第五章質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)(二)大分子

1、第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)1有機質(zhì)譜原理及應(yīng)用第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)2F 方法：ESI和MALDI兩種電離方法。F 對象：帶有官能團的可溶解高分子。1988年，Tanaka，最早報道聚乙烯醇(PEG)， 22,000。1992年， Danis， MALDI， 聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸，30,000。 M. Karas & F.Hillenkamp MALDI，聚苯乙烯 70ku， PEG 40ku。1996年，C. Fenselau，聚苯乙烯 1500ku。5.1 高聚物質(zhì)譜分析高聚物質(zhì)譜分析第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)3 合成高分子是混合物，分子量是一種分布。 不同的引發(fā)和終止反應(yīng)所

2、得的高分子有不同的端基。 在隨機共聚物中，高分子鏈的組成呈現(xiàn)某種化學(xué)分布。 在嵌段共聚物中存在著不同的嵌段長度和順序。 非線性高分子，如環(huán)狀、支鏈和樹枝狀高聚物。 樣品用量少、耗時短、速度快。 儀器分辨率高使單體分析和端基分析成為可能。 直接測定絕對分子量，而不是相對分子量，精度高于光散射和膜滲透方法。 測定分子量時，不需要標(biāo)準(zhǔn)品或Mark-Houwink常數(shù)。 由分子量分布可獲得聚合反應(yīng)的鏈增長常數(shù)。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)4 基質(zhì)的作用： 從激光脈沖中吸收能量。要求：基質(zhì)對激光光源必須有很強的吸收。 使被測分子分離成單分子狀態(tài)。要求：基質(zhì)和被測高分子具有很好的相容性，同時不能有強的分于間

3、的相互作用。 使用不同種類的激光(IR，UV)電離，需要用不同類型的基質(zhì)。 F 紫外激光解離的基質(zhì) 蒽三酚和銀鹽的混合是分析聚苯乙烯的首選，但是這個混合物不穩(wěn)定，見表格。 F 紅外激光解離的基質(zhì) YAG激光(3.27m，相當(dāng)于 3050 cm-1) 激發(fā)C-H的伸縮振動。應(yīng)用于UV-MALDI的基質(zhì)也可用于IR-MALDI。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)5 Matrices PolymersHydrophilic2,5-dihydroxybenzoic acidPolypropylene glycol-Cyano-hydroxycinnamic acidPolyvinyl acetateFerul

4、ic acid Polytetramethylene glycolIndoleacrylic acidPolymethylmethacrylateDithranolPolystyreneall trans-Retinoic acidPolybutadieneDiphenylbutadienePolydimethylsiloxaneHydrophobic紅外激光與紫外激光電離的比較： 紅外激光有較強的穿透能力，一次紅外激光照射能夠解吸更多的樣品，因此在一個樣品點上獲得的質(zhì)譜圖較少，要經(jīng)常更換激光照射點。 紅外激光的脈沖較長。一般在 1020 s，而通常的紫外激光的脈沖約在 35 s，這導(dǎo)致了IR

5、-MALDI的分辨率較差。一般來講，紫外激光器更適于分析合成高分子，紅外激光器可用于一些鹵代高分予的分析。基質(zhì)的選取：極性相似原則！常見基質(zhì)的極性比較第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)6基質(zhì)Mr /cm-1(at 337nm)PA(kJ/mol)2,5-DHB1540.79105-841866854 14854 16 -CHCA1890.79 105-841933 9766 8芥子酸(SA)2241.10 105-887894 13蒽三酚226-874 8IAA187-900 16HABA242-943766 8第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)7 高分子測定過程中的陽離子化不是質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，而是金屬離子與高

6、分子發(fā)生陽離子化反應(yīng)，形成加合的高分子正離子。一般用Na+、K+等作為加合離子。有時不需要特別加入這些金屬，亦可以得到加合的正離子，這是由于容器上的Na+或K+所致。 具有雜原子的合成高分子，在加鈉鹽、鉀鹽后產(chǎn)生加合金屬陽離子的正離子。聚醚、聚酯、聚丙烯酸酯、聚酷胺等。 沒有雜原子的非極性合成高分子，如聚苯乙烯、聚丁二烯、聚異戊二烯在加入銀鹽或銅鹽后能夠成功的離子化，這些金屬陽離于與高分子中的雙鍵發(fā)生了作用。 沒有雜原子和雙鍵的合成高分子如聚乙烯和聚丙烯目前仍較難被MAIDI分析，因為它們的金屬陽離子結(jié)合能極低。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)8 簡單混合法： 在使用一個特定的樣品制備方法時，必須先

