擬南芥基因克隆的策略與途徑

1、擬南芥基因克隆的策略與途徑擬南芥(Arabidopsis thaliana)是一種模式植物，具有基因組小(125 Mbp)、生長周期短等特點(diǎn)，而且基因組測序已經(jīng)完成(The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000)。同時，擬南芥屬十字花科(Cruciferae )，具有高等植物的一般特點(diǎn)，擬南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括農(nóng)作物的研究，產(chǎn)生重大的經(jīng)濟(jì)效益，特別是十字 花科中還有許多重要的經(jīng)濟(jì)作物，與人類的生產(chǎn)生活密切相關(guān)，因此目前擬南芥的研究越來越多地受到國際植物學(xué)及各 國政府的重視?；?gene)是遺傳物質(zhì)的最基本單位，也是所有生命活動的基礎(chǔ)

2、。不論要揭示某個基因的功能，還是要改變某個基因的功能,都必須首先將所要研究的基因克隆出來。特定基因的克隆是整個基因工程或分子生物學(xué)的起點(diǎn)。本文就基因克隆的 幾種常用方法介紹如下。1、圖位克隆Map-based cloning, also known as positionalcloning, first proposed by Alan Coulsonof the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relat

3、ively stable loci, in the use of genetic lin kage an alysis or chromosomal abno rmalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific locati on, By con struct ing high-de nsity molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narro

4、w the can didate regi on and the n clone the gene and to clarify its function and biochemical mecha ni sms.圖位克隆(map-based clonig )又稱定位克隆(positoinal cloning)， 1986年首先由劍橋大學(xué)的Alan Coulson提出。用該方法分離基因是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn) 定的基因座，在利用分離群體的遺傳連鎖分析或染色體異常將基因佇到染色體的1個具體位置的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建高密度的分子連鎖圖，找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，不斷縮小候選區(qū)域進(jìn)而

5、克隆該基因，并闡明其功能和生化機(jī)制。用該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行的，無需預(yù)先知道基因的DNA序列，也無需預(yù)先知道其表達(dá)產(chǎn)物的有關(guān)信息。它是通過分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來確定突變表型的遺傳基礎(chǔ)。近幾年來隨著擬南芥基因組測序工作的完成，各種分子標(biāo)記的日趨豐富和各種數(shù)據(jù)庫的完善，在擬南芥中克隆一個基因所需要的努力已經(jīng)大大減少了 (圖 1)。995Totni3 To b tpe-nson2002TQtaiw； I person-yearDurtdm-ap(YACh UTO'NAfCM*匚Me endLh«n- Lf0- newp- Etet|u

6、71;inc Ingm incdorwnQ process9aiHlh!RrU rlwHwuluirmap 尊再kf l.ClihOii們科rbw 仙 eifrorri COM) MhOUe-lWMOafthQn PCIl pd<rnin<-B 1 rorn OoinO, ifTen目前完成整個擬南芥的圖位克隆過程大約需要一年時間。在這個過程中，我們從篩選突變體開始，逐漸找到和表型相關(guān)的基因。這和反向遺傳學(xué)（ reverse genetics ）的方法正好 相反。圖位克隆能實(shí)現(xiàn)，關(guān)鍵在于全基因組測序計(jì)劃的完成和各種分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。這些數(shù)據(jù)被儲存在專門的數(shù)據(jù)庫中（表 1）（ Luko

7、witz等，2000 ）。表1擬南芥網(wǎng)絡(luò)資源網(wǎng)站網(wǎng)址Supplemental material for this paperNottingham Stock Centre(U.K.)Recombinant Inbred mapOhio Stock Center ( U.S.A.)TAIR database* , homepageRecombinant Inbred map ( mirror site )CAPS markershttp:/Sequence tableSNP collectionCEREON collection of polymorphismsSSLP markersTIGR,

8、 genome annotationsDatabase of Ler sequencesKasuza DNA Research Institute, genomeannotationsMIPS genome annotationssvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposon insertions*注：The Arabidopsis Information Resource(TAIR)在擬南芥中的圖位克隆，在很大程度上得益于對 Col-0生態(tài)型測序的完成，因?yàn)樗窃谘芯繑M南芥時最常用的生態(tài)型。實(shí)現(xiàn)基因圖位克隆的關(guān)鍵是篩

9、選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo) 記。實(shí)質(zhì)上，分子標(biāo)記是一個特異的 DNA片段或能夠檢出的等位基因，對其有效地利用即可達(dá)到圖位克隆基因之目的。迄今為止，已有幾十種技術(shù)可用于分子標(biāo)記的篩選（Wang等，2000）。其中最為常用的是簡單序列長度多態(tài)性（ SSLPS和單核苷酸多態(tài)性（SNPS。SSLP是基于PCR勺分子標(biāo)記，在擬南芥基因組中有較多分布，而且是共顯性的，它的 檢測非常直接，但是我們需要設(shè)計(jì)引物來檢測假定的SSLP標(biāo)記；對SNPs標(biāo)記的檢測也比較直接，它是擬南芥不同生態(tài)型之間基因組中的單個核苷酸的差別，這些差別的核苷酸通常位于非編碼區(qū)域（Peters等，2003 ）。最常見的用于檢測 SNPs標(biāo)

