方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則

1、一、準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度系指采用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率（）表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定。1. 化學(xué)藥含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度原料藥采用對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定，或用本法所得結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測(cè)物對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測(cè)制劑中加人已知量的被測(cè)物對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定，或用所建立方法的測(cè)定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一種方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。準(zhǔn)確度也可由所測(cè)定的精密度、線性和專屬性推算出來(lái)。2. 化學(xué)藥雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度可向原料藥或制劑處方量空白輔料中加人已知量雜質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。如不能得到雜質(zhì)或降解產(chǎn)物

2、對(duì)照品，可用所建立方法測(cè)定的結(jié)果與另一成熟的方法進(jìn)行比較，如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的方法。在不能測(cè)得雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的校正因子或不能測(cè)得對(duì)主成分的相對(duì)校正因子的情況下，可用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量。應(yīng)明確表明單個(gè)雜質(zhì)和雜質(zhì)總量相當(dāng)于主成分的重量比（）或面積比（）。3. 中藥化學(xué)成分測(cè)定方法的準(zhǔn)確度可用對(duì)照品進(jìn)行加樣回收率測(cè)定，即向已知被測(cè)成分含量的供試品中再精密加人一定量的被測(cè)成分對(duì)照品，依法測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。在加樣回收試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加人量與供試品中被測(cè)成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)；加入對(duì)照品的量要適當(dāng)，過(guò)小則引起

3、較大的相對(duì)誤差，過(guò)大則干擾成分相對(duì)減少，真實(shí)性差?；厥章剩?（C-A）/SX100%式中：A為供試品所含被測(cè)成分量；B為加入對(duì)照品量；C為實(shí)測(cè)值。4. 校正因子的準(zhǔn)確度對(duì)色譜方法而言，絕對(duì)（或定量）校正因子是指單位面積的色譜峰代表的待測(cè)物質(zhì)的量。待測(cè)定物質(zhì)與所選定的參照物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比，即為相對(duì)校正因子。相對(duì)校正因子計(jì)算法常應(yīng)用于化學(xué)藥有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定、中藥材及其復(fù)方制劑中多指標(biāo)成分的測(cè)定。校正因子的表示方法很多，本指導(dǎo)原則中的校正因子是指氣相色譜法和髙效液相色譜法中的相對(duì)重量校正因子。相對(duì)校正因子可采用替代物（對(duì)照品）和被替代物（待測(cè)物）標(biāo)準(zhǔn)曲線斜比值進(jìn)行比較獲得；采用紫外吸收檢測(cè)器時(shí)，

4、可將替代物（對(duì)照品）和被替代物（待測(cè)物）在規(guī)定波長(zhǎng)和溶劑條件下的吸收系數(shù)比值進(jìn)行比較，計(jì)算獲得。5. 數(shù)據(jù)要求在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少測(cè)定6份樣品的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì)3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)于化學(xué)藥品，一般中間濃度加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在1:1左右，建議高中、低濃度對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在1.2:1,1:1，0.8:1左右，應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率（），或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間（置信度一般為95%）。對(duì)于中藥，一般中間

5、濃度加人量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在1:1左右，建議高、中、低濃度對(duì)照品加人量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在1.5:1，1:1，0.5:1左右，應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對(duì)照品加入量、測(cè)定結(jié)果和回收率（）計(jì)算值，以及回收率（）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）或置信區(qū)間。對(duì)于校正因子，應(yīng)報(bào)告測(cè)定方法、測(cè)定結(jié)果和RSD%。在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當(dāng)放寬。二、精密度精密度系指在規(guī)定的條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密

6、度稱為重復(fù)性；在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度；在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。含量測(cè)定和雜質(zhì)的定量測(cè)定應(yīng)考察方法的精密度。1. 重復(fù)性在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平的供試品，用至少測(cè)定6份的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì)3種不同濃度，每種濃度分別制備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用9份測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)于化學(xué)藥，一般中間濃度加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在1:1左右，建議髙、中、低濃度對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在1.2:1，1:1，0.8:1左右

7、，對(duì)于中藥，一般中間濃度加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在1:1左右，建議高、中、低濃度對(duì)照品加入量與所取供試品中待測(cè)定成分量之比控制在1.5:1,1:1，0.5:1左右。2. 中間精密度考察隨機(jī)變動(dòng)因素如不同日期、不同分析人員、不同儀器對(duì)精密度的影響，應(yīng)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。3. 重現(xiàn)性國(guó)家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，如通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)獲得重現(xiàn)性結(jié)果。協(xié)同檢驗(yàn)的目的、過(guò)程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說(shuō)明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗(yàn)用樣品質(zhì)量的一致性及貯存運(yùn)輸中的環(huán)境對(duì)該一致性的影響，以免影響重現(xiàn)性結(jié)果。4.數(shù)據(jù)要求均應(yīng)報(bào)告偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。在基質(zhì)