7、選擇適用于基質(zhì)、樣品和陽離子化鹽的溶劑，最理想的情況是使用一種溶劑這樣可以減少樣品在靶上結(jié)晶時分層的危險。然而，鹽類幾乎不溶于用于非極性合成高分子的有機溶劑。一般來講，鹽可以先溶于一個中間溶劑如丙醇中，然后再用用于基質(zhì)和樣品的溶劑稀釋。制備樣品時，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)娜軇⒑线m的濃度及配比，才能獲得較好的結(jié)果。 電噴霧法 一個很有前途的樣品制備方法是電噴霧沉積法，比起傳統(tǒng)的干點甚或薄層法，電噴霧法的優(yōu)點在于它可以形成小而均勻的結(jié)晶體。電噴霧沉積法制得樣品的點點之間重復(fù)性好，并且信號強度較大，層式的電噴霧效果更好一些。 壓片法 對于不溶的高分子樣品，如聚氨酯和大的多環(huán)芳香化臺物，發(fā)展了一砷新的制樣方法壓

8、片法即將樣品和基質(zhì)按一定比例混合后用球磨機研磨均勻，壓成薄片進行MALDI-TOF-MS分析。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)9 計算公式：nwiiiiwiiinMMPDMnMnMnMnM/2 當(dāng)分子量的分散度小于1.2時可獲得符合Poisson分布的質(zhì)譜圖，與GPC的結(jié)果一致。Mn： 數(shù)均分子量Mw： 重均分子量PD： 分布常數(shù)ni： 第i個寡聚物的相對豐度Mi： 第i個寡聚物的質(zhì)量PS 2800的MALDI-TOF質(zhì)譜圖PEG 2000的MALDI-TOF質(zhì)譜圖第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)10PEG 3100的MALDI-TOF質(zhì)譜圖PS 29ku 的MALDI-TOF質(zhì)譜圖聚合物數(shù)均分子量Mn重

9、均分子量Mw分子量分布PD測定方法PS4600046760473191.01MALDI-TOF42000435001.03GPCPS7000073914745181.01MALDI-TOF66000675001.03GPCPEG1260012426124921.01MALDI-TOF11843123201.04GPCPEG23020022115221051.01MALDI-TOF20240212281.06GPCMALDI-TOF-MS方法與GPC方法所測分予量的比較第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)11SSNNC10H21C10H21nSNNRnR = C6H13 C8H17 C10H21123 含

10、有聯(lián)吡啶 的共軛高分子結(jié)構(gòu) 聚合物的MALDI-TOF質(zhì)譜(a) IAA為基質(zhì), (b) IAA為基質(zhì)。并加入細(xì)AgTFA第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)12高分子化合物3(n=5)，環(huán)狀寡聚物的實驗結(jié)果(左)和理論同位素分布(右)(a): (C28H32N2S)5+H+ (b): (C28H32N2S)5+Ag+ 選取2142.1u的單同位素峰來計算端基的質(zhì)量。重復(fù)單元的質(zhì)量是428.2, 代入2142.1/428.25，即428.2 52141。這個峰的質(zhì)荷比等于5個重復(fù)單元加1個質(zhì)子比時帶上的氫原子的質(zhì)量，因此可以椎測這個系列的高分子為環(huán)狀高分子沒有端基。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)13NNNO

11、C2H5NClNOC2H5NNNHHClnNNNOC2H5NClNOC2H5NNNHHOHnNNNOC2H5NHONOC2H5NNNHHOHnNNNOC2H5ClClH2NNH235u + 158u + H + 237u 6 = 1616u35u + 140u + H + 237u 6 = 1598u17u + 140u + H + 237u 6 = 1580un=6q一種寡聚物的MALDI-TOF質(zhì)譜分析 兩種單體：三嗪聚胺的MALDI-TOF的質(zhì)譜第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)14 用MALDI分析不同種類的高分子混合物的文章很少也許是因為離子化效率的顯著不同和其他一些歧視固素。例如二兩種窄分