10、記的方法主要是剪切擴(kuò)增 多態(tài)性序列（CAPS ,它也是基于PCR的。另外，一種更為有效的方法衍生的CAPS（dCAPS（Nam等, 1989 ; Michaels 和Amasino , 1998 ）可把任何已知的點(diǎn)突變作為分子標(biāo)記， 只要在PCR是引入不配對的引物，使擴(kuò)增的序列在一個生態(tài)型中具有限制性酶切位點(diǎn)，而在另一生態(tài)型中沒有，以形成多態(tài)性。圖位克隆法隨著相關(guān)配套技術(shù)（序列數(shù)據(jù)庫、分子標(biāo)記等）的日漸成熟，許多擬南芥及一些農(nóng)作物的基因已被成功的克隆（表2）。表2用圖位克隆方法得到的擬南芥及一些農(nóng)作物的基因基因突變表型基因同源序列AB13脫落酸不敏感玉米轉(zhuǎn)錄子FID3降低亞油酸飽和度細(xì)菌去飽和

11、酸酶AXR1生長素抗性泛素N端活性酶ETR1乙烯抗性雙因子調(diào)節(jié)子ABI1脫落酸不敏感鈣調(diào)蛋白磷酸化酶DET1黃化損傷反應(yīng)新核蛋白RPS2抗病新型富含亮氨酸的蛋白酶RPM1抗病激酶RSW1纖維素合成酶細(xì)胞色素P450家系ZLL調(diào)節(jié)中莖分生細(xì)胞胚胎發(fā)育蛋白PRT1抑制胞間蛋白降解控制植物N端代謝Torn adol植株短化IFL1正常的維管束間纖維分化受阻亮氨酸拉鏈蛋白ARA1樹膠醛糖激酶活性喪失半乳糖激酶基因家族VTC2維生素C合成不足果蠅蛋白CG3552線蟲蛋白C10F3.4 （功能未知）AST種皮花青苷斑點(diǎn)花青苷生物合成途徑中的二氫黃酮醇-4-還原酶本文擬對圖位克隆的研究進(jìn)展做一介紹，以期對植

12、物遺傳育種和分子生物學(xué)研究有所幫助。2圖位克隆的一般過程因?yàn)橛辛藬M南芥的基因組序列和高密度的遺傳標(biāo)記，圖位克隆過程就變得相對直接。圖2例舉了一種高效的擬南芥圖位克隆方法。從基于 Col-0和Ler遺傳背景的突變體出發(fā)，我 們有可能在大約一年時間內(nèi)找出與這個突變相關(guān)的基因，這其中主要耗時間的是五個植物（擬南芥）的生長周期（我們假定每個周期為兩個月）。作為作圖過程的第一步，突變體植株將和另外一個生態(tài)型（Col-0或者Ler）的植株雜交。在大多數(shù)情況下，用于雜交的突變體植株是作為父本還是母本是沒有關(guān)系的。然后播種F1代種子。在F1代植物的生長過程中，我們就有可能來對其表現(xiàn)型和基因型進(jìn)行分析。F1代植

13、物的表型的出現(xiàn)或者消失將顯示著我們所研究的突變是顯性的還是隱性的。最好通過對一些標(biāo)記的分析來確認(rèn) F1代植物是雜合體，而且在雜交過程中我們沒有犯錯誤。當(dāng)然也有必 要確認(rèn)原來的生態(tài)型背景。grow 3400 Fz pkifiEEal 坊 piMls wi! l自 marfcare f*wpe F3 reccrWinarYls*- r1s flfTwwiiG*1 dffTFinafTtfl«55ire?consider candidal# gw畔nmlaril Col-0 wile type LfflTW Fjforprogefiyruling TlraifAsa rreppng, jf

14、 < 4 cM wwnMiwi/ considEM candldarei panesmarkier trrurtor 2gwyg 30004000 £ p 月訊 1» End 204300 racorrtbinanta then phonofypr- ir FPneHGtypo 6CXJ F; plants Id find 1SD hom常ygML lhen genolype1?morthssaqijence ONAUhflert kMnlilW圖2圖位克隆過程示意圖（Jander等，2002 ）F1代植物自交得到F2代種子，大約播種 600個個體以進(jìn)行突變基因的粗定

15、位（first-pass mapping ,圖2）。在其生長過程中，我們可確定其表型，大約有150個個體被認(rèn)為是純合體（在隱性突變的情況下是純合突變體，在顯性突變的情況下是純合野生型）。然后從這150個個體的葉子或者其它組織中制備DNA用于基因型分析。起先用分布于擬南芥五條染色體上的25個標(biāo)記（相鄰的兩個標(biāo)記之間大約相距20 cM ）進(jìn)行分析，確定突變基因是和哪個或者哪幾個標(biāo)記是連鎖的，然后用三點(diǎn)測交的方法來定義一個包含突變基因的大約20 cM的遺傳間隔。一旦這樣的一個遺傳間隔被定義之后，接下來的工作就是引入新的標(biāo) 記把這個間隔縮小到大約4 cMo 般來說，利用150個F2代個體是在很大程度上