8、復(fù)雜、含量低于0.01%及多成分等分析中，精密度接受范圍可適當(dāng)放寬。三、專屬性專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）存在下，采用的析方法能正確測(cè)定被測(cè)物的能力。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定方法，均應(yīng)考察其專屬性。如方法專屬性不強(qiáng)，應(yīng)采用多種不同原理的方法予以補(bǔ)充。1. 鑒別反應(yīng)應(yīng)能區(qū)分可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物。不含被測(cè)成分的供試品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，應(yīng)均呈陰性反應(yīng)。2. 含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定采用色譜法和其他分離方法，應(yīng)附代表性圖譜，以說(shuō)明方法的專屬性，并應(yīng)標(biāo)明各成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。在雜質(zhì)對(duì)照品可獲得的情況下，對(duì)于含量測(cè)定，試樣中可加入雜質(zhì)

9、或輔料，考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果。對(duì)于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察各成分包括雜質(zhì)之間能否得到分離。在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)行測(cè)定，與另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證了的方法或藥典方法比較結(jié)果。也可用強(qiáng)光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解或氧化等方法進(jìn)行加速破壞，以研究可能存在的降解產(chǎn)物和降解途徑對(duì)含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定的影響。含量測(cè)定方法應(yīng)比對(duì)兩種方法的結(jié)果，雜質(zhì)檢查應(yīng)比對(duì)檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，必要時(shí)可采用光二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)行峰純度檢查。四、檢測(cè)限檢測(cè)限系指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。藥品的鑒別試驗(yàn)和雜質(zhì)檢査方法，均應(yīng)

10、通過(guò)測(cè)試確定方法的檢測(cè)限。檢測(cè)限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒(méi)有定量意義。常用的方法如下。1. 直觀法用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。2. 信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把巳知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測(cè)出的被測(cè)物質(zhì)最低濃度或量。一般以信噪比為3:1或2:1時(shí)相應(yīng)濃度或注人儀器的量確定檢測(cè)限。3. 數(shù)據(jù)要求上述計(jì)算方法獲得的檢測(cè)限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)定圖譜，說(shuō)明試驗(yàn)過(guò)程和檢測(cè)限結(jié)果。五、定量限定量限系指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。對(duì)微量或痕量藥物分析

11、、定量測(cè)定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)確定方法的定量限。常用的方法如下。1.直觀法用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地定量測(cè)定的最低濃度或量。2.信噪比法用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地定量的被測(cè)物質(zhì)的最低濃度或量。一般以信噪比為10:1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。3. 數(shù)據(jù)要求上述計(jì)算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)定圖譜，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程和定量限結(jié)果，包括準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。六、線性線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)定響應(yīng)值與試樣中被測(cè)物濃度呈比例關(guān)系的程度。應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系?？捎猛粚?duì)照

12、品貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱取對(duì)照品，制備一系列對(duì)照品溶液的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備5份不同濃度的對(duì)照品溶液。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)對(duì)被測(cè)物的濃度作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算?；蛘呖刹捎妹枋鰸舛软憫?yīng)關(guān)系的非線性模型。數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性圖（或其他數(shù)學(xué)模型）。七、范圍范圍系指分析方法能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的高低限濃度或量的區(qū)間。范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。原料藥和制劑含量測(cè)定，范圍一般為測(cè)定濃度的80%120%;制劑含量均勻度檢査，范圍一般為測(cè)定濃度的70%

13、130%，特殊劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當(dāng)放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測(cè)定，范圍一般為限度的±30%，如規(guī)定了限度范圍，則應(yīng)為下限的-20%至上限的+20%;雜質(zhì)測(cè)定，范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的±20%。如果含量測(cè)定與雜質(zhì)檢查同時(shí)進(jìn)行，用峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算，則線性范圍應(yīng)為雜質(zhì)規(guī)定限度的-20%至含量限度（或上限的+20%）。在中藥分析中，范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對(duì)于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗(yàn)證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。校正因子測(cè)定時(shí)，范圍一般應(yīng)根據(jù)其應(yīng)用對(duì)象的測(cè)定范圍確定。八、耐用性耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于日常檢驗(yàn)提供依據(jù)。開(kāi)始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測(cè)定條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫(xiě)明，并注明可以接受變