細(xì)胞工程考試

1、1.體外細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)類(lèi)型 按生長(zhǎng)方式:2型 粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。 絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類(lèi)型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)2,根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要2類(lèi)： 上皮細(xì)胞型 1)生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連成片，相靠緊密相連成薄層鋪石狀，生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng) 成纖維細(xì)胞型2) 生長(zhǎng)特點(diǎn)，排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起3懸浮生長(zhǎng)型概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)

2、或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)來(lái)源：自血，脾或骨髓， 尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞也可能特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)：（生長(zhǎng)機(jī)制） ：（一）貼附（二）接觸抑制（三）密度抑制4: 原代培養(yǎng)(Primary Culture)期也稱(chēng)初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。特點(diǎn)：細(xì)胞呈活躍移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。5： 傳代：體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)

3、細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過(guò)程叫傳代。初代培養(yǎng)的細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱(chēng)做細(xì)胞系（Cell Line）。特點(diǎn)：在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型6: 天然培養(yǎng)基：n 天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。n 優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好n 缺點(diǎn)：來(lái)源受限。n 成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。n 易發(fā)生支原體污染 （1）n 血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。n 常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血

4、清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。n 優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。n 血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56 ，30 分鐘n 血清的消毒：過(guò)濾除菌7: 添加小牛血清的作用提供生長(zhǎng)因子和激素提供貼附因子和伸展因子提供結(jié)合蛋白提供必需脂肪酸和微量元素8: 細(xì)胞融合:指兩個(gè)或兩個(gè)以上的相同或不同的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。細(xì)胞融合過(guò)程可分成兩個(gè)階段異核體階段(heterokaryon)：異核體是指在融合細(xì)胞內(nèi)含有來(lái)自兩個(gè)親本的細(xì)胞核。異核體中細(xì)胞核尚未融合，雜種細(xì)胞形成：當(dāng)異核體同步進(jìn)入有絲分裂后，核膜崩潰，來(lái)自兩個(gè)細(xì)胞核的染色體結(jié)合在一起。融合細(xì)胞內(nèi)只含有一個(gè)

5、細(xì)胞核，是由來(lái)自兩個(gè)親本細(xì)胞的基因組組合在一起所形成的。此時(shí)的細(xì)胞就稱(chēng)為雜種細(xì)胞。 9: PEG 的作用1、PEG可能使細(xì)胞膜（尤其是有絲分裂的骨髓瘤細(xì)胞）的脂類(lèi)分子的物理結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，容易被PEG作用打開(kāi)細(xì)胞膜，使細(xì)胞融合。 2、PEG可能會(huì)把細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子排開(kāi)，使脂質(zhì)體扦入與膜結(jié)合。 3、PEG可能作用于膜磷脂極性基團(tuán)和細(xì)胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面電位下降，同時(shí)使膜糖蛋白的排阻體積減少，最終使膜出現(xiàn)缺口，進(jìn)而融合。10” 顯著污染的標(biāo)志：培養(yǎng)基pH值的迅速改變、細(xì)胞外形模糊、甚至出現(xiàn)漂浮的集落。n 污染通常表明操作者技術(shù)的失誤或設(shè)備及用具上出了毛病。n 組織出現(xiàn)污染，可加青霉素20

6、0U/mL、鏈霉素200U/mL、和制霉素100U/mL?？敲顾兀?00U/mL）是支原體藥物，可抑制其感染，單不能根除。11: 細(xì)胞融合過(guò)程可分為：1 凝集：細(xì)胞凝集與細(xì)胞膜的糖蛋白有關(guān)2 蛋白質(zhì)分子重新分布：是細(xì)胞融合的必要前提3 脂質(zhì)分子重排：是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞融合的關(guān)鍵4 胞質(zhì)合并：后續(xù)的穩(wěn)定步驟。12: 凍存條件不當(dāng)造成對(duì)細(xì)胞的破壞的原因？低溫細(xì)胞內(nèi)形成冰晶細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)濃度升高細(xì)胞脫水細(xì)胞失活13: 飼養(yǎng)細(xì)胞(Feed Cell，F(xiàn)c)：在細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞多半不易成活，通常必須加入適量的其他活細(xì)胞才能使之繁殖，這種被加入的活細(xì)胞，被稱(chēng)作飼養(yǎng)細(xì)胞。14” 飼養(yǎng)細(xì)胞的作用提高培

7、養(yǎng)細(xì)胞的密度，使待克隆細(xì)胞容易生存與繁殖。腹腔細(xì)胞能清除培養(yǎng)中的死亡細(xì)胞，從而促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)。飼養(yǎng)細(xì)胞能釋放諸如細(xì)胞生長(zhǎng)因子類(lèi)物質(zhì)，起到促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖的作用。15; 1選擇骨髓瘤細(xì)胞理想的雜交瘤細(xì)胞系具有下列特征：能在體外連續(xù)生長(zhǎng)，倍增期短于24小時(shí)；缺乏HGPRT酶；克隆效應(yīng)高；在動(dòng)物中有致腫瘤性；與小鼠淋巴細(xì)胞融合率相當(dāng)高；本身不合成Ig，且不抑制雜交瘤細(xì)胞中的Ig合成基因。16: 及時(shí)判斷陽(yáng)性孔也是一項(xiàng)重要的工作，可起減少工作量和保證重點(diǎn)雜交細(xì)胞雙重作用，待集落生長(zhǎng)到96孔板孔1/3左右，24孔板1/5左右，就要及時(shí)測(cè)定各孔上清中是否會(huì)有特異性抗體，一旦發(fā)現(xiàn)抗體陽(yáng)性孔，就應(yīng)立

