第四章之二 愈傷組織的誘導(dǎo)、形成及分化

1、第一節(jié)第一節(jié) 愈傷組織的概念及類型愈傷組織的概念及類型第一節(jié)第一節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)和形成愈傷組織的誘導(dǎo)和形成第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織的繼代及其生長分析愈傷組織的繼代及其生長分析第四節(jié)第四節(jié) 愈傷組織形態(tài)建成愈傷組織形態(tài)建成 第五節(jié)第五節(jié) 愈傷組織的形成及其生理生化基礎(chǔ)愈傷組織的形成及其生理生化基礎(chǔ)掌握愈傷組織的概念和愈傷組織的誘導(dǎo)、形成及其特點(diǎn)以及愈傷組織的形態(tài)建成和調(diào)控掌握愈傷組織形態(tài)建成及其調(diào)控理解愈傷組織形成及形態(tài)建成的的生理生化基礎(chǔ)引言引言 一、植物細(xì)胞的全能性一、植物細(xì)胞的全能性定義：定義：植物體的每一個體細(xì)胞或性細(xì)胞，在一定離體植物體的每一個體細(xì)胞或性細(xì)胞，在一定離體培養(yǎng)條件下都具有

2、再生成完整植株的能力。培養(yǎng)條件下都具有再生成完整植株的能力。 植物體細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生完整植株示意圖植物體細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生完整植株示意圖ACBv植物細(xì)胞全能性是通過植物細(xì)胞全能性是通過生命周期生命周期、細(xì)胞周期細(xì)胞周期和和組織培養(yǎng)周期組織培養(yǎng)周期來實(shí)現(xiàn)的。來實(shí)現(xiàn)的。v圖中圖中A循環(huán)表示生命周期，包括孢子體和配子體的世代交替循環(huán)表示生命周期，包括孢子體和配子體的世代交替來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞全能型。來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞全能型。vB循環(huán)表示細(xì)胞周期，即細(xì)胞所決定的核質(zhì)周期，由于核質(zhì)循環(huán)表示細(xì)胞周期，即細(xì)胞所決定的核質(zhì)周期，由于核質(zhì)相全能性；相互作用，相全能性；相互作用，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄復(fù)制、轉(zhuǎn)錄mRNA并翻譯為蛋并翻譯為蛋白質(zhì)，

3、使循細(xì)胞全能性得以形成和保持；白質(zhì)，使循細(xì)胞全能性得以形成和保持；vC循環(huán)是組織培養(yǎng)周期，表示組織和細(xì)胞與供體失去聯(lián)系，循環(huán)是組織培養(yǎng)周期，表示組織和細(xì)胞與供體失去聯(lián)系，在離體條件下，靠人工合成培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，通過細(xì)胞脫分在離體條件下，靠人工合成培養(yǎng)基中的養(yǎng)分，通過細(xì)胞脫分化、分裂、再分化來實(shí)現(xiàn)全能性。化、分裂、再分化來實(shí)現(xiàn)全能性。 全能性的差異全能性的差異 表達(dá)全能性的前提：表達(dá)全能性的前提： 生活細(xì)胞生活細(xì)胞 分生狀態(tài)或胚性細(xì)胞狀態(tài)分生狀態(tài)或胚性細(xì)胞狀態(tài) 胚性細(xì)胞胚性細(xì)胞 植物胚胎干細(xì)胞植物胚胎干細(xì)胞 成熟組織中的胚性細(xì)胞成熟組織中的胚性細(xì)胞植物細(xì)胞的分類：植物細(xì)胞的分類：1.莖尖、根尖、

4、形成層。莖尖、根尖、形成層。2.表皮細(xì)胞和薄壁細(xì)胞。表皮細(xì)胞和薄壁細(xì)胞。3.導(dǎo)管、篩管、管胞、纖維細(xì)胞。導(dǎo)管、篩管、管胞、纖維細(xì)胞。二、植物細(xì)胞的分化二、植物細(xì)胞的分化 v植物細(xì)胞分化：植物細(xì)胞分化：differentiation 導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。育方式改變的過程。v細(xì)胞分化是多細(xì)胞生物體形態(tài)發(fā)生的基礎(chǔ)。 v細(xì)胞分化在植物形態(tài)建成中是一個核心問題，沒有細(xì)胞的分化就沒有形態(tài)建成。 v植物發(fā)育和細(xì)胞分裂、生長、分化有時間和空間上的必然聯(lián)系。二、植物細(xì)胞的脫分化二、植物細(xì)胞的脫分化 Dedifferentiatio

5、n1、脫分化與細(xì)胞分裂的關(guān)系、脫分化與細(xì)胞分裂的關(guān)系兩個觀點(diǎn)兩個觀點(diǎn) 細(xì)胞分裂是脫分化的細(xì)胞分裂是脫分化的過程過程 細(xì)胞分裂是脫分化的細(xì)胞分裂是脫分化的結(jié)果結(jié)果2、脫分化過程中的生理活動與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、脫分化過程中的生理活動與細(xì)胞結(jié)構(gòu) 啟動階段啟動階段：胞質(zhì)增生，向中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，胞質(zhì)增生，向中央伸出細(xì)胞質(zhì)絲，液液 泡蛋白體出現(xiàn)泡蛋白體出現(xiàn)； 演變階段演變階段：細(xì)胞核向中央移動，細(xì)胞核向中央移動，質(zhì)體演變成原質(zhì)質(zhì)體演變成原質(zhì) 體；體； 終結(jié)階段終結(jié)階段：恢復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)到分生細(xì)胞狀態(tài)3、脫分化調(diào)控機(jī)理、脫分化調(diào)控機(jī)理 細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控細(xì)胞周期蛋白細(xì)胞周期蛋白 cyclin（cycB

