總結(jié)報告-模板

1、專碩1班：鄧劍平學(xué)號：2111740137重組乙肝疫苗的開發(fā)目錄CONTENTS目的：開發(fā)治療乙型肝炎的新藥，獲得新藥臨床試驗批件，新藥證書.意義：乙肝 在全世界廣泛流行，給人類社會帶來沉重的健康和經(jīng)濟負擔，已成為主要的公共衛(wèi)生問題之一。接種乙肝疫苗已成為預(yù)防控制乙肝病毒 感染傳播最經(jīng)濟有效的措施。但由于血源性乙肝疫苗具有產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高、浪費血漿等特點，因此我國原衛(wèi)生部明確規(guī)定，從1998年6月30日起停止生產(chǎn)血源性乙肝疫苗，并于2000年停止使用，而采用基因重組乙肝疫苗。重組CHO細胞乙肝疫苗免疫保護效果優(yōu)于重組酵母疫苗，大劑量重組酵母乙肝疫苗持久性優(yōu)于小劑量。國內(nèi)外研究現(xiàn)狀： 目前普遍

2、推行的乙肝疫苗主要是由重組的釀酒酵母、漢遜酵母或中國倉鼠卵巢細胞表達的乙型肝炎病毒表面抗原添加到氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑中制備而成。全程免疫后，的免疫人群均可產(chǎn)生型體液免疫應(yīng)答，從而起到抗感染的保護作用。然而，它對于早期細胞免疫，阻斷病毒母嬰傳播并不能發(fā)揮有效作用，對于肝細胞內(nèi)寄生的，亦不能發(fā)揮細胞免疫作用，也不能有效清除病毒。現(xiàn)行乙肝疫苗全程免疫一般需要多次注射， 不斷加強免疫效果， 才能誘發(fā)機體產(chǎn)生長效的免疫應(yīng)答。 近年來，接種乙肝疫苗的不良反應(yīng)在國內(nèi)外已經(jīng)引起廣泛關(guān)注，且不良反應(yīng)范圍甚廣，如可以引起過敏性休克，一旦發(fā)生后果很嚴重。影響疫苗免疫效果的因素主要抗原純度、使用的佐劑、滅活方法和貯存

3、條件等。提高乙肝疫苗的免疫原性，增強各人群對疫苗的應(yīng)答水平，簡化免疫程序，改變給藥方式，既能發(fā)揮免疫預(yù)防作用，又可以有效清除病毒并達到治療效果，是有效遏制乙型肝炎的發(fā)展趨勢乙肝疫苗的結(jié)構(gòu)特點：HBV DNA的兩鏈長短不一，長鏈（L）完整，為負鏈，長度恒定，約3200個核苷酸。短鏈（S）為正鏈，長度可變，約為長鏈長度的50100%，鏈的增生按5-3順序進行。在不同分子中短鏈3端的位置是可變的，而短鏈和長鏈的5端位置固定點為粘性末端，通過250300個核苷酸堿基配對，以維持DNA分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在粘性末端兩側(cè)，兩鏈5端各有一個由11個bp組成的直接重復(fù)序列 (Direct repeat DR)-5

4、TTCACCTCTCC，該DR位于第1824個核苷酸者稱DR1，位于第1590個核苷酸者稱DR2，在病毒復(fù)制中起作用。常見的HBV病毒基因變異（1）S基因區(qū)變異：S基因區(qū)包括前S1、 前S2 及S基因， 分別編碼前S1 蛋白、 前S2 蛋白及主蛋白。（2）前C/C基因變異： C1896 位(A83)的變異是HBV中最常見的變異。（3）P基因區(qū)變異：P基因區(qū)編碼HBV DNA聚合酶(DNAP)，其自然突變率與逆轉(zhuǎn)錄病毒gag基因相近。 （4）X基因變異：X基因是病毒復(fù)制的重要調(diào)節(jié)區(qū)， 是轉(zhuǎn)錄、 反轉(zhuǎn)錄和正鏈合成的起點， 也是多種細胞因子結(jié)合點， 此區(qū)變異影響到病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。目前專利情況（來源

5、于藥渡網(wǎng)）目前國內(nèi)外對乙肝疫苗的開發(fā)比較成熟，全球有31個已經(jīng)批準上市，有14個處于臨床試驗，專利申請數(shù)量有22個，中國CED注冊與受理的有133個公司機構(gòu)，以國內(nèi)本土企業(yè)居多。乙肝疫苗的生產(chǎn)過程Step 1.目的基因的獲得:在NCBI網(wǎng)站上搜索HBsAg的基因序列,用Primer3 (v. 0.4.0)軟件在線設(shè)計引物,然后進行PCR. 引物如下:上游：5- cctgcacgactactgctcaa-3下游：5-gcccactcccataggaattt-3PCR擴增合成基因 變性：92 ，1min 退火：55 ，1min 延伸：72，2min 30個循環(huán)。 延伸：72 ,4min 產(chǎn)物經(jīng)電泳

6、后割膠回收171bpDNA片段。Step 2 . HBsAg重組子的構(gòu)建及篩選用EcoRI 和 Nhe I雙酶切擴增出來的DNA片段及p CIneo質(zhì)粒，用DNA連接酶連接切割產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌（DH5）感受態(tài)細胞。在涂布有氨芐青霉素的平板上進行陽性篩選。Step 3. HBsAg的表達及鑒定 采用PCR法和酶切法進行鑒定。PCR法：以表達載體為模板，利用引物進行PCR擴增，觀察擴增出的基因片段是否與預(yù)期相符。酶切法：用 Asu和 Xba I 雙酶切達載體，觀察片段大小是否符合預(yù)計大小。生產(chǎn)工藝與質(zhì)量控制體系的建立 1、細胞庫（菌種）：（大腸桿菌、目的基因（HBsAg）、載體（p C