8、即擴(kuò)大培養(yǎng)，再凍存和克隆化，以免被其他細(xì)胞生長(zhǎng)所壓抑或意外丟失。17: 融合后經(jīng)HAT選擇有細(xì)胞克隆出現(xiàn)，但不能篩選出產(chǎn)生特異抗體的雜交瘤，常見(jiàn)原因是： 抗體檢測(cè)法不夠敏感 HAT選擇失敗 染色體丟失和克隆競(jìng)爭(zhēng) 動(dòng)物免疫不成功18: 因HAT選擇失敗長(zhǎng)生的細(xì)胞是骨髓瘤細(xì)胞，不是雜交瘤細(xì)胞。其原因是： 1、骨髓瘤細(xì)胞系發(fā)生回復(fù)突變，由HGPRT變?yōu)镠GPRT，不再對(duì)氨基喋呤(A)敏感為避免回復(fù)突變，骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)定期通過(guò)8AG傳代。 2、氨基喋呤對(duì)光敏感，保存不當(dāng)便會(huì)失效。19: 不出現(xiàn)雜交瘤的原因分析：用于雜交的免疫小鼠與骨髓細(xì)胞在親緣關(guān)系上不一致或者有距離或由于其中一方發(fā)生變異；骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

9、狀況不好；小牛血清的質(zhì)量有問(wèn)題，或者A濃度太高或HT失效。PEG濃度差錯(cuò)或毒性太大。配制培養(yǎng)基的蒸餾水出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題，或培養(yǎng)板或其他用具不潔凈而影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。不易發(fā)觀的支原體污染也是常見(jiàn)因素之一最后的就是各人的操作技能而引起的最主要是加入PEG前后，如何使細(xì)胞懸浮的技術(shù)與經(jīng)驗(yàn)。原96孔板內(nèi)的陽(yáng)性雜交瘤呈衰老形態(tài)或培養(yǎng)液太酸，轉(zhuǎn)種后就會(huì)死亡。20: 看護(hù)培養(yǎng)定義：用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織來(lái)看護(hù)單個(gè)細(xì)胞使其持續(xù)分裂和增殖的一種單細(xì)胞培養(yǎng)方法優(yōu)點(diǎn)（1）效果好，易于成功。（2）簡(jiǎn)便易行。缺點(diǎn):（3）不能在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程。21: 細(xì) 胞 同 步 化細(xì)胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有

10、細(xì)胞都同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。 同一培養(yǎng)體系中，細(xì)胞不同步使懸浮細(xì)胞的分裂、代謝以及生理、生化狀態(tài)等更趨復(fù)雜化，所以人們一直希望通過(guò)一定的技術(shù)途徑，使同一培養(yǎng)體系中的細(xì)胞能保持相對(duì)一致的細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)狀態(tài)，工作中常用的處理方法：1、物理方法 1）體積選擇法：通過(guò)細(xì)胞體積大小分級(jí)，直接將處于相同周期的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中。2）冷處理法。低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度2、化學(xué)方法 1）饑餓法，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，若斷絕供應(yīng)一種細(xì)胞分裂所必需的營(yíng)養(yǎng)成分或激素，使細(xì)胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的饑餓之后，當(dāng)在培養(yǎng)基中重新加入這種限制因子時(shí)，靜

11、止細(xì)胞就會(huì)同步進(jìn)入分裂。2）抑制劑法，通過(guò)一些DNA 合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞停留在DNA 合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期的細(xì)胞。常用的抑制劑有5-氟脫氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羥基尿等。 3）有絲分裂阻抑，用秋水仙素處理指數(shù)生長(zhǎng)的懸浮培養(yǎng)物，濃度一般控制在0.2%，處理時(shí)間以4-6小時(shí)為宜22: 細(xì)胞生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)：延遲期（滯后期） 細(xì)胞很少分裂，其長(zhǎng)短與接種量大小和繼代時(shí)原種細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期有關(guān)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目增加，增長(zhǎng)速率保持不變直線生長(zhǎng)期 細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育最明顯的時(shí)期減緩期 生長(zhǎng)逐漸緩慢：培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質(zhì)增多，氧氣減少靜止期 生長(zhǎng)幾乎處