6、 、 cycD） 周期蛋白依賴激酶周期蛋白依賴激酶 CDK（CDK-a CDK-b)周期蛋白依賴激酶抑制子周期蛋白依賴激酶抑制子 CKI外界因素對植物細(xì)胞分化的影響外界因素對植物細(xì)胞分化的影響v任何一個分化的細(xì)胞都具有保持分生組織狀態(tài)的潛力 v在各種外界因素中，外源激素對脫分化起重要的作用 激素調(diào)控激素調(diào)控添加生長素：添加生長素：菊苣菊苣添加細(xì)胞分裂素：添加細(xì)胞分裂素：大豆、蘿卜大豆、蘿卜添加生長素和細(xì)胞分裂素素：添加生長素和細(xì)胞分裂素素：胡蘿卜胡蘿卜不添加激素：不添加激素：冠癭組織、煙草腫瘤組織冠癭組織、煙草腫瘤組織 4、細(xì)胞分裂及結(jié)果、細(xì)胞分裂及結(jié)果正常的二倍體細(xì)胞：第一次分裂為有絲分裂正

7、常的二倍體細(xì)胞：第一次分裂為有絲分裂高倍化細(xì)胞：第一次分裂多為無絲分裂高倍化細(xì)胞：第一次分裂多為無絲分裂二、植物細(xì)胞再分化二、植物細(xì)胞再分化Redifferentiation：離體條件下，細(xì)胞：離體條件下，細(xì)胞脫分化形成的無序細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織重新脫分化形成的無序細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織重新進(jìn)入有序分裂再生為植株個體的過程。進(jìn)入有序分裂再生為植株個體的過程。表1 離體條件下IAA和蔗糖濃度對木質(zhì)部和韌皮部分化的作用 IAA濃度 蔗糖濃度 木質(zhì)部/韌皮部形成 0.05mg/L 1% 很少量木質(zhì)部形成 2 較好的木質(zhì)部的形成，很少量韌皮部或沒有韌皮部的形成 2.53.5 同時形成木質(zhì)部和韌皮部 4 韌皮部形

8、成，很少或沒有木質(zhì)部形成 三、器官的分化三、器官的分化 器官發(fā)生途徑器官發(fā)生途徑和和體細(xì)胞胚發(fā)生途徑體細(xì)胞胚發(fā)生途徑定義：離體培養(yǎng)下的組織或細(xì)胞團(tuán)分化形成不定根、定義：離體培養(yǎng)下的組織或細(xì)胞團(tuán)分化形成不定根、不定芽等器官的過程。不定芽等器官的過程。 器官發(fā)生方式先芽后根先芽后根先根后芽先根后芽愈傷組織途徑愈傷組織途徑器官發(fā)生途徑器官發(fā)生途徑1 1 經(jīng)過愈傷組織的情況經(jīng)過愈傷組織的情況外植體經(jīng)誘導(dǎo)形成愈傷組織外植體經(jīng)誘導(dǎo)形成愈傷組織“生長中心生長中心”形成形成器官原基及器官形成器官原基及器官形成2 2 不經(jīng)過愈傷組織不經(jīng)過愈傷組織直接由原基發(fā)生直接由原基發(fā)生分生細(xì)胞團(tuán)發(fā)生分生細(xì)胞團(tuán)發(fā)生 愈傷組織

9、培養(yǎng)在離體培養(yǎng)體系中的地位愈傷組織培養(yǎng)在離體培養(yǎng)體系中的地位外植體外植體花藥和花粉花藥和花粉愈傷組織愈傷組織懸浮培養(yǎng)物懸浮培養(yǎng)物再生植株再生植株原生質(zhì)體原生質(zhì)體再生組織再生組織次生代謝物次生代謝物懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞為什么要進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)為什么要進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)v無性繁殖并大量擴(kuò)繁被培養(yǎng)的植物；無性繁殖并大量擴(kuò)繁被培養(yǎng)的植物； v 為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)與利用、原為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)與利用、原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合提供易于操作的起始材料；生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合提供易于操作的起始材料； v 為植物體細(xì)胞無性系變異、細(xì)胞突變體篩選創(chuàng)造為植物體細(xì)胞無性系變異、細(xì)胞突變體篩選創(chuàng)造適宜的

10、體系和基礎(chǔ)；適宜的體系和基礎(chǔ)； v 為外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化提供便于保存和利用的操為外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化提供便于保存和利用的操作對象；作對象； v 為種質(zhì)資源的保存提供新的形式；為種質(zhì)資源的保存提供新的形式； v 為離體研究植物組織和細(xì)胞分裂、分化、代謝和為離體研究植物組織和細(xì)胞分裂、分化、代謝和狀態(tài)的轉(zhuǎn)變創(chuàng)造適宜的材料和體系。狀態(tài)的轉(zhuǎn)變創(chuàng)造適宜的材料和體系。第一節(jié)第一節(jié) 愈傷組織的概念及類型愈傷組織的概念及類型一、定義一、定義 callus 在一定條件下從外植體的切口（傷口）部位生在一定條件下從外植體的切口（傷口）部位生成的無特定結(jié)構(gòu)和功能的薄壁細(xì)胞團(tuán)。成的無特定結(jié)構(gòu)和功能的薄壁細(xì)胞團(tuán)。二、愈傷組