12、布的標(biāo)準(zhǔn)品PS10200和和PMMA9200分別溶解在THF中，以幾種體積比混合，接著以IAA為基質(zhì)加甲酸鈉或以蒽三酚為基質(zhì)加三氟乙酸銀。在第一套實驗方案中，PS和PMMA的體積比從0:1增加到199:1，基質(zhì)是IAA/Na，也就是對PMMA是最佳條件，試驗結(jié)果十分令入驚奇，甚至PMMA是以0 5的不純物存在干PS中，質(zhì)譜圖仍然是PMMA的MNa+峰為主要峰。在第二套實驗中，PS和PMMA的體積比從1:0到1:9，基質(zhì)是蒽三酚/Ag也就是PS的最優(yōu)化條件。在所有混合物實驗中，PMMA是主要離子，而PS僅以相對干PMMA為10%的峰出現(xiàn)，質(zhì)譜圖上主要是PMMA的峰。當(dāng)然，這種有利于PMMA的歧視

13、效應(yīng)也許可以用來檢測PS中中痕量的PMMA但是從這些結(jié)果中也可看出，用MALDI分析高分子混合物還要走很遠(yuǎn)的一段路。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)15 嵌段共聚物之中嵌段和組成分布對于聚合物的最終性能有重要的影響。MALDI-TOF-MS也可以成功地應(yīng)用于嵌段型高分子的研究。Dams等人用MALDI分析了-甲基苯乙烯和乙烯基吡啶的嵌段共聚物。 Wilezek-Vera等MALDI-TOF MS與1H NMR相結(jié)合，對苯乙烯/-甲基苯乙烯嵌段共聚物進行研究，測定了該共果物的組成分布和嵌段長度，我們研究組研究了榮乙二醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物。用MALDI/TOF測得的分子量和以GPC測定的結(jié)果參見表。

14、 從表中可以青出，對干這類窄分布的高分子化合物，MALDI/TOF所得結(jié)果與GPC法所得結(jié)果比較接近。但是MALDI/TOF法更加迅速、方便，具有顯著的優(yōu)越性MnMwPD共聚物GPC357737561.05No.1MALDI/TOF320735601.11共聚物GPC571963481.11No.1MALDI/TOF614265281.06GPC法和 MALD/TOF MS法測得的分子量比較第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)165.2 藥物的質(zhì)譜分析藥物的質(zhì)譜分析各種提取物的分析，HPLC/MS聯(lián)用分析第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)17Methanolic 根部提取物0246810121416182022

15、24262830Time (min)0102030405060708090100Relative Abundance11.9411.088.703.172.0718.0213.4618.5414.0718.8316.9219.0015.1319.421.60 水 - 甲醇梯度 0.25 mL/min, C-18 Column 20 uL 進樣LC-UV (215 nm)第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)18LC-MS, 基峰離子流圖2468101214161820Time (min)05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance9

16、.494.814.5817.8811.896.7219.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.8720.026.257.975.093.5421.421.07UnknowOOOHOHOOHOHOHOH 水-甲醇梯度 0.25 mL/min, C-18 Column 20 uL 進樣第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)19300350400450500550600m/z58010203040501000102030405060708090Relative Abundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT: 9.21-

17、9.61 AV: 8 NL: 1.28E6AV: 4 NL: 7.42E5 ?OOOHOHOOHOHOHOH(M-H)(M-H)負(fù)離子ESI全掃描質(zhì)譜圖(Full Scan MS) +14 u第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)20120140160180200220240260280300320m/z1000102030405060708090480510152025303540Relative Abundance293.1149.2311.9219.1180.5169.0294.2327.9121.1195.3144.9211.7275.2225.8164.0255.9244.5281.5324.9

18、293.3193.3325.8219.2294.3308.3131.5200.5159.9276.1265.4233.3334.5246.5155.0285.1m/z 293310.9OOOHOHOOHOHOHOHNegative Ion ESI Data Dependant MS/MS Spectra +14 um/z 179第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)21300350400450500550600m/z58010203040501000102030405060708090Relative Abundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT: 9.21

19、-9.61 AV: 8 NL: 1.28E6RT: 11.78-11.94 AV: 4 NL: 7.42E5OOOHOHOOHOHOHOHOOOHOHOOHOHOHOH(M-H)(M-H)Proposed Echinacoside Structure at m/z 487增加一個亞甲基第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)22RT: 0.11 - 21.822468101214161820Time (min)05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance9.494.814.5817.8811.896.7211.3919.0819.55

20、3.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.876.257.975.093.5421.421.07OOOHOHOOHOHOHOHOOOHOHOOHOHOHOHProposed EchinacosidesConfirmed Echinacoside第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)23大腦促眠素的發(fā)現(xiàn)與確證 從貓腦袋中取出腦髓液，用液相色譜分離各組分，用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜、氣質(zhì)聯(lián)用、薄層層析、紅外及核磁確定各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，目的目的是找出與睡眠規(guī)律有關(guān)的物質(zhì)。 F在貓睡眠周期的不同時間點采取腦髓液樣品，測定各樣品的紫外吸收光譜，發(fā)現(xiàn)貓在處于即將入睡狀態(tài)時，腦髓液試樣有一個特別顯著的