12、于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加極少，甚至開(kāi)始死亡。23: 討論: （1）滯后期的長(zhǎng)短主要取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞數(shù)量的多少。 （2）加入條件培養(yǎng)基可以縮短滯后期。 條件培養(yǎng)基：曾培養(yǎng)過(guò)一段時(shí)間組織或細(xì)胞的培養(yǎng)基。 （3）縮短兩次繼代時(shí)間間隔，則可使懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一直保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。 （4）如果使處在靜止期的細(xì)胞懸浮液保持時(shí)間太長(zhǎng)，則會(huì)引起細(xì)胞的大量死亡和解體。24: 植物細(xì)胞兩項(xiàng)培養(yǎng)技術(shù)(two-phase culture概念:指在植物細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機(jī)化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系形成上、下兩相，細(xì)胞在其中一相中生長(zhǎng)并合成次生代謝物，

13、這些次生代謝物又通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞结尫诺桨?，并被另一相所吸附。這樣由于產(chǎn)物的不斷釋放與回收，可以減少由于產(chǎn)物積累在胞內(nèi)形成的反饋抑制，有利于提高產(chǎn)物含量，并有可能真正實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)，從而大大降低生產(chǎn)成本。25: 所選用的吸附相一般應(yīng)滿足以下幾個(gè)條件: 1)吸附相對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生毒害作用，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響或影響甚微2）產(chǎn)物能較容易地被有機(jī)物吸附或溶解于有機(jī)相中3）兩相能比較容易地分離。4)所添加的吸附相能特異性地吸附某些次生代謝物，而不會(huì)吸附培養(yǎng)基的有效成分5)吸附相能耐高溫消毒，或能通過(guò)其他無(wú)菌方式加入培養(yǎng)體系中，并能重復(fù)使用26:干細(xì)胞有幾個(gè)主要特征Ø 干細(xì)胞本身

14、不是終末分化細(xì)胞；Ø 干細(xì)胞能無(wú)限增殖分裂；Ø 緩慢，具有自穩(wěn)性；Ø 干細(xì)胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于靜止 狀態(tài)；Ø 干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞只能有兩種命運(yùn)保持為干細(xì)胞 或分化為特定細(xì)胞。27: 二、干細(xì)胞的分類(lèi) 按分化潛能大小來(lái)分類(lèi):Ø 全能干細(xì)胞（ Totipotent stem cell ）： 它具有形成完整個(gè)體的分化潛能。如受精卵，胚胎干細(xì)胞。Ø 多能干細(xì)胞（ pluripotent stem cell ），具有分化出多種組 織細(xì)胞的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，發(fā)育潛能受到一定的限制。如骨髓多能造血干細(xì)胞是典

15、型的例子，它可分化出至少十二種血細(xì)胞 。Ø 單能干細(xì)胞（ multipotent stem cell ），這類(lèi)干細(xì)胞只能向一種類(lèi)型或密切相關(guān)的兩種類(lèi)型的細(xì)胞分化，如上皮組織 基底層干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞等。28: ES細(xì)胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面形成畸胎瘤形成類(lèi)胚體直系分化形成嵌合體29:早期胚胎獲取和處理的方法:提高ES細(xì)胞分離的方法處理： 1 緩著床：摘除卵巢或改變激素水平 2 分離胚囊內(nèi)細(xì)胞團(tuán)： 3 脫帶處理：胰酶或透明質(zhì)酸酶，或機(jī)械 方法處理掉透明帶 4 離散卵裂球30: 胚胎移植的基本原則n 胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性n A 供體和受體在分類(lèi)學(xué)上的相同屬性n B

16、動(dòng)物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時(shí)間上的同期性n C 動(dòng)物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性n 胚胎的發(fā)育期限：必須處于周期黃體期內(nèi)n 胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過(guò)程中不受不良因素的影響31: 精子的獲能過(guò)程是多時(shí)期、多步驟的復(fù)雜變化過(guò)程，包括兩個(gè)階段：第一階段是脫出精子表面的抗原物質(zhì)和去能因子（Decapacitation Factors，DF），增強(qiáng)了膜通透性。第二階段是精子細(xì)胞膜蛋白變化，即發(fā)生頂體反應(yīng)32: 體外受精：亦稱(chēng)試管動(dòng)物技術(shù)，是指把體外受精動(dòng)物的卵子和精子取出在試管內(nèi)混合，受精而形成胚胎的過(guò)程。在哺乳動(dòng)物，體外受精胚胎一般在體外發(fā)育到一定時(shí)期后移植到受體雌性

17、動(dòng)物輸卵管或子宮內(nèi)，妊娠到產(chǎn)仔。n 受精成功標(biāo)志：受精卵可以發(fā)育到囊胚期階段。n 提高成功的技術(shù)：A 透明帶技術(shù)B 透明帶下受精技術(shù)C 卵漿內(nèi)精子注射技術(shù)33: 超數(shù)排卵簡(jiǎn)稱(chēng)超排，是指通過(guò)給母畜注射適當(dāng)?shù)募に?，維持更多卵泡正常發(fā)育而排除更多卵子的過(guò)程34: 雌、雄核發(fā)育n 雌核發(fā)育（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細(xì)胞核發(fā)育成個(gè)體的生殖行為。同種或異種精子進(jìn)入卵內(nèi)只起刺激卵子發(fā)育的作用，不形成雄性原核和提供遺傳物質(zhì)，其子代的遺傳物質(zhì)完全來(lái)自雌核，只具有母本的性狀。n 雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過(guò)紫外線、X射線或射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性