11、織的起始條件二、愈傷組織的起始條件 創(chuàng)傷創(chuàng)傷+激素激素機(jī)械性創(chuàng)傷機(jī)械性創(chuàng)傷微生物入侵微生物入侵昆蟲襲擊昆蟲襲擊 三、來源三、來源 植物各種器官、組織、細(xì)胞均有產(chǎn)生愈植物各種器官、組織、細(xì)胞均有產(chǎn)生愈傷組織的潛在可能性傷組織的潛在可能性 葉 髓部根 幼胚 四、類型四、類型 質(zhì)地：脆軟、堅(jiān)硬（木質(zhì)化）質(zhì)地：脆軟、堅(jiān)硬（木質(zhì)化） 顏色：白色、淺黃、淺綠、黃色、綠色、顏色：白色、淺黃、淺綠、黃色、綠色、褐色、紅色褐色、紅色 表面：光滑、粗糙表面：光滑、粗糙 脆軟 堅(jiān)硬 黏多糖 生根 Red white callusGreen callusYellow callus類型顏色表面質(zhì)地胚性細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞質(zhì)

12、核胚性embryoniccallus淺黃光滑堅(jiān)硬易碎多小圓球形濃厚色深大非胚性non-embryoniccallus白色粗糙松散水漬狀少或無管狀無規(guī)則稀薄色淺小五、愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用五、愈傷組織培養(yǎng)的應(yīng)用種質(zhì)保存種質(zhì)保存原生質(zhì)體原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)固定化細(xì)胞固定化細(xì)胞植株再生植株再生人工種子人工種子 第二節(jié)第二節(jié) 愈傷組織的誘導(dǎo)、形成及特點(diǎn)愈傷組織的誘導(dǎo)、形成及特點(diǎn)一、誘導(dǎo)培養(yǎng)條件一、誘導(dǎo)培養(yǎng)條件外植體外植體光照光照 暗暗 弱光弱光溫度溫度 20-30培養(yǎng)基培養(yǎng)基 N源源 NH4+/NO3- C源源 蔗糖蔗糖 激素激素 生長素：生長素：2,4-D IAA NAA 0.01-10mg/L 細(xì)

13、胞分裂素：細(xì)胞分裂素：KT ZT 6-BA 0. 1-10mg/L愈傷組織形成愈傷組織形成起始期起始期分裂期分裂期形成期形成期改變原來的分化方向和代謝方式，改變原來的分化方向和代謝方式，合成代謝加強(qiáng)，合成大量蛋白質(zhì)和合成代謝加強(qiáng)，合成大量蛋白質(zhì)和核酸物質(zhì)為細(xì)胞的分裂和增殖奠定核酸物質(zhì)為細(xì)胞的分裂和增殖奠定基礎(chǔ)基礎(chǔ)外植體外層細(xì)胞開始分裂，細(xì)胞外植體外層細(xì)胞開始分裂，細(xì)胞脫分化，愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，缺脫分化，愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松，缺少組織結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明少組織結(jié)構(gòu)，顏色淺而透明特特 點(diǎn)點(diǎn)CallusCallus表層細(xì)胞分裂逐漸停止，表層細(xì)胞分裂逐漸停止，而轉(zhuǎn)向其內(nèi)部的局部地區(qū)，并改而轉(zhuǎn)向其內(nèi)部的局部地

14、區(qū)，并改變分裂面的方向，出現(xiàn)瘤狀結(jié)構(gòu)變分裂面的方向，出現(xiàn)瘤狀結(jié)構(gòu)外表，外表，CallusCallus中可以發(fā)現(xiàn)維管組中可以發(fā)現(xiàn)維管組織，但不形成維管系統(tǒng)織，但不形成維管系統(tǒng)二、愈傷組織的形成過程v*誘導(dǎo)期長短因植物種類、外植體的生理狀誘導(dǎo)期長短因植物種類、外植體的生理狀態(tài)和外部因素而異，即使同一種物種不同基態(tài)和外部因素而異，即使同一種物種不同基因型同一外植體的愈傷組織誘導(dǎo)期也不同。因型同一外植體的愈傷組織誘導(dǎo)期也不同。 v*如有的植物愈傷組織誘導(dǎo)期只有如有的植物愈傷組織誘導(dǎo)期只有1天（菊天（菊芋），而有的植物誘導(dǎo)期需要幾天（胡蘿芋），而有的植物誘導(dǎo)期需要幾天（胡蘿卜），而剛收獲得菊芋塊莖誘導(dǎo)期

15、只要卜），而剛收獲得菊芋塊莖誘導(dǎo)期只要22h，經(jīng)貯藏經(jīng)貯藏5個月后，其誘導(dǎo)期延長到個月后，其誘導(dǎo)期延長到2天。天。v*愈傷組織進(jìn)入分裂期時，外植體的脫分化愈傷組織進(jìn)入分裂期時，外植體的脫分化因植物種類、基因型、外植體種類和生理狀因植物種類、基因型、外植體種類和生理狀況而有很大差異。況而有很大差異。 v*如煙草、胡蘿卜等脫分化很容易，而禾谷如煙草、胡蘿卜等脫分化很容易，而禾谷類的脫分化較前者難；花器官脫分化較易，類的脫分化較前者難；花器官脫分化較易，而莖葉則較難；幼莖組織脫分化較易，而成而莖葉則較難；幼莖組織脫分化較易，而成熟的老組織較難。熟的老組織較難。愈傷組織誘導(dǎo)形成過程小麥幼胚分裂期誘導(dǎo)期

