調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)及其流式檢測(cè)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）及其流式檢測(cè)方法1、Treg細(xì)胞概述高效免疫抑制劑的發(fā)現(xiàn)及其聯(lián)合應(yīng)用使臨床器官移植的急性排斥反應(yīng)大大降低，移植物的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)；器官移植成為挽救終末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途徑。但是免疫抑制劑具有明顯的毒副作用(如對(duì)重要臟器的損傷、降低抗腫瘤及抗感染免疫力等)及對(duì)治療慢性排斥反應(yīng)效果較差等問題，均限制了免疫抑制劑的長(zhǎng)期應(yīng)用。因此，相關(guān)生命科學(xué)工作者嘗試通過誘導(dǎo)移植免疫耐受途徑來避免免疫抑制劑的長(zhǎng)期應(yīng)用及克服移植免疫排斥反應(yīng)。在上個(gè)世紀(jì)九十年代中期，由Sakaguchi等首先證實(shí)了天然CD4 CD25 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulator

2、y T cell，Treg)為一類具有免疫抑制作用的T細(xì)胞，約占外周CD4+T細(xì)胞的510%。該類細(xì)胞以“主動(dòng)”的方式參與免疫應(yīng)答免疫耐受的調(diào)控，不僅參與自身免疫耐受調(diào)節(jié)，而且在腫瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。2、Treg細(xì)胞的來源研究證實(shí)，天然的CD4 +CD25+Treg細(xì)胞來源于胸腺，小鼠出生后第3天切除胸腺，外周缺乏CD4+ CD25+Treg細(xì)胞，產(chǎn)生抗自身抗體并出現(xiàn)自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。而在第0天和第7天切除胸腺，并不表現(xiàn)自身免疫性疾病。這說明出生3d內(nèi) 是胸腺產(chǎn)生CD4+CD25+Treg細(xì)胞的關(guān)鍵時(shí)期，這時(shí)切除胸腺引起自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的過度增殖。但是，出

3、生第0天胸腺產(chǎn)生的自身反應(yīng)性 CD4+T細(xì)胞不足，出生第7天胸腺已經(jīng)產(chǎn)生了足夠的CD4+CD25+Treg細(xì)胞，所以這時(shí)切除胸腺， 小鼠不出現(xiàn)自身免疫性疾病。Papiernik等證實(shí)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞產(chǎn)生于胸腺，然后遷移到外周發(fā)揮作用，CD4+CD25 胸腺細(xì)胞與外周的CD4+CD25+Treg細(xì)胞一樣，表現(xiàn)對(duì)經(jīng)由TCR的抗原刺激呈低反應(yīng)性，并且顯示抑制其他T 細(xì)胞增殖的能力。CD4+CD25+ Treg細(xì)胞的產(chǎn)生需要TCR與胸腺皮質(zhì)上皮細(xì)胞的MHC II類分子間的高親和力作用，MHC II類分子缺陷的小鼠缺乏CD4+CD25+Treg細(xì)胞。CD4+CD25+T細(xì)胞除了在胸腺產(chǎn)生

4、以外，還可以在未成熟的樹突狀細(xì)胞、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低劑量抗原誘導(dǎo)下由外周CD4+CD25-細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來，該類細(xì)胞稱為誘導(dǎo)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞。3、Treg細(xì)胞的常用的分子標(biāo)記CD25：Treg細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡，增加免疫耐受。研究表明，多種T細(xì)胞分子抗原參與Treg細(xì)胞的特異性功能效應(yīng)。傳統(tǒng)鑒定Treg細(xì)胞主要是通過CD4和CD25來標(biāo)記。但隨著研究的進(jìn)一步深入，發(fā)覺只通過CD4+CD25+雙陽性來定義的Treg細(xì)胞并不完全準(zhǔn)確FOXP3： FOX(forkhead box)是脊椎動(dòng)物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子的總稱，是一個(gè)具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子大家族，通常和

5、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控有關(guān)。FOX 家族成員都有一個(gè)叉頭樣結(jié)構(gòu)域，能與DNA結(jié)合。FOXP3是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員，2001年由Brunkow等首次報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，它的表達(dá)及 功能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，TR細(xì)胞)密切相關(guān)。如果FOXP3基因發(fā)生突變，將影響TR細(xì)胞的發(fā)育成熟，導(dǎo)致IPEX綜合征(immune dysregulation，polyendocrinop -athy，enteropathy，X linked syndrome)。 FOXP3主要表達(dá)于胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等淋巴器官和組織。在小鼠特異性表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞，而不表達(dá)于C

