃縮柱Authoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) H卡卡套柱：帶可重復(fù)使用

17、的末端套柱：帶可重復(fù)使用的末端接頭和一體化的保護(hù)柱柱芯接頭和一體化的保護(hù)柱柱芯無保護(hù)卡套柱芯無保護(hù)卡套柱芯有保護(hù)卡套柱芯有保護(hù)卡套柱芯帶帶Techtron 卡套柱芯的卡套柱芯的Zorbax 保護(hù)柱保護(hù)柱Techtron 柱芯柱芯含一體化的濾芯含一體化的濾芯min5101520253035mAU140142.5145147.5150152.5155157.5160min5101520253035mAU140142.5145147.5150152.5155157.5160BDS ODS Hypersil 250 - 2 mm with integrated Guard ColumnBDS ODS

18、Hypersil 250 - 2 mm without Guard Column2 mm 內(nèi)徑卡套柱有和無保護(hù)柱的比較內(nèi)徑卡套柱有和無保護(hù)柱的比較l在色譜柱安裝前、后測試壓力差l如果柱兩端的反壓很高，反接色譜柱，再用10-20倍柱體積的流動相沖洗柱體后，再測試壓力差l如果出現(xiàn)沉淀， (如：蛋白質(zhì)凝聚，細(xì)胞物，聚合物)設(shè)法用相應(yīng)的可溶性溶劑，如0.1% TFA / 80% 乙腈, 6M 鹽酸胍, THF等清洗以除去堵塞物l若仍無效，應(yīng)考慮更換過濾片色譜柱的修復(fù)和再生色譜柱的修復(fù)和再生-物理性阻塞柱進(jìn)樣口柱進(jìn)樣口濾片濾片密封墊圈密封墊圈柱體柱體Female End FittingMale End

19、Fitting操作注意事項(xiàng)：操作注意事項(xiàng)：l帶手套帶手套l填料不能變干填料不能變干l不要接觸色譜柱體不要接觸色譜柱體 l加熱填料會被擠出加熱填料會被擠出l不要擰得過緊不要擰得過緊色譜柱故障診斷色譜柱故障診斷更換進(jìn)樣口濾芯更換進(jìn)樣口濾芯由于鍵合相水解或硅膠溶解而造成的色譜柱填料變化是不可逆的l 由于污染而產(chǎn)生的色譜柱變化可以通過適當(dāng)?shù)南辞迨怪迯?fù)l 梯度洗脫的方式 (水 - 強(qiáng)有機(jī)溶劑) 通常最有效l 低 pH 流動相, 如 0.1% TFA 或 0.01M H3PO4, 也是有效的l 適當(dāng)升高溫度也有幫助 (60-80C)色譜柱的修復(fù)和再生色譜柱的修復(fù)和再生-化學(xué)變化-Il某些溶液，如6M鹽酸

20、胍、異硫氰酸胍、尿素可用于清除蛋白質(zhì)的沉積l某些填料 (XDB, 有機(jī)聚合物)，可使用高pH 水/有機(jī)溶液，如：0.01M NaOH溶于50%異丙醇/水溶液。 硅膠基質(zhì)應(yīng)盡量減少接觸時間 (15-30 min)。色譜柱的修復(fù)和再生色譜柱的修復(fù)和再生-化學(xué)變化-II例子：4.6 mm ID x 15 cm Zorbax 300SB-C18流速: 1 mL / min; 溫度: 80CA: 0.1% TFA 水溶液 B: 0.1% TFA 乙腈溶液100% A for 30 min.; 0-100% B over 30 min.; Hold 100% B for 30 min., Return t

21、o 100% A in 5 min.重復(fù)3次 如果事先適當(dāng)注意，大部分液相色譜柱的問題是可以預(yù)防的如果事先適當(dāng)注意，大部分液相色譜柱的問題是可以預(yù)防的- 流動相必須是互溶、無顆粒的流動相必須是互溶、無顆粒的- 使用保護(hù)柱和在線過濾器，并定期更換使用保護(hù)柱和在線過濾器，并定期更換- 采用恰當(dāng)?shù)臉悠分苽溥^程采用恰當(dāng)?shù)臉悠分苽溥^程- 采取恰當(dāng)?shù)纳V柱清洗步驟采取恰當(dāng)?shù)纳V柱清洗步驟- 不同的操作條件選用不同的色譜柱不同的操作條件選用不同的色譜柱 (e.g. SB: pH 1-6, XDB: pH 3-11，Extend:2-12)- 保存柱反壓和其他重要色譜參數(shù)的記錄，即保存柱反壓和其他重要色譜參數(shù)

22、的記錄，即 (e.g. R, N, As, k)- 色譜柱保存時必須充滿有機(jī)溶劑，如乙腈色譜柱保存時必須充滿有機(jī)溶劑，如乙腈l要求l參數(shù)l正相色譜流動相選擇l反相色譜流動相選擇l與固定相不互溶l與檢測器相匹配l對樣品有足夠的溶解能力l粘度小，沸點(diǎn)低l純度高l毒性低1.溶劑強(qiáng)度參數(shù)。 根據(jù)Snyder的定義， 。為該溶劑分子在單位吸附劑表面上的吸附能。 。越大，表示該溶劑洗脫能力越強(qiáng)。一些純?nèi)軇┑?。值己?0.00 乙酸乙酯 0.38異辛烷 0.01 二噁烷 0.49四氯化碳 0.11 乙腈 0.50氯仿 0.26 異丙醇 0.63二氯甲烷 0.32 甲醇 0.73四氫呋喃 0.35 水 20.73乙醚 0.38 乙酸 20.73_ 2.極性參數(shù)P P是溶劑與乙醇、二氧六環(huán)、硝基甲烷等極性溶質(zhì)作用的綜合量度。 混合溶劑的P： PViPi3.溶劑的選擇性參數(shù)Xe、Xd、Xn 分別表示溶劑接受質(zhì)子、給予質(zhì)子和偶極作用的能力。溶劑PXeXdXn溶劑PXeXdX