21、紫外吸收峰。 F電噴霧四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析各樣品的色譜峰中有顯著差異的組分，發(fā)現(xiàn)m/z282的離子。并證明是MH+離子，用快原子轟擊磁質(zhì)譜測得其分子式為C18H35NO。FCID實驗：m/z282的MS2和MS3。在低質(zhì)量范圍，m/z282的子離子譜顯示長鏈烷烴的特征。質(zhì)量數(shù)為17和35的中性丟失是母離子m/z282電離產(chǎn)生子離子m/z265，m/z247時產(chǎn)生的。F在以上質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上，綜合其它分析手段的表征結(jié)果，初步推測出這種催眠素的結(jié)構(gòu)為 順-9,10-十八碳烯酰胺。該化合物的合成和結(jié)構(gòu)表征證實這一結(jié)構(gòu)推測是正確的。 第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)24大腦促眠素的MS/MS質(zhì)譜確定大腦促眠素

22、的化學(xué)結(jié)構(gòu)腦髓液中分離出的促眠素化學(xué)結(jié)構(gòu)第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)25 結(jié)構(gòu)分析：確定代謝途徑，微量條件下進行。 定量分析：確定生物利用度等，在復(fù)雜本底的條件下測定。 OCH3NHClOSNHNHOOOH+OHparentq 例：一種非胰島素依賴型糖尿病藥物的代謝分析(LC/MS/MS技術(shù)第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)2624681012141618202224Time (min)050100Relative Abundance23.878.7210.6511.8913.0116.7910 x第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)27100150200250300350400450500550m/z01020

23、30405060708090100Relative Abundance510512222199279241123391532176399369第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)28150200250300350400450500m/z0102030405060708090100Relative Abundance369371395352492m/z 510 MS2第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)29100120140160180200220240260280300320340360m/z0102030405060708090100Relative Abundance169171304306288m/z 51

24、0 m/z 369 MS3第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)30m/z 369OCH3NHClOSNH2OOH+m/z 395OCH3NHClOSNHOOO+m/z 352OCH3NHClOSOO+m/z 304OCH3NHClONH2+m/z 288OCH3NHClO+m/z 169OOCH3Cl+m/z 510OCH3NHClOSNHNHOOOH+OHm/z 492+OCH3NHClOSNHNHOOOHMS1MS2MS3第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)31 遠(yuǎn)電荷碎裂：斷裂發(fā)生在遠(yuǎn)離電荷的位置，與質(zhì)譜解析一章中裂解均與電荷或自由基有關(guān)不同。主要原因是這種遠(yuǎn)電荷碎裂反應(yīng)發(fā)生在具有較長的碳鏈化合物中，如長鏈

25、脂肪酸、膽汁酸、類固醇等。 遠(yuǎn)電荷碎裂反應(yīng)在蛋白質(zhì)分析中有時也會發(fā)生。 研究方法：高能、中能、低能碰撞誘導(dǎo)解離MS/MS質(zhì)譜。高能碰撞：210kV，磁質(zhì)譜儀上，TOF/TOF等。F 低能碰撞: 100V以內(nèi)，四極桿質(zhì)譜儀，離子阱質(zhì)譜儀。F 中能碰撞： 1001000V， 扇形電場磁場/TOF聯(lián)用質(zhì)譜(特制質(zhì)譜)。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)32 長鏈飽和化合物F 1,4氫消除反應(yīng) (1)F 兩步均裂反應(yīng) (2) 產(chǎn)生荷基異位離子 末端不飽和離子 長鏈不飽和化合物(a) 近烯丙基鍵，記作Ap斷裂， Proximal allyl bond。遠(yuǎn)烯丙基-乙烯基鍵 distal allylvinyl bo

26、nd, Avd近烯丙基-乙烯基鍵，記作Avp斷裂， proximal allylvinyl bond。(b) X = O+ 或 OLi2+。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)3313-羰基-十八烷酸，12-羰基-十八烷酸的遠(yuǎn)電荷碎裂譜圖第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)34十八烷酸CID-MIKES譜圖，M-Ht2Li+ (A) 4,7-二烯十八烷酸, m/z 293 (B) 6,9-二烯十八烷酸 m/z 293高能碰撞, 6kV給出較多的信息，常用的遠(yuǎn)電荷碎裂的方法。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)35長鏈脂肪酸M-H+離子的ES-MS/MS 譜圖 (a) 硬脂酸， m/z 283; (b) 油酸, m/z 28