16、能找到這樣一個遺傳間隔的，距離突變基因最近的兩個分子標(biāo)記將作為側(cè)面標(biāo)記而用于下面的進(jìn)一步 分析。下一步我們將播種一個更大的F2代群體用于突變基因的精細(xì)定位（fin e-resoluti onmapping,圖2）。最終目標(biāo)是將包含突變基因的遺傳間隔縮小到40 Kb甚至更?。ㄟ@在擬南芥中大約是0.16 cM ）。顯然用于作圖的 F2代植物越多，就越能精確地定位突變基因。 一般需要30004000個F2代植物個體（包括粗定位時的 600個F2代植物個體）來精確地定 位突變基因。但是也有很多圖位克隆過程用了少于3000個F2代植物個體就成功地定位了突變基因（Lukowitz等，2000 ）。但是這往

17、往要冒因?yàn)樽鲌D群體不夠大再一次種植F2代植物而延長整個作圖過程的時間的風(fēng)險。在這個大約4cM的遺傳間隔內(nèi)找到與突變更緊密連鎖的分子標(biāo)記，一般情況下能在突 變兩側(cè)找到相距小于 40 Kb的兩個分子標(biāo)記。一旦這樣的兩個分子標(biāo)記被找到之后，就可以 通過測序來找到突變基因。一種有效的方法是設(shè)計(jì)PCR引物來擴(kuò)增覆蓋這40 Kb的多個重疊的500 bp的片段。將這些片段測序后拼接起來以得到整個40 Kb的序列，然后將它與野生型植物（Col-0或者Ler）的序列進(jìn)行比對，這就可以找到這個區(qū)域中的多個基因。從一系列侯選基因中鑒定基因是定位克隆技術(shù)的最后一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。現(xiàn)在最常用的方法是用含有目標(biāo)基因的大片段克隆

18、如 BAC克隆或YAC克隆去篩選cDNA文庫，并查詢生物數(shù)據(jù)信息庫，待找出侯選基因后，把這些侯選基因進(jìn)行下列分析以確定目標(biāo)基因：（1）精確定位法檢查 cDNA是否與目標(biāo)基因共分離；（2）檢查cDNA時空表達(dá)特點(diǎn)是否與表型致；（3）測定cDNA序列，查詢數(shù)據(jù)庫，以了解該基因的功能；（4 ）篩選突變體文庫，找出DNA序列上的變化及與功能的關(guān)系；（5）進(jìn)行功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，通過轉(zhuǎn)化突變體觀察突變體表型是否恢復(fù)正常 或發(fā)生預(yù)期的表型變化。功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)是最直接、最終鑒定基因的方法。利用新興的RNA干擾（RNAi）也可有效地確定目的基因。同源克隆：生物的種、屬之間編碼基因序列的同源性高于非編碼區(qū)的序列，基于此

19、原理,在其他種屬同源基因被克隆的前提下，構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫，然后用已知分子高保守序列制備同源探針，經(jīng)標(biāo)記后從相應(yīng)的文庫中篩選陽性克隆，并經(jīng)核酸序列分析鑒定所克隆的基因，當(dāng)然在沒有全同源探針的情況下，可以使用部分同源探針來篩選與探針序列相關(guān)但不完全相同的基因。圖位克隆 同源克隆 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequenee tags, EST）是從一個隨機(jī)選擇的 cDNA克隆進(jìn)行5'端和3'端單一次測序獲得的短的cDNA部分序列，代表一個完整基因的一部分。DbEST database EST表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫。1951年Barbara Mclintock

20、 首先在玉米中發(fā)現(xiàn)了控制元件，后來命名為轉(zhuǎn)座元 件或轉(zhuǎn)座子（transposon）。轉(zhuǎn)座子是基因組中一段可移動的 DNA序列，可以通過 切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置。這一元件不僅可用于分析生物遺傳進(jìn)化上分子作用引起的一些現(xiàn)象，還為基因工程和分子生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的工具，可以在不了解基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和表達(dá)模式的情況下，分離克隆植物基因，即轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽 (transposon tagging)，又稱 為轉(zhuǎn)座子示蹤法。其原理是利用轉(zhuǎn)座子的插入造成基因突變，以轉(zhuǎn)座子序列為基 礎(chǔ)，從突變株的基因文庫中篩選出帶有此轉(zhuǎn)座子的克隆，它必定含有與轉(zhuǎn)座子序列相鄰的突變基因的部分序列，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整 的基因1。1984年，用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法首先在玉米中分離了bronze基因，該基因編碼了玉米花色素合成途徑的關(guān)鍵酶UDP葡萄糖類黃3-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶2。此后還利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)分離了許多植物基因。轉(zhuǎn)座子可以分為兩大類：以DNA-DN方式轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子