醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)1醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳技術(shù)的一般原理學(xué)習(xí)醋酸纖維薄膜電泳的操作，了解電泳技術(shù)的一般原理二、二、實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理電泳是指帶電質(zhì)點(diǎn)在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動電泳是指帶電質(zhì)點(diǎn)在電場中向本身所帶電荷相反的電極移動的現(xiàn)象。在一定的現(xiàn)象。在一定pHpH條件下，不同的質(zhì)點(diǎn)由于具有不同的等電點(diǎn)條件下，不同的質(zhì)點(diǎn)由于具有不同的等電點(diǎn)而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和而帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場中它們的移動方向和移動速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們移動

2、速度也不同，即它們的電泳遷移率不同，因此，可使它們分離分離影響電泳遷移率的外界因素：電場強(qiáng)度、溶液的影響電泳遷移率的外界因素：電場強(qiáng)度、溶液的pHpH值、溶液值、溶液的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象的離子強(qiáng)度和電滲現(xiàn)象影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的影響電泳遷移率的內(nèi)在因素：質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大小和形狀大小和形狀第1頁/共13頁采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等

3、優(yōu)點(diǎn)尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯，將它溶于醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯，將它溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻有機(jī)溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為約為120 120 m m，有很強(qiáng)的通透性，對分子移動阻力很小，有很強(qiáng)的通透性，對分子移動阻力很小本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中含有本實(shí)驗(yàn)以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中

4、含有清蛋白、清蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白、球蛋白、-球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場中的遷移白質(zhì)由于氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場中的遷移速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在的緩沖體系中速度不同。以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在的緩沖體系中電泳，染色后可顯示電泳，染色后可顯示5 5條區(qū)帶。其中清蛋白的泳動速度最快，其余依次條區(qū)帶。其中清蛋白的泳動速度最快，其余依次為為1-1-、2-2-、-及及-球蛋白球蛋白實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理第2頁/共13頁第3頁/共13頁第4頁/共13頁n6.6./

5、 /組。組。n7.7.鑷子：一個(gè)鑷子：一個(gè)/ /組。組。n8.8.玻棒：公用。玻棒：公用。第5頁/共13頁第6頁/共13頁五、實(shí)驗(yàn)操作五、實(shí)驗(yàn)操作浸泡：將浸泡：將2 28 cm8 cm醋酸纖維薄膜迎著光辨別光澤面和無光澤面。在無光澤醋酸纖維薄膜迎著光辨別光澤面和無光澤面。在無光澤面距短邊一端面距短邊一端1.5 cm1.5 cm處用鉛筆輕輕畫一條點(diǎn)樣線，將之置于盛有緩沖液處用鉛筆輕輕畫一條點(diǎn)樣線，將之置于盛有緩沖液的平皿中，浸泡的平皿中，浸泡30 min30 min方可用于點(diǎn)樣方可用于點(diǎn)樣點(diǎn)樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸干多余的緩沖液，點(diǎn)樣：用鑷子取出浸透的薄膜，夾在兩層粗濾紙內(nèi)吸

6、干多余的緩沖液，然后平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上）。在另一然后平鋪在玻璃板上（無光澤面朝上）。在另一 載玻片上滴一滴血清，載玻片上滴一滴血清，點(diǎn)樣器（用蓋玻片的一邊）在血清上蘸一下（可來回移動一次），再將點(diǎn)樣器（用蓋玻片的一邊）在血清上蘸一下（可來回移動一次），再將點(diǎn)樣器輕印在加樣線上，使血清滲透到薄膜內(nèi)，形成均勻的直線點(diǎn)樣器輕印在加樣線上，使血清滲透到薄膜內(nèi)，形成均勻的直線第7頁/共13頁第8頁/共13頁電泳：將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝電泳：將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽極端支架上。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡下），另一端平

7、貼在陽極端支架上。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10 min10 min。通電，調(diào)節(jié)電壓至。通電，調(diào)節(jié)電壓至160 V160 V，電流強(qiáng)度為，電流強(qiáng)度為0.6 mA/cm0.6 mA/cm膜寬度，電泳時(shí)間膜寬度，電泳時(shí)間約約25 min25 min 染色：電泳完畢后將薄膜取下染色：電泳完畢后將薄膜取下, , 放在含氨基黑放在含氨基黑10B10B染色液的培養(yǎng)皿中浸染色液的培養(yǎng)皿中浸泡泡5 min5 min漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)漂洗：將薄膜從染色液中取出后移置漂洗液中漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清晰的電泳圖譜色脫盡，條帶清晰為止，可得到色帶清

8、晰的電泳圖譜 第9頁/共13頁第10頁/共13頁六、注意事項(xiàng)六、注意事項(xiàng)市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。若飄浮于液面的薄膜在鍵之一。若飄浮于液面的薄膜在151530 s30 s內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳淺一致，則此膜均勻可用于電泳醋酸纖維素薄膜電泳常選用巴比妥巴比妥鈉緩沖液，其濃度為醋酸纖維素薄膜電泳常選用巴比妥巴比妥鈉緩沖液，其濃度為0.09 mol/L0.09 mol/L。選擇何種濃度與樣品和薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過低。選擇何種濃度與樣品

9、和薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快區(qū)帶擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度，則區(qū)帶泳動速度快區(qū)帶擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴(kuò)散點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免引起樣品擴(kuò)散。但不宜太干，否則樣品不易進(jìn)入膜內(nèi)，造成點(diǎn)樣起始點(diǎn)參差不起，影。但不宜太干，否則樣品不易進(jìn)入膜內(nèi)，造成點(diǎn)樣起始點(diǎn)參差不起，影響分離效果響分離效果點(diǎn)樣時(shí)，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影點(diǎn)樣時(shí)，動作要輕、穩(wěn)，用力不能太大，以免損壞膜片或印出凹陷影響電泳區(qū)帶分離效果響電泳區(qū)帶分離效果電泳時(shí)應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為膜寬度。電流強(qiáng)度電泳時(shí)應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為膜寬度。電流強(qiáng)度高，則熱效應(yīng)高；電流過低，則樣品泳動速度慢且易擴(kuò)散高，則熱效應(yīng)高；電流過低，則樣品泳動速度慢