第九章生物酶工程

1、第九章第九章 生物酶工程生物酶工程酶的篩選酶的篩選分子篩選；基于序列的篩選。分子篩選；基于序列的篩選。 基于基因的同源性，從已知酶蛋白出發(fā)，利用PCR技術(shù)或southern雜交，分離克隆目的酶基因。宏基因組方法宏基因組方法（metagenome） 土樣分離收集DNA片斷限制酶剪切PCR擴(kuò)增克隆到載體內(nèi)轉(zhuǎn)化（大腸桿菌）篩選轉(zhuǎn)化株功能基因新酶。(1)克隆酶：用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶；(2)突變酶：修飾酶基因，產(chǎn)生遺傳修飾酶；(3)新酶：設(shè)計(jì)新酶基因，合成自然世界不曾有的新酶。一、克隆酶一、克隆酶動(dòng)植物產(chǎn)生的酶有害的、未經(jīng)批準(zhǔn)的微生物產(chǎn)生的酶不可培養(yǎng)微生物產(chǎn)生的酶酶基因的克酶基因的克隆及表達(dá)隆及表達(dá)

2、 二、突變酶二、突變酶 酶基因的遺傳修飾：人為地將酶基因中個(gè)別核苷酸加以修飾或更換，從而改變酶蛋白分子某個(gè)或幾個(gè)氨基酸，使酶變得更有利于人類利用的目的。自然遺傳修飾：自然遺傳修飾：用化學(xué)誘變劑或物理誘變因素，作用于活細(xì)胞，使其基因發(fā)生突變，從中篩選有用的突變體。射線（紫外線、X射線、射線等）化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS、亞硝基胍等） 選擇性遺傳修飾：選擇性遺傳修飾：按照預(yù)定的目標(biāo)(突變位點(diǎn))，通過核苷酸的置換、插入或刪除，獲得突變酶基因。1.寡核苷酸置換的定點(diǎn)突變法利用一段人工合成的具有突變序列的寡核昔酸片段，取代野生型基因中的相應(yīng)序列E c o R IH in d I I IH in d

3、 I I IE c o R IH in d I I IE c o R IE c o R IH in d I I I突 變D N A野 生 型D N A野 生 型D N A人 工 合 成 的 寡 核 苷 酸 片 段退 火D N A連 接 酶突 變 體 序 列移 走 小 片 段H in d I I IE c o R I野 生 型D N A2.寡核苷酸誘導(dǎo)的定點(diǎn)突變利用帶有預(yù)定突變序列的寡核苷酸單鏈引物，在體外與原基因序列退火，誘導(dǎo)合成少量完整的突變基因AGT CGAAAGT CGAATCA GCTGAGT CGAATCA GCTGTCA GCTTAGT CGACTCA GCTGTCAGGCT化學(xué)合

4、成的寡核苷酸野生型突變型單鏈的重組分子M 1 3雜交退火D N A聚合酶D N A連接酶轉(zhuǎn)化大腸桿菌 P1 P3 P2 靶順序 P4 分別擴(kuò)增 5 3 3 5 5 3 3 5除去引物變性/復(fù)性產(chǎn)生點(diǎn)突變DNAPCR延伸3553P1 P4 5555553333333. PCR誘變誘變 三新酶三新酶酶的遺傳設(shè)計(jì)酶的遺傳設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)繪制具有優(yōu)良性狀的超自然的新酶基因圖案。 在確定設(shè)計(jì)目標(biāo)后， 先根據(jù)一定規(guī)則產(chǎn)生初始序列， 經(jīng)過結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和構(gòu)建模型， 對(duì)序列進(jìn)行初步的修改， 然后進(jìn)行基因表達(dá)或多肽合成， 再經(jīng)結(jié)構(gòu)檢測(cè)，確定是否與原定目 標(biāo)相符。 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，指導(dǎo)進(jìn)一步的設(shè)計(jì)。四、酶分子的定向進(jìn)化四、酶分

5、子的定向進(jìn)化(directed evolution)從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶（天然的或人工改造的），經(jīng)過基因的突變和重組，構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫(kù)，通過篩選獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。1.酶分子的進(jìn)化潛力。酶分子的進(jìn)化潛力。 天然酶在生物體內(nèi)存在的環(huán)境與酶的實(shí)際應(yīng)用環(huán)境不同。生物對(duì)環(huán)境適應(yīng)的進(jìn)化主要不是表現(xiàn)為某個(gè)酶分子的活力和穩(wěn)定性的不斷提高，而是在于整體的適應(yīng)能力，調(diào)控能力的增強(qiáng)。某些酶待進(jìn)化的性質(zhì)不是其在生物體內(nèi)所涉及的。定向進(jìn)化的基本過程通常分為3步通過隨機(jī)突變或（和）基因體外重組創(chuàng)造基因多樣性；導(dǎo)入適當(dāng)載體后構(gòu)建突變文庫(kù)；通過靈敏的篩選方法，選擇陽(yáng)性突變子。2定向進(jìn)化的策略定向

6、進(jìn)化的策略 易錯(cuò)易錯(cuò)PCR技術(shù)技術(shù)在擴(kuò)增目的基因時(shí)，通過調(diào)整反應(yīng)條件，從而向目的基因中，以一定的頻率隨機(jī)引入突變構(gòu)建突變庫(kù)，然后選擇或篩選需要的突變體。 DNA改組技術(shù)改組技術(shù) 將已經(jīng)獲得的存在于不同基因中的正突變結(jié)合在一起形成新的突變基因庫(kù)。DNA改組原理改組原理3.交錯(cuò)延伸交錯(cuò)延伸在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步,并大大縮短其反應(yīng)時(shí)間),從而只能合成出非常短的新生鏈,經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸.此過程反復(fù)進(jìn)行,直到產(chǎn)生完整的基因長(zhǎng)度,結(jié)果產(chǎn)生間隔的含不同模板序列的新生DNA分子.目標(biāo)酶所需功能方法結(jié)果實(shí)施菌種卡那霉素核苷基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性定位誘變+選擇在60-50酶半衰期增加200倍耐熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶作用于有機(jī)溶劑易錯(cuò)PCR+選擇在60二甲基亞砜中活力增強(qiáng)170倍枯草桿菌-內(nèi)酰胺酶作用于新底物DNA改組+選擇對(duì)cefotaxime的抗性增加32000倍大腸桿菌對(duì)硝基苯酯酶有機(jī)溶劑中的底物特異性和活性易錯(cuò)PCR+重組活力增加60-150倍大腸桿菌胸苷激酶第五特異性 基因理療交錯(cuò)延伸+選擇活力增加43倍大腸桿菌-半乳糖苷酶底物特異性DNA改組+選擇活力增加66倍底物特異性增加10