16、分裂期分化期分化期第三節(jié)第三節(jié) 愈傷組織繼代及其生長愈傷組織繼代及其生長一、繼代培養(yǎng)條件一、繼代培養(yǎng)條件選材選材 疏松、色淺、生長快疏松、色淺、生長快接種接種 大小大小5mm,重量重量100mg光照光照 暗暗 弱光弱光溫度溫度 20-30培養(yǎng)基培養(yǎng)基 不同水平的不同水平的2,4-D,KCl ,NH4+,NO3-,KT,BAv繼代培養(yǎng)的方法繼代培養(yǎng)的方法 將原來的愈傷組織分割成小塊，轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)將原來的愈傷組織分割成小塊，轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上，用于繼代培養(yǎng)的愈傷組織快必須達(dá)到一定的基上，用于繼代培養(yǎng)的愈傷組織快必須達(dá)到一定的大小，一般直徑為大小，一般直徑為5mm，重量約，重量約100mg，否

17、則在，否則在新鮮的培養(yǎng)基上難以迅速恢復(fù)分裂和生長，或者生新鮮的培養(yǎng)基上難以迅速恢復(fù)分裂和生長，或者生長十分緩慢。長十分緩慢。二、良好的愈傷組織二、良好的愈傷組織 高度胚性或再分化能力高度胚性或再分化能力 容易松散容易松散 旺盛的繁殖能力旺盛的繁殖能力 長期繼代后不喪失胚性或再分化能力長期繼代后不喪失胚性或再分化能力1 1、愈傷組織顏色、愈傷組織顏色 CallusCallus無任何形態(tài)結(jié)構(gòu)，新鮮愈傷組織顏色為無任何形態(tài)結(jié)構(gòu)，新鮮愈傷組織顏色為奶黃色奶黃色或或白色白色有光澤，少數(shù)也有有光澤，少數(shù)也有淡綠色淡綠色或或綠色綠色；老化的愈傷組織；老化的愈傷組織則轉(zhuǎn)變?yōu)閯t轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色黃色至至褐色褐色。 2

18、2、愈傷組織的保持時間、愈傷組織的保持時間 2 23 3周周3 3、愈傷組織生長周期、愈傷組織生長周期 S S型曲線型曲線4 4、擬分生組織、擬分生組織 三三 愈傷組織保持愈傷組織保持* * *愈傷組織在分裂期會出現(xiàn)導(dǎo)管細(xì)胞，篩管細(xì)胞，分泌細(xì)胞，愈傷組織在分裂期會出現(xiàn)導(dǎo)管細(xì)胞，篩管細(xì)胞，分泌細(xì)胞，毛狀體細(xì)胞及木栓細(xì)胞等，并出現(xiàn)由小而密集的分裂細(xì)胞構(gòu)毛狀體細(xì)胞及木栓細(xì)胞等，并出現(xiàn)由小而密集的分裂細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)，稱為擬分生組織。成的細(xì)胞團(tuán)，稱為擬分生組織。 * * *這些區(qū)域化的細(xì)胞團(tuán)往往在以后分化中稱為這些區(qū)域化的細(xì)胞團(tuán)往往在以后分化中稱為形成芽原基及形成芽原基及根原基的中心根原基的中心，愈傷

19、組織也經(jīng)常呈顆粒狀的外形，這些顆粒，愈傷組織也經(jīng)常呈顆粒狀的外形，這些顆粒中含有韌皮部、木質(zhì)部和形成層組織，這種具有類似微管組中含有韌皮部、木質(zhì)部和形成層組織，這種具有類似微管組織的愈傷組織顆粒也織的愈傷組織顆粒也具有分化形成不定芽和不定根的能力具有分化形成不定芽和不定根的能力。擬分生組織擬分生組織 1 1 以往研究認(rèn)為繼代時間長再生能力減弱甚至喪失，以往研究認(rèn)為繼代時間長再生能力減弱甚至喪失，但目前多數(shù)研究認(rèn)為長期繼代培養(yǎng)的愈傷組織仍有但目前多數(shù)研究認(rèn)為長期繼代培養(yǎng)的愈傷組織仍有再生能力。再生能力。 *繼代時間與變異繼代時間與變異v2 愈傷組織保持時間愈傷組織保持時間 已誘導(dǎo)并建立起來的愈傷

20、組織可以長期保已誘導(dǎo)并建立起來的愈傷組織可以長期保存，如有報道大豆細(xì)胞系的愈傷組織在存，如有報道大豆細(xì)胞系的愈傷組織在24和弱光下已保持和弱光下已保持15年。年。 注意注意v愈傷組織遺傳上的不穩(wěn)定性因基因型、外愈傷組織遺傳上的不穩(wěn)定性因基因型、外植體、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)時間而異。植體、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)時間而異。 v同基因型的同一種外植體在不同培養(yǎng)基上同基因型的同一種外植體在不同培養(yǎng)基上會產(chǎn)生不同的變異。會產(chǎn)生不同的變異。 v培養(yǎng)基成分，特別是外源激素的成分與變培養(yǎng)基成分，特別是外源激素的成分與變異的產(chǎn)生密切有關(guān)。異的產(chǎn)生密切有關(guān)。4 4 組織培養(yǎng)中涉及到的遺傳變異主要是細(xì)胞核組織培養(yǎng)中涉及到的遺