27、1; (c) 亞油酸, m/z 279. 譜圖采自于AutoSpec-OATOF儀器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞氣體。中能碰撞，400eV特殊設(shè)計的儀器上實現(xiàn)，有較多的信息。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)36低能CID譜，M-Ht2Li+，(4,7,10,13,16,19)-六烯二十二烷酸 (docosahexaenoic acid, m/z341)。低能碰撞，400eV信息較少，特殊情況使用。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)375.3 糖類的質(zhì)譜分析糖類的質(zhì)譜分析 糖：生命體的能源供給者，傳統(tǒng)的認(rèn)識。糖的生物活性：F與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、磷酸脂結(jié)合成“糖復(fù)合物” (glycoconjugate)，血漿

28、、酶、激素及細(xì)胞外膜均有含糖蛋白。糖復(fù)合物參與細(xì)胞的識別、增生、分異；維持生物體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和新陳代謝平衡。F 寡糖和多糖具有增強免疫力，抗輻射、抗腫瘤活性，成為藥物，中藥應(yīng)用，生物多糖，保健藥物，保健品。糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性：F單糖的組成為CnH2nOn (n=39)，其中n=5和6最為常見。每個單糖有多個手性碳原子。有鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)和環(huán)式結(jié)構(gòu)。 F寡糖和多糖的糖鏈?zhǔn)怯珊嘣u基的環(huán)狀己糖或戊糖通過苷鍵連接而成。各羥基環(huán)上有順反異構(gòu)體，各單糖分子上有五個手性碳，連接的位置和構(gòu)型多種多樣。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)38糖類分析的困難性：F 強極性，分離難，HPLC峰形不好。F 連接方式復(fù)

29、雜，立體化學(xué)復(fù)雜。F 同系物多，糖苷鍵弱，復(fù)雜混合體系。F 電離效率不高、種類有限。16種單糖的常見結(jié)構(gòu)1, 核糖-D-呋喃核糖Rib2,阿戊糖-L-吡喃阿戊糖Ara3, 戊醛糖-D-呋喃戊醛糖Xyl4,葡萄糖-D-吡喃葡萄糖Glc5,甘露糖-D-吡喃甘露糖Man6, 半乳糖-D-吡喃半乳糖Gal7,海藻糖L-吡喃海藻糖Fuc8,乙酰氨基葡萄糖N-乙?；?(-D-吡喃葡萄糖酰胺)GlcNAc第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)399,葡萄糖醛酸GlcA10, 鼠李糖L-吡喃鼠李糖Rha11, 乙酰神經(jīng)氨糖酸NeuNAc12,胞壁酸2-氨基-3-氧-(1-羧乙基)-2-脫氧-D-葡萄糖 Mur14, 雞納

30、糖6-脫氧- -D-葡萄糖15, 泰威糖Tyv16, D-果糖Fru一個典型的雙觸角氮連接多糖的結(jié)構(gòu)特征 觸角 核心區(qū) 第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)40電離方式：F FAB：傳統(tǒng)的電離方法，主要集中于低聚寡糖的分析。F ESI：對于常規(guī)的ESI，天然多糖的電離不如肽和蛋白，納升噴霧可以改善電離效率，可以達到與肽和蛋白相當(dāng)?shù)某潭?。寡糖的親水性限制了ESI霧滴的表面活性，靈敏度低。納噴霧霧滴小，可以突破親水性的限制，靈敏度顯著升高。多糖的衍生化，減小親水性，可提高靈敏度，導(dǎo)致靈敏度提高的是表面活性的增加，而不是樣品的揮發(fā)性。F MALDI：低聚物糖的電離效率基本與分子量無關(guān)。由于糖的不穩(wěn)定性，MAL

31、DI電離時會產(chǎn)生某些分解，尤其會產(chǎn)生亞穩(wěn)離子分解，可以用源后解離(PSD)技術(shù)測定亞穩(wěn)離子，但會使譜圖變得復(fù)雜。多糖碎片代號表示法非還原端用A, B, C表示。還原端用X, Y, Z表示。左上角標(biāo)表示，環(huán)中兩根斷裂鍵所連碳原子的編號(從環(huán)上氧原子開始計數(shù)，紅色數(shù)字)，右下角的數(shù)字表示殘基的序號。Z0Y0Z1Y1Z2Y2B1C1B2C2B3C3A10,2X11,5HOCH2ROOOHOHCH2OHOOOHOHOHCH2OHOOHOHO 還原端 非還原端123450第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)41OOOOHOHOOHHOOHOHOH+.OOHOHOOH.OHOOHOHOHO+Low activati

