SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量實驗報告

1、一、前言聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，簡稱PAGE，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種:化學(xué)聚合法和光聚合法。化學(xué)聚合以過硫酸銨(APS)為催化劑，以四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子

2、篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HCI。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HCl。電極緩沖液是pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孑匕徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它

3、能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。SDS-PAGE般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品液和濃縮膠選TRIS/HCl緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸。電

4、泳開始后，HCI解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導(dǎo)區(qū)，而電場強度與低電導(dǎo)區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成一穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。此鑒定方法中，蛋白質(zhì)的遷移率主要取決于它的相對分子質(zhì)量，而與所帶電荷和分子形狀無關(guān)。聚丙烯酰八胺凝膠電泳作用原理聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有兩種形式:非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-P

5、AGE)非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、蛋白質(zhì)的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。而SDS-PAGE僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同就可以分開蛋白質(zhì)。該技術(shù)最初由shapiro于1967年建立，他們發(fā)現(xiàn)在樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑(SDS即十二烷基硫酸鈉)后，蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小(可以忽略電荷因素)。二、實驗?zāi)康?. 學(xué)習(xí)SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理。2. 掌握垂直板電泳的操作方法。3. 運用SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。三、實驗原理1.電泳帶電顆粒在電場作用下，

6、向著與其電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在一定的電場強度下，分子在凝膠介質(zhì)中的遷移速率取決于分子的大小、構(gòu)型和帶電量的大小。2.PAGE聚丙烯酰胺凝膠(PAG)是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑四甲基乙二胺仃EMED)和引發(fā)劑過硫酸銨(AP)的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。以此凝膠作為支持介質(zhì)的電泳稱為PAGE。PAGE具有電泳和分子篩的雙重作用。PAG機械強度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，改變Acr濃度或Acr與Bis的比例可以得到不同孑匕徑的凝膠。PAGE分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值與凝膠中的相同.帶電顆粒在電場作用下

7、主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。3SDS-PAGES本原理SDS-PAGE是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)。強還原劑巰基乙醇可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差

8、異。蛋白質(zhì)的電泳遷移率主要決定于亞基的相對分子質(zhì)量。而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在17,000165,000之間時，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系：lgMW=K-bm將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中的電泳遷移率對分子量的對數(shù)作圖，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要測得未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，就能根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。四、實驗器材和材料試劑儀器:垂直板型電泳槽;直流穩(wěn)壓電源；50或100pl微量注射器、玻璃板、水浴鍋，染色槽;燒杯;吸量管;常頭滴管等。原料:低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)按照每種蛋白0.5-1mgml-1樣品溶解液配制

9、?？膳渲瞥蓡我坏鞍踪|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，也可配成混合蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液。試劑:分離膠緩沖液(Tris-HCl緩沖液PH8.9):取1mol/L鹽酸48mL,Tris36.3g用無離子水溶解后定容至100mL;濃縮膠緩沖液(Tris-HCl緩沖液PH6.7):取1mol/L鹽酸48mL,Tris5.98g用無離子水溶解后定容至100mL;(3) 30%分離膠貯液:配制方法與連續(xù)體系相同，稱丙烯酰胺(Acr)30g及N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，過濾后置棕色試劑瓶中，4保存；(4) 10%濃縮膠貯液:稱Acr10g及Bis0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，

10、過濾后置棕色試劑瓶中，4貯存；10%SDS溶液:SDS在低溫易析出結(jié)晶，用前微熱，使其完全溶解；(6) 1%TEMED;(7) 10%過硫酸銨(AP):現(xiàn)用現(xiàn)配;電泳緩沖液(Tris-甘氨酸緩沖液PH8.3):稱取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,SDS1.0g,用無離子水溶解后定容至1L；(9) 樣品溶解液:取SDS100mg，巰基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚藍(lán)2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸緩沖液0.5mL，加重蒸水至10mL(遇液體樣品濃度增加一倍配制)。用來溶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及待測固體；(10) 染色液：0.25g考馬斯亮藍(lán)G-250，加入454mL50%甲醇溶液和46mL冰

11、乙酸即可；(11) 脫色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水與50mL甲醇混勻。五、實驗操作1制膠玻板的清洗用海綿和洗滌劑輕柔地清洗，嚴(yán)禁使用刷子和顆粒狀的去污粉與洗衣粉，完全沖洗干凈后烘干。2垂直板電泳槽夕松2：巾笊忙Cshr1pss3.凝膠的制備分離膠的制備配制12%分離膠。在燒杯中依次加入重蒸水3.35ml,分離膠緩沖液(1.5mol/LTris-HCI,pH8.8)2.5ml,10%SDS0.1ml,凝膠儲備液4.0ml，10%過硫酸銨50ul和TEMED10ul。由于AP和TEMED相遇后凝膠即開始聚合，所以應(yīng)立即混勻混合液，用移液槍抽取凝膠液加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，留出梳齒的齒