21、傳變異主要是細(xì)胞核組成的改變，變異是不可逆的，這種遺傳上的組成的改變，變異是不可逆的，這種遺傳上的改變可以是染色體畸變，細(xì)胞核破碎，或者是改變可以是染色體畸變，細(xì)胞核破碎，或者是由于細(xì)胞內(nèi)復(fù)制引起的多倍性以及分子水平上由于細(xì)胞內(nèi)復(fù)制引起的多倍性以及分子水平上的改變等形式。的改變等形式。5 5 愈傷組織遺傳上的不穩(wěn)定性因基因型、外植愈傷組織遺傳上的不穩(wěn)定性因基因型、外植體、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)時間而異。體、培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)時間而異。通過產(chǎn)生單極性不定芽或不通過產(chǎn)生單極性不定芽或不定根，再在不定芽下方長出定根，再在不定芽下方長出不定根或在不定根上產(chǎn)生不不定根或在不定根上產(chǎn)生不定芽，并在二者之間分化出定

22、芽，并在二者之間分化出維管束組織形成完整植株維管束組織形成完整植株CallusCallus僅分化出不定根或不僅分化出不定根或不定芽而形成無根苗或無苗根定芽而形成無根苗或無苗根在在CallusCallus的鄰近部位分化出的鄰近部位分化出不定根和不定芽，然后二者不定根和不定芽，然后二者通過維管束組織結(jié)合起來形通過維管束組織結(jié)合起來形成完整植株成完整植株通過體細(xì)胞胚胎通過體細(xì)胞胚胎途徑再生植株途徑再生植株通過非體細(xì)胞胚通過非體細(xì)胞胚胎途徑再生植株胎途徑再生植株無根苗無根苗形成有根苗形成有根苗二、具形態(tài)建成和不具形態(tài)建成能力的愈傷組織二、具形態(tài)建成和不具形態(tài)建成能力的愈傷組織* * *外植體細(xì)胞經(jīng)離體

23、誘導(dǎo)所形成的愈傷組織并不完全外植體細(xì)胞經(jīng)離體誘導(dǎo)所形成的愈傷組織并不完全都具有形態(tài)建成的能力。都具有形態(tài)建成的能力。 * * *具有形態(tài)建成能力的愈傷組織都具有形態(tài)建成能力的愈傷組織都具有一定的形態(tài)結(jié)具有一定的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)構(gòu)特點(diǎn)。 * * *具形態(tài)建成和不具形態(tài)建成能力的愈傷組織之間的具形態(tài)建成和不具形態(tài)建成能力的愈傷組織之間的差異是相對的，有時通過控制培養(yǎng)條件，尤其是生長差異是相對的，有時通過控制培養(yǎng)條件，尤其是生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和繼代的方式可以調(diào)控其進(jìn)行形態(tài)建成。調(diào)節(jié)物質(zhì)和繼代的方式可以調(diào)控其進(jìn)行形態(tài)建成。起始材料培養(yǎng)基培養(yǎng)環(huán)境Callus 誘導(dǎo)、增殖和形態(tài)建成物種基因型外植體種類、生理年齡培養(yǎng)

24、基類型硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基含鹽量中等培養(yǎng)基低鹽濃度培養(yǎng)基，如WS和HE有利利于根的離體誘導(dǎo)植物生長激素富鹽平衡培養(yǎng)基1 1 基因型基因型重要影響因素重要影響因素*基因型對離體培養(yǎng)條件反應(yīng)的差異在以往報道中也多有提及，表明離體培養(yǎng)過程，對起始材料的選擇是十分重要的。 *基因型是控制愈傷組織形態(tài)建成的關(guān)鍵。不同物種的外植體誘導(dǎo)的愈傷組織器官分化明顯不同，如煙草、胡蘿卜、苜蓿等較易發(fā)生器官分化，而禾本科（禾谷類）、豆類、棉花等的愈傷組織形態(tài)建成相對較難。 *同屬不同種，甚至同一物種不同品種的愈傷組織器官分化的能力也不同。表 1春小麥不同基因型出愈率基因型基因型出愈率出愈率重復(fù)重復(fù)1（）（）重復(fù)重復(fù)

25、2（）（）重復(fù)重復(fù)3（）（）平均平均（）（）F值值遼遼1094.396.892.194.4F28.67*東農(nóng)東農(nóng)774291.089.589.790.1Roblin85.389.587.587.5東農(nóng)東農(nóng)775785.788.286.486.8新克旱新克旱978.276.978.878.0表2 各基因型愈傷組織生長勢分析繼代天數(shù)愈傷組織鮮重（g/單胚）東農(nóng)7757遼10東農(nóng)7742Roblin新克旱90d0.0030.0030.0030.0020.00210d0.0330.0320.0370.0300.01720d0.0540.0490.0520.0390.02830d0.0800.0670.

26、0690.0520.03040d0.1070.0930.0930.0690.03450d0.1360.1200.1200.0790.04260d0.1710.1490.150.0930.04870d0.2130.1850.1810.1070.05680d0.2530.2270.2190.1240.06390d0.3120.2790.2550.1440.069100d0.3900.3610.3290.1650.078相對生長539表2 各基因型愈傷組織生長勢分析繼代天數(shù)愈傷組織鮮重（g/單胚）東農(nóng)7757遼10東農(nóng)7742Roblin新克旱90d0.0030.0030.