7、Ineo質(zhì)粒）、雜菌、病毒、致病基因的質(zhì)量控制）在同一實驗工作區(qū)不得同時操作兩種不同菌種， 同一工作人員不得同時操作兩種不同細胞。 細胞染色標記方法測細胞活性，這才能真實反映生產(chǎn)的藥物效價MTT 3H-Thymidine 流式細胞儀 （測細胞周期、凋亡）2、發(fā)酵工藝及分離純化工藝（中間體）：表達水平、 總產(chǎn)量的測定 （1）有限代次生產(chǎn)控制：對培養(yǎng)和誘導(dǎo)基因產(chǎn)物的材料有詳盡的資料，培養(yǎng)過程及收獲時，有靈敏的檢測措施。在生產(chǎn)周期結(jié)束時，做質(zhì)?？截悢?shù)、大腸桿菌表達載體存留的程度、含插入基因的載體的酶切圖譜。 （2）純化工藝過程的控制：盡量除去污染病毒、核酸、宿主細胞、雜蛋白等及純化過程帶來的有害物質(zhì)

8、。這些可以利用凝膠、離子交換等層析方法來進行除雜。 3、最終產(chǎn)品的控制 對產(chǎn)品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等的試驗方法，檢測項目與純度要求要根據(jù)純化工藝過程、產(chǎn)品理化性質(zhì)和用途等來確定。 （1）物理化學(xué)鑒定：包括氨基酸成分分析、部分氨基酸序列分析、肽圖分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳及等電聚焦、高效液相色譜、殘余細胞DNA測定、其他外源性物質(zhì)測定 （2）生物學(xué)測定：包括鑒別試驗、效價測定、熱原質(zhì)試驗、病毒污染檢查、無菌試驗、抗原物質(zhì)檢查、毒性試驗臨床前藥理學(xué)研究和安全性評價1、建立HBV實驗?zāi)Ｐ?可利用小鼠來制造病理模型2、藥理研究：（1）主要藥效學(xué)研究：將實驗小鼠分成兩組：空白對照組（不注射乙肝疫苗）

9、和實驗組（注射乙肝疫苗），分布不同給藥劑量，通過觀察治療效果。（2）一般藥理學(xué)研究對神經(jīng)系統(tǒng)影響：觀察受試小鼠的行為變化，檢測其神經(jīng)中樞興奮或抑制狀態(tài)；對心血管系統(tǒng)影響：測定受試小鼠血壓、心電圖、心率和心律變化對呼吸系統(tǒng)影響：測定受試小鼠呼吸頻率和深度3、毒理研究包括： 3.1單次給藥毒性試驗：試驗時間一般12周，檢測指標包括體重、籠旁觀察、大體解剖檢查等。可以得到關(guān)于全身和/或局部毒性的劑量-效應(yīng)關(guān)系數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可用于選擇重復(fù)給藥毒性試驗的劑量。3.2重復(fù)給藥毒性試驗: 試驗的持續(xù)時間應(yīng)基于臨床的接受劑量和適應(yīng)癥，乙肝疫苗注射時間為1-3個月。檢測指標包括急毒試驗中常規(guī)的項目, 還有特殊檢

10、測項目的如眼底鏡檢查、心電圖描記、體溫、血壓等。 3.3安全性藥理試驗:安全性藥理試驗的目的是觀察任何對主要生理系統(tǒng)功能 (如心血管、呼吸、腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng))可能的影響。安全性藥理試驗評價藥物潛在毒性的功能指數(shù)，這些功能指數(shù)可以通過單獨的試驗觀察，也可結(jié)合在單次和多次給藥毒性試驗中進行。考慮到可能有免疫復(fù)合物的產(chǎn)生，包括對腎臟的檢查（尿液分析和腎臟電鏡檢查）3.4生殖和發(fā)育毒性試驗:小鼠（生育力、胚胎-胎兒 、圍產(chǎn)期毒性試驗）3.5致癌性實驗：未進行3.6免疫毒性試驗：在重復(fù)給藥毒性實驗時，進行血液學(xué)檢查、關(guān)于免疫器官詳細的組織病理學(xué)檢查以及稱量淋巴器官的重量等，必要時增加免疫功能的測定指標

11、。（只有毒性研究結(jié)果表明有必要時，才進行另外的免疫毒性評價）3.7遺傳毒性試驗：由于生物技術(shù)藥物及其降解產(chǎn)物很難與DNA或其它染色體物質(zhì)發(fā)生直接作用，因此研發(fā)者通常不需要進行常規(guī)的遺傳毒性試驗。3.8局部耐受性試驗：致癌潛力的篩查。注射部位的炎癥反應(yīng)提示刺激反應(yīng)，但應(yīng)認識到簡單的注射創(chuàng)傷和/或配方中載體引起的特殊毒性效應(yīng)可能也會導(dǎo)致注射部位的毒性變化。臨床研究：I期臨床試驗：初步的臨床藥理學(xué)及人體安全性評價試驗。以觀察人體對于新藥的耐受程度和藥代動力學(xué)，為制定給藥方案提供依據(jù)。II期臨床試驗：隨機盲法對照臨床試驗，治療作用初步評價階段。初步評價藥物對目標適應(yīng)癥患者的治療作用和安全性；為III期臨床試驗研究設(shè)計和給藥劑量方案的確定提供依據(jù)。III期臨床試驗：治療