12、高加1cm的空間停止灌膠，小心覆蓋一層蒸餾水，37弋烘箱下聚合(約30min)。待分離膠聚合完全后，除去覆蓋的蒸餾水。濃縮膠的制備配制5%濃縮膠。在燒杯中依次加入重蒸水2.92ml,濃縮膠緩沖液(0.5mol/LTris-HCl,pH6.8)1.25ml,10%SDS0.05ml凝膠儲備液0.8ml,10%過硫酸銨25ul和TEMED10ul。由于AP和TEMED相遇后凝膠即開始聚合，所以應(yīng)立即混勻混合液，用移液槍抽取凝膠液加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，灌滿后小心插入梳齒，避免混入氣泡，37C烘箱下聚合(約30min)。4. 蛋白質(zhì)樣品的處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的處理低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒:兔磷酸化酶

13、BMW=97,400牛血清白蛋白MW=66,200牛碳酸酐酶MW=31,000胰蛋白酶抑制劑MW=20,100雞蛋清溶菌酶MW=14,400開封后，沸水浴中加熱3-5min后上樣。樣液的準(zhǔn)備用移液槍小心吸取處理好的血清50ul至1.5ml的離心管中，再加入50ul上樣緩沖液，混勻后沸水浴中加熱3min，取出冷卻后加樣。5.加樣用移液器分別取5l樣品液，小心將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部。6.電泳將電泳儀的正負(fù)極與電泳槽正負(fù)極相連接，打開電泳儀開關(guān)，設(shè)置電壓為200V，電泳60mins,此時溴酚藍(lán)染料達(dá)到凝膠底部，停止電泳，關(guān)閉電源。7.染色與脫色電泳結(jié)束后，取下玻板，在自來水下用特制板撬開短玻璃

14、板，從凝膠板上切下一角作為加樣標(biāo)記，在兩側(cè)溴酚藍(lán)染料區(qū)帶中心，插入細(xì)銅絲作為前沿標(biāo)記。加入染色液染色60mins，再用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，即可計算相對遷移率。8.結(jié)果處理量出加樣端距細(xì)銅絲間的距離（cm）以及各蛋白質(zhì)樣品區(qū)帶中心與加樣端的距離（cm）,按下式計算相對遷移率mR:蛋白質(zhì)樣品遷移距離（cm）m=R溴酚藍(lán)區(qū)帶距加樣端距離（cm）六、實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理脫色結(jié)束后，經(jīng)觀察可知，點有maker的孔跑出來的有5個清晰筆直的條帶，遷移率由低到高排列這5個條帶分別是分別是兔磷酸化酶B、牛血清白蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制劑、雞蛋清溶菌酶。點有血清蛋白的點樣孔跑出的結(jié)果在分離膠與濃縮

15、膠交界處出現(xiàn)一大團(tuán)成分未知著色團(tuán)，經(jīng)老師講解并且上網(wǎng)查閱資料得知這種現(xiàn)象可能是所謂的“鬼帶”現(xiàn)象。“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀。出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進(jìn)入分離膠。但它卻于目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。處理辦法為:在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑;或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。除此之

16、外還觀察到存在“拖尾現(xiàn)象”。這主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心;選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液時間過長，重新配制;降低凝膠濃度。2.實驗數(shù)據(jù)處理：溴酚藍(lán)區(qū)帶距加樣端距離：5.45cm待測樣品遷移距離：5.18cm遷移距離(cm)2.182.783.124.035.09遷移率m0.400.510.570.740.93MW9740066200310002010014400lgMW4.994.824.494.304.16由公式：lgMW=K-bm可得：lgMW=5.5516-1.5867m當(dāng)m=5.18/5.45=0.95時，lgMW=5.27，

17、貝,MWJ0965因此待測樣品的相對分子質(zhì)量約為10965七、思考題1在上樣緩沖液中SDS、基乙醇、甘油及溴酚藍(lán)的作用分別是什么？答：SDS使蛋白質(zhì)變性，用于確定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝膠電泳，也可以用于核酸抽提操作中破壞細(xì)胞壁及裂解核酸-蛋白復(fù)合物，在乳液聚合反應(yīng)中，可充當(dāng)兩相溶液的乳化劑；巰基乙醇用于打開二硫鍵的，使蛋白質(zhì)的四級或三級結(jié)構(gòu)被破壞；甘油使樣品處于下面，不易飄起，并有保護(hù)作用；溴酚藍(lán)用于顯色。2.在SDS-PAGE中，分離膠中的TEMED和AP的作用是什么？答：過硫酸銨（AP）為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)

18、丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。3.樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘？答：樣品液在沸水中加熱以除掉混在其中的一些小亞基，以免影響跑膠效果。八、實驗注意事項1.不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-凝膠電泳法測定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測出的分子量是不可靠的。包括:電荷異常或構(gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（如某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白如膠原蛋白等。例如組蛋白F1,它本身帶有大量正電荷，因此，盡管結(jié)合了正常比例的SDS，仍不能完全掩蓋其原有正電荷的影響，它的分子量是21,000，但SDS-凝膠電泳測定的結(jié)果卻是35,000。因此，最好至少用兩種方法來測定未知樣品的分子量，互相驗證。2.有許多蛋白質(zhì)，是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如a-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇的作用下，解離成亞基或單條肽鏈。因此，對于這一類蛋白質(zhì)，SDS-凝膠電泳測定的只是它們的亞基或單條肽鏈的分子量，而不是完整分子的分子量。為了得到更全面的資料，還必須用其它方法測定其分子量及分子中肽鏈的數(shù)目等，與SDS-凝膠電泳的結(jié)果互相參照。九、實驗結(jié)果誤差分析及討論