27、0030.0020.00210d0.0330.0320.0370.0300.01720d0.0540.0490.0520.0390.02830d0.0800.0670.0690.0520.03040d0.1070.0930.0930.0690.03450d0.1360.1200.1200.0790.04260d0.1710.1490.150.0930.04870d0.2130.1850.1810.1070.05680d0.2530.2270.2190.1240.06390d0.3120.2790.2550.1440.069100d0.3900.3610.3290.1650.078相對生長率13

28、012011082.539 圖1 小麥不同基因型單胚愈傷組織在繼代過程中鮮重變化 00.050.10.150.20.250.30.350.40102030405060708090100繼代天數(shù) subculture days(鮮重 g/單胚)(FWg/ embryo)7757Liao107742RoblinXinKehan92 2 外植體外植體 一般而言，分化水平較低的薄壁細(xì)胞和處于分裂的分生組織細(xì)胞較易誘導(dǎo)出愈傷組織。薄壁細(xì)胞分化水平較低，有較大發(fā)育的可塑性，其進(jìn)行分裂的潛力可保持很多年。、分生組織細(xì)胞分裂潛能強(qiáng)，細(xì)胞分裂是脫分化形成愈傷組織的關(guān)鍵，因此是誘導(dǎo)愈傷組織適合的外植體。 不同器官

29、作為外植體所誘導(dǎo)的愈傷組織，其器官發(fā)生能力，有的植物差別不大，如煙草和水稻；而有的則明顯不同，如翅鞘莎，以根、莖和葉為外植體時，愈傷組織的分化帶有器官來源的特征，如根外植體的愈傷組織易分化出根。 外植體的生理年齡也影響愈傷組織器官發(fā)生的能力，如油菜植株的莖段自下而上進(jìn)行培養(yǎng)的效果不同，下部器官形成率較低，而上部形成愈傷組織的苗分化率則較高（表4） 表4 油菜莖不同節(jié)位與苗分化的關(guān)系部位（由上而下）分化苗頻率（）每塊苗數(shù)173.34.0253.92.1322.20.547.10.150.00.060.00.070.00.03 3、愈傷組織在培養(yǎng)基上保持的時間、愈傷組織在培養(yǎng)基上保持的時間 愈傷組

30、織經(jīng)長期繼代培養(yǎng)，大多數(shù)物種基因型的愈傷組織再生能力降低，且受遺傳因素控制，依不同基因型而異，但也有例外，有的基因型的植株再生往往在愈傷組織經(jīng)多次繼代后而產(chǎn)生。4、培養(yǎng)基類型 依培養(yǎng)基配方中含鹽量多少可將目前培養(yǎng)基分為4類： *含鹽量較大的培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基以及改良的MS培養(yǎng)基，這類培養(yǎng)基含較高濃度的硝酸鹽、銨鹽和鉀鹽，微量元素非常全，此外LS（Linsmaier and Skoog, 1965）、BL(Brown and Lawrence, 1968)、ER(Eriksson, 1965)培養(yǎng)基也屬于這類培養(yǎng)基。 *硝酸鉀含量較高的培養(yǎng)基，如B5（Gamborg等，1968）、N6（朱至清等

31、，1975）、SH（Schenk 和 Hildebrandt，1972），這類培養(yǎng)基的鹽濃度也很高，其中NH+4和PO-34是由NH4H2PO4提供。 *含鹽量中等的培養(yǎng)基，如H（Bourgin 和 Nitsch，1979）培養(yǎng)基，這類培養(yǎng)基中大量元素為MS的1/2，微量元素種類減少，但含量增加，維生素種類比MS的多，在Nitsch培養(yǎng)基中生物素提高了10倍。 *低鹽濃度的培養(yǎng)基，如White培養(yǎng)基（1943），WS（Wolter和Skoog，1966）和HE培養(yǎng)基（Heller，1953）。v以上以上4種類培養(yǎng)基中，前兩種培養(yǎng)基較適合愈種類培養(yǎng)基中，前兩種培養(yǎng)基較適合愈傷組織誘導(dǎo)和細(xì)胞培養(yǎng)，

32、但選用那類培養(yǎng)基，傷組織誘導(dǎo)和細(xì)胞培養(yǎng)，但選用那類培養(yǎng)基，還應(yīng)依植物種類、基因型、外植體等而定；還應(yīng)依植物種類、基因型、外植體等而定；后兩類培養(yǎng)基則有利于根的形成。誘導(dǎo)愈傷后兩類培養(yǎng)基則有利于根的形成。誘導(dǎo)愈傷組織常用的培養(yǎng)基為組織常用的培養(yǎng)基為MS和和B5。高鹽濃度的。高鹽濃度的培養(yǎng)基可能對培養(yǎng)過程中愈傷組織數(shù)量及鮮培養(yǎng)基可能對培養(yǎng)過程中愈傷組織數(shù)量及鮮重增加有益。重增加有益。 A A、生長素和細(xì)胞分裂素、生長素和細(xì)胞分裂素 在愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和形態(tài)建成過程中，對其調(diào)控幅度最大的是植在愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和形態(tài)建成過程中，對其調(diào)控幅度最大的是植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要調(diào)節(jié)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度

33、和比例，其中物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要調(diào)節(jié)生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度和比例，其中生長素和細(xì)胞激動素的濃度和配比對大多數(shù)植物材料愈傷組織的誘導(dǎo)、生長素和細(xì)胞激動素的濃度和配比對大多數(shù)植物材料愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和形態(tài)建成的調(diào)控起重要作用。對絕大多數(shù)植物材料而言，增殖和形態(tài)建成的調(diào)控起重要作用。對絕大多數(shù)植物材料而言，2,4-D 是誘導(dǎo)愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最有效物質(zhì)，是誘導(dǎo)愈傷組織和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的最有效物質(zhì)，常用濃度為常用濃度為110mg/L，為，為促進(jìn)細(xì)胞和組織的生長還要加入促進(jìn)細(xì)胞和組織的生長還要加入0.52mg/L的細(xì)胞激動的細(xì)胞激動素素（KT）。）。表5 各種生長素對黃瓜各外植體愈傷組織誘導(dǎo)的

