DNA的酶切與連接二

1、實(shí)驗(yàn)八 DNA的酶切與連接 （二）2017-5-24實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 掌握DNA連接酶的一般性質(zhì) 和作用機(jī)制。 2. 掌握DNA連接體系的建立以及連接樣品的檢測(cè)。 實(shí)驗(yàn)原理連接 核酸片段可以通過(guò)連接酶的作用連接起來(lái)而獲得重組分子 。 D N A 連 接 酶 催 化 雙 鏈DNA分子中相鄰堿基的5 P 末 端 與 3 - O H 間 形 成3,5-磷酸二酯鍵。 一個(gè)DNA片段的5-P末端與另一個(gè)3-OH末端相互靠近時(shí)，在DNA連接酶的作用下，有Mg2+，ATP存在的緩沖系統(tǒng)中可以被連接起來(lái)而形成重組子。實(shí)驗(yàn)原理連接連接反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題1.DNA連接酶 常用的DNA連接酶有兩種（二者作用機(jī)理

2、類似）： 來(lái)自大腸桿菌的DNA連接酶 來(lái)自噬菌體的T4 DNA連接酶（最常用）T4連接酶的活性用Weiss單位表示，Weiss單位是指在37 下20min內(nèi)催化1mol32P從焦磷酸根置換到,-32PATP所需的酶量。連接反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題2. 連接反應(yīng)的溫度 DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為37 。 但在此溫度下， 粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折中辦法是12過(guò)夜。連接反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題3. DNA的平末端和粘性末端 由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平末端和粘性末端，因而連接反應(yīng)中就有平末端連接和粘性末端連接。二者連接效率不同。 粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有差異的。連接

3、反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題4. 連接反應(yīng)的檢測(cè) 連接反應(yīng)成功與否，最后的檢測(cè)要通過(guò)下一步實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化宿主菌，陽(yáng)性克隆的篩選來(lái)確定。實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細(xì)胞：經(jīng)過(guò)CaCl2溶液處理的E.coli細(xì)胞對(duì)外源DNA的吸收變得非常敏感，其細(xì)胞內(nèi)的酶限制-修飾系統(tǒng)被抑制，有利于外源基因的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和繁殖，這種細(xì)胞被稱作感受態(tài)細(xì)胞。 轉(zhuǎn)化：感受態(tài)細(xì)胞吸收外源DNA的過(guò)程。 熱激：將DNA與宿主細(xì)胞混合后，將宿主細(xì)胞放入42度溫水中保溫1.5分鐘以增加轉(zhuǎn)化效率的過(guò)程。DNA克隆的簡(jiǎn)單流程基因組DNA、PCR產(chǎn)物（片段）質(zhì)粒DNA（載體）限制性酶切（修飾DNA末端）連接載體與片段轉(zhuǎn)化（將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞）分析

4、重組子實(shí)驗(yàn)試劑 1. 純化后的酶切質(zhì)粒載體和目的基因。 2. 10 x T4DNA連接酶buffer 3. T4 DNA 連接酶實(shí)驗(yàn)方法DNA分子的體外連接 在無(wú)菌離心管中加入一下溶液 混勻后，置于調(diào)好溫度12-14度的PCR儀過(guò)夜。成分體積加入量DNA片段11.5 ul100 ng質(zhì)粒1 ul10 ngT4 連接緩沖液1.5 ulT4連接酶1 ul思考題 1. 連接反應(yīng)中應(yīng)注意些什么問(wèn)題及如何提高連接效率？ 2. 簡(jiǎn)述一個(gè)完整外源DNA的克隆過(guò)程。 3. 簡(jiǎn)述T4 DNA 連接酶的作用機(jī)理。連接反應(yīng)中值得注意的幾個(gè)問(wèn)題4. 連接反應(yīng)的檢測(cè) 連接反應(yīng)成功與否，最后的檢測(cè)要通過(guò)下一步實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)化宿主菌，陽(yáng)性克隆的篩選來(lái)確定。實(shí)驗(yàn)試劑 1. 純化后的酶切質(zhì)粒載體和目的基因。 2. 10 x T4DNA連接酶buffer 3. T4 DNA 連接酶實(shí)驗(yàn)方法DNA分子的體外連接 在無(wú)菌離心管中加入一下溶液 混勻后，置于調(diào)好溫度12-1