6、D8+T細(xì)胞。在人類FOXP3不僅可表達(dá)于CD4+CD25+T細(xì)胞，還可表達(dá)于CD8+CD28-T細(xì)胞。但在CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于CD8+T細(xì)胞。目前，F(xiàn)oxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公認(rèn)的Treg細(xì)胞的最敏感的標(biāo)志。CD127：最近發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)CD4， CD25和傳導(dǎo)信號(hào)FoxP3來定義調(diào)節(jié)性T細(xì)胞時(shí)，在一類特殊的細(xì)胞群體時(shí)會(huì)出現(xiàn)問題。我們發(fā)現(xiàn)IL-7受體（CD127）在外周血CD4+T的一個(gè)亞 群中會(huì)下調(diào)表達(dá)。我們證實(shí)這些細(xì)胞FoxP3陽性，且這群細(xì)胞包括那些CD25弱陽性或陰性群體。聯(lián)合使用CD4，CD25和CD127可得到高純度的調(diào) 節(jié)性T細(xì)胞

7、，比以前的通過其他標(biāo)志物來區(qū)分方法顯著提高。這些細(xì)胞在功能抑制實(shí)驗(yàn)中可發(fā)揮高度抑制功能。實(shí)際上，通過CD4和CD127表達(dá)來區(qū)分的細(xì)胞 數(shù)量（包括CD25+CD4+和CD25-CD4+）三倍于通過CD4+CD25hi區(qū)分的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群。最后，我們使用CD127定量檢測(cè)I型糖尿 病病人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CD127可作為人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的標(biāo)志物。4、FOXP3流式檢測(cè)方法   美國(guó)eBioscience公司是最早擁有FOXP3流式檢測(cè)抗體的公司之一，公司通過不斷改進(jìn)和優(yōu)化，建立了一套完美的針對(duì)FOXP3流式檢測(cè)特殊的試劑和方案。（1）   

8、60; 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)設(shè)備1)       流式上樣管 2)       混勻振蕩器3)       離心機(jī)4)       移液器、Tips5)       流式細(xì)胞儀所需試劑 1)       細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑（CD4、C

9、D25或CD8等）2)       FOXP3熒光標(biāo)記抗體3)       溶血素：（eBioscience目錄號(hào)00-4333）用于裂解紅細(xì)胞淋巴細(xì)胞分離液：若樣品為人的全血，建議先用分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞后再做后續(xù)檢測(cè)5)       固定劑和破膜劑：（eBioscience FOXP3檢測(cè)專用試劑，目錄號(hào)為00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，將其中的Fixation/Perme -abiliza

10、tion Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1：3的比例混合，配制好的溶液保存時(shí)間不要超過一天）6)       其他試劑：Flow Cytometry Staining Buffer（00-4222）或PBS，Permeabil -ization Buffer（Cat.No 00-8333）等（2）     實(shí)驗(yàn)操作步驟   注：對(duì)于不同的FOXP3克隆號(hào)抗體，在操作上可能存在著一些細(xì)微的差別。具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)參考相應(yīng)

11、的抗體說明書上的操作步驟。此操作以人Foxp3 (clone PCH101, cat. XX-4776).為例。1)       在每個(gè)流式上樣管中加入100ul準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)約為1x106個(gè)。2)       按照細(xì)胞表面抗原染色方法標(biāo)記表面抗原（如CD4、CD8、CD25等）。3)       用預(yù)冷的Flow Cytometry Staining Buffer或預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞。4) &

12、#160;     旋渦震蕩重懸細(xì)胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization），并再次旋渦混勻。5)       避光4孵育30-60分鐘。6)       加入2ml Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）工作液離心洗滌細(xì)胞并棄去上清液。7)       重復(fù)第5步操作洗滌細(xì)胞。8)       可選加入稀釋好的2%（2ul）的正常大鼠血清（用Permeabilization Buffer工作液進(jìn)行稀釋）100ul，在避光4孵育15分鐘9)       封閉液無需洗去，直接加入稀釋好的熒光標(biāo)記FOXP3抗體（用Permeabilization Buffer工作液進(jìn)行稀釋）20ul，避光4孵育至少30分鐘。建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出抗體的最適濃度。10)    加入2ml Permeabilization Buffe