34、效應(yīng)（各種生長素濃度為10 mol/L）生長素愈傷組織形成種 子下胚軸果 皮IBA無愈傷組織形成愈傷組織增殖強(qiáng)IBA濃度為100 mol/L時愈傷組織生長良好NAA無愈傷組織形成所有外植體均產(chǎn)生愈傷組織愈傷組織增殖強(qiáng)2，4-D所有外植體均產(chǎn)生愈傷組織2，4-D濃度為1mol/L時愈傷組織生長良好愈傷組織增殖強(qiáng)NOA（萘氧乙酸）無愈傷組織形成愈傷組織增殖中等愈傷組織增殖中等NOP（萘氧丙酸）無愈傷組織形成愈傷組織增殖中等愈傷組織增殖強(qiáng)提示：提示：a對禾本科而言，誘導(dǎo)愈傷組織對禾本科而言，誘導(dǎo)愈傷組織2，4-D是必須的。是必須的。KT有抑制作用。有抑制作用。b. 所有植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度和

35、比例對植物材料愈傷組織誘導(dǎo)、所有植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類、濃度和比例對植物材料愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及形態(tài)建成的調(diào)控作用與植物種類、外植體類型、生理狀態(tài)及其對增殖及形態(tài)建成的調(diào)控作用與植物種類、外植體類型、生理狀態(tài)及其對生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的敏感性密切相關(guān)。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的敏感性密切相關(guān)。c. 大量研究表明，愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和器官發(fā)生及植株再生的基本大量研究表明，愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和器官發(fā)生及植株再生的基本培養(yǎng)基可相同，但對生長素和細(xì)胞激動素的數(shù)量和比例以及其他生長調(diào)培養(yǎng)基可相同，但對生長素和細(xì)胞激動素的數(shù)量和比例以及其他生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類，在愈傷組織的各階段有不同要求。一般高濃度生長素和節(jié)物質(zhì)的種類，

36、在愈傷組織的各階段有不同要求。一般高濃度生長素和低濃度的低濃度的KT有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖。有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖。 d. 對雙子葉植物而言，外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和生長往往需要適當(dāng)比例對雙子葉植物而言，外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和生長往往需要適當(dāng)比例的生長素和細(xì)胞激動素配合。如銀膠菊（的生長素和細(xì)胞激動素配合。如銀膠菊（Parthenium argentatum）莖）莖段愈傷組織的誘導(dǎo)、生長及其分化取決于生長素和段愈傷組織的誘導(dǎo)、生長及其分化取決于生長素和BA的比例的比例 e e 對愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的調(diào)控。在愈傷組織被誘導(dǎo)、增殖后，其形態(tài)結(jié)對愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的調(diào)控。在愈傷組織被誘導(dǎo)、增殖后，

37、其形態(tài)結(jié)構(gòu)各異，有的質(zhì)地松軟，有的堅(jiān)實(shí)，它們之間在培養(yǎng)過程中可由生長調(diào)構(gòu)各異，有的質(zhì)地松軟，有的堅(jiān)實(shí)，它們之間在培養(yǎng)過程中可由生長調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)行調(diào)控，使其互相轉(zhuǎn)換節(jié)物質(zhì)進(jìn)行調(diào)控，使其互相轉(zhuǎn)換。鵝觀草 表6 2,4-D和BA濃度對銀膠菊莖段愈傷組織生長的影響 在滲流培養(yǎng)體系中（flow-through system） f f 對愈傷組織形態(tài)建成的調(diào)控：植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織形態(tài)建對愈傷組織形態(tài)建成的調(diào)控：植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織形態(tài)建成起重要調(diào)節(jié)作用，成起重要調(diào)節(jié)作用，SkoogSkoog和和MillerMiller（19511951）提出）提出“激素平衡激素平衡”假說，假說，即高濃度的生長素有

38、利于根的形成，而抑制芽的形成，反之，高濃即高濃度的生長素有利于根的形成，而抑制芽的形成，反之，高濃度的激動素促進(jìn)芽的形成，而抑制根的形成。度的激動素促進(jìn)芽的形成，而抑制根的形成。苜蓿苜蓿萵苣萵苣B B、乙烯、乙烯 愈傷組織在培養(yǎng)過程中可產(chǎn)生大量乙烯，而且受培愈傷組織在培養(yǎng)過程中可產(chǎn)生大量乙烯，而且受培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)節(jié)，而且生長素和細(xì)胞分裂養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)節(jié)，而且生長素和細(xì)胞分裂素對愈傷組織的某些生理作用可能通過乙烯而起作用。素對愈傷組織的某些生理作用可能通過乙烯而起作用。外加乙烯對愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和形態(tài)建成具有調(diào)節(jié)作外加乙烯對愈傷組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)和形態(tài)建成具有調(diào)節(jié)作用用。v*