32、onbarrierOOOOOHOOHHOOHOHOM+.HOOOOOHOOHHOOHOHOM+.HHigh activationbarrierX-+第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)42HOOHOHOHOOOOHOHOHOHHOOHOHOHOOOHOHOHHOHHOH+M+Cross-ringcleavage(c)HOOHOHOHOOOOHOHOHOH+M+HOOHOHOHOOHOOHOHOHOHOM+(a)Metal ion lossGlycosidic-bondcleavage(b)M+第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)43第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)445.4 核苷酸核苷酸(Oligonucleotide

33、)的質(zhì)譜分析的質(zhì)譜分析第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)45500600700800900100011001200m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance919.1915.41098.61102.9787.81107.3922.5784.5686.1790.6817.11147.9689.1851.6691.7956.7609.91070.71064.7905.3768.7617.31153.71061.7720.3959.3664.8901.71174.31040.0590.0549.1522.1 進樣速度： 3 u

34、L/min 乙腈-甲醇-丙酮 (70:20:10,v/v/v, 5% TEA) 毛細(xì)管溫度: 100 COLIGO22 # 209-213 RT: 1.96-1.99 AV: 5 NL:1.49E5T: - p Full ms 450.00-1200.00第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)46OLIGO22#217-225RT: 2.03-2.09AV:8NL: 1.63E5T: - p Full ms 450.00-1200.00650700750800850900950100010501100m/z0102030405060708090100Relative Abundance1102.91098

35、.6918.8915.4787.5784.5689.3686.4611.2-5-6-7-8第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)47# 1 RT: 0.00P: - NL: 3.85E5T: - p Full ms 450.00-1200.0048005000520054005600580060006200mass0102030405060708090100Relative Abundance5520.05498.05541.05565.05745.04788.05972.05579.05385.05017.05221.04908.05116.06086.05762.06206.04821.0Report

36、ed Avg. Mol. Wt: 5500Monoisotopic Mass: 5497.7第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)48OLIGO22# 435-444 RT:4.86-4.98 AV:10 NL: 1.29E5T: - c Full ms2 1098.0035.00 305.00-2000.00400600800100012001400160018002000m/z020406080100Relative Abundance926.81071.51134.41068.51236.0817.91290.81167.9782.6610.11009.91347.11636.1850.3617.7

37、1388.0770.21480.01637.0481.21854.3506.1426.11997.7OLIGO22 # 495-507 RT:5.62-5.79 AV:13 NL:2.65E5T: - c Full ms2 784.0035.00 215.00-2000.00400600800100012001400160018002000m/z020406080100Relative Abundance765.3886.7875.8617.8923.21134.3610.3860.1673.61014.81135.1461.51347.1549.31636.11235.1426.21413.

38、1 1485.3306.31782.0 1880.2第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)495.5 蛋白質(zhì)分析蛋白質(zhì)分析小肽斷裂碎片離子定義第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)50研究小肽的結(jié)構(gòu)：MS/MS分析q例：一個五肽的分析 具有保護基的五肽的一級結(jié)構(gòu)： BOCGlyAlaDValLeuIleOBz BOC = t-Butyloxy carbony, Bzl = benzyl.離子類型MH+MH-56+MH-100+y4y3y2y1b4b3b2b1m/z662606562505434335222441328229158(CH3)2CHCH2ONH CH COBzlOCCHNHOBOCNH CH2CNH CH

39、 CNH CHOCH3OCHC(CH3)2b1b2b3b4y1y2y3y4yn = yn第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)51各離子的生成途徑 MH-56+ McLafferty重排 MH-100+m/z606CCH2+COHNH CCORHONOCOHNH CCORHNH+H+m/z562CH3COCNCH3CH3OH+NOOCH2H+CCH2+ CO2HNH+ 第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)52BOCNH CCNH2CCOBzlOR2HOR1H+BOCNH CCOR1H+NH2CCOBzlOR2H+bnBOCNH CCNHCCOBzlOR2HOR1HH+BOCNH CCOR1+yn+NH3CCOBzl

40、OR2H第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)53N-端NCH CNROHHHC-端N-端NCH CRHOC-