39、pH影響愈傷組織對影響愈傷組織對NO3和和NH4和和Fe的吸收利的吸收利用，用，pH高有利于愈傷組織對高有利于愈傷組織對NH4的吸收利用，反的吸收利用，反之可提高對之可提高對NO3的利用。的利用。 v*pH影響器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎的發(fā)生，它們的發(fā)影響器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎的發(fā)生，它們的發(fā)生都要求適合的生都要求適合的pH值。如煙草在值。如煙草在pH6.8時易形成花時易形成花粉胚狀體；水稻花粉愈傷組織在粉胚狀體；水稻花粉愈傷組織在pH7.0培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)基上預(yù)處理處理1天，可提高分化綠苗的潛力。天，可提高分化綠苗的潛力。（4 4）、活性炭等一些惰性物質(zhì)）、活性炭等一些惰性物質(zhì) 吸附培養(yǎng)基中某些成分，

40、如激素、瓊脂中的不純抑制物以及吸附培養(yǎng)基中某些成分，如激素、瓊脂中的不純抑制物以及培養(yǎng)基中的鹽酸硫胺素、煙酸、鐵的絡(luò)合物。培養(yǎng)基中的鹽酸硫胺素、煙酸、鐵的絡(luò)合物。 吸附外植體釋放到培養(yǎng)基中的分泌物，如激素、酚類物質(zhì)等。吸附外植體釋放到培養(yǎng)基中的分泌物，如激素、酚類物質(zhì)等。 吸附培養(yǎng)基中某些氣體成分。吸附培養(yǎng)基中某些氣體成分。 活性炭釋放到培養(yǎng)基中某些雜質(zhì)影響培養(yǎng)物的代謝?；钚蕴酷尫诺脚囵B(yǎng)基中某些雜質(zhì)影響培養(yǎng)物的代謝。 造成基質(zhì)的黑暗，使其更接近自然土壤調(diào)價。造成基質(zhì)的黑暗，使其更接近自然土壤調(diào)價。 （5 5）培養(yǎng)條件）培養(yǎng)條件溫度：溫度：增值和誘導(dǎo)最適增值和誘導(dǎo)最適2525，分化最適，分化最適

41、24-28 24-28 光：光：1500-2500lx1500-2500lx第五節(jié)第五節(jié) 愈傷組織的形成及其形態(tài)建成的某些生理愈傷組織的形成及其形態(tài)建成的某些生理生化基礎(chǔ)生化基礎(chǔ)在愈傷組織形成和形態(tài)建成中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可能起著在愈傷組織形成和形態(tài)建成中植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可能起著“開關(guān)開關(guān)”的的作用，首先誘導(dǎo)組織，使其成為對隨即發(fā)生的發(fā)育信號產(chǎn)生應(yīng)答的感作用，首先誘導(dǎo)組織，使其成為對隨即發(fā)生的發(fā)育信號產(chǎn)生應(yīng)答的感受態(tài)，發(fā)生一系列細(xì)胞和分子水平的變化，包括特定的基因表達(dá)及其受態(tài)，發(fā)生一系列細(xì)胞和分子水平的變化，包括特定的基因表達(dá)及其調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)。 一、芽的分化 *愈傷組織在培養(yǎng)基上生長，在一定條件下

42、首先導(dǎo)致類形成層的細(xì)胞成群出現(xiàn)，稱為分生原基，也稱為“節(jié)”或“生長中心”。 *在生長中心出現(xiàn)管胞細(xì)胞，并進(jìn)一步維管化，這是愈傷組織中器官形成部位，最初的分生原基具有可塑性，可形成根或芽，一般根在內(nèi)部形成，而芽起源于外部，但也有內(nèi)部分化芽的例子。二、芽分化過程中生理活性變化 淀粉積累淀粉積累 Thorpe和和Murashige（1970）在測定煙草分化和未分化愈）在測定煙草分化和未分化愈傷組織中核酸和蛋白質(zhì)以及碳水化合物的變化時，發(fā)現(xiàn)在傷組織中核酸和蛋白質(zhì)以及碳水化合物的變化時，發(fā)現(xiàn)在愈傷組織的芽形成區(qū)愈傷組織的芽形成區(qū)RNA和蛋白質(zhì)含量較高，且有淀粉的和蛋白質(zhì)含量較高，且有淀粉的大量積累，為芽

43、的形成提供物質(zhì)和能量。大量積累，為芽的形成提供物質(zhì)和能量。2. 內(nèi)源激素水平變化內(nèi)源激素水平變化v生長在同一種培養(yǎng)基上，處于分化和未分化的愈傷組織間，生長在同一種培養(yǎng)基上，處于分化和未分化的愈傷組織間，內(nèi)源激素水平明顯不同。劉滌等（內(nèi)源激素水平明顯不同。劉滌等（1986）的研究表明，在）的研究表明，在含含6-BA培養(yǎng)基上生長的分化組織，內(nèi)源激素含量與未分化培養(yǎng)基上生長的分化組織，內(nèi)源激素含量與未分化的組織差別很大，其中細(xì)胞激動素含量為未分化愈傷組織的的組織差別很大，其中細(xì)胞激動素含量為未分化愈傷組織的4倍，倍，GA3為兩倍。但為兩倍。但I(xiàn)AA含量明顯下降，僅為未分化的含量明顯下降，僅為未分化的1/20，導(dǎo)致分化和未分化組織中細(xì)胞激動素與，導(dǎo)致分化和未分化組織中細(xì)胞激動素與IAA的比例明的比例明顯不同，兩者相差顯不同，兩者相差85倍。倍。3 3、外源激素與器官分化、外源激素與器官分化 有研究表明，有研究表明，芽器官分化過程中對蛋白質(zhì)合成的依賴芽器官分化過程中對蛋白質(zhì)合成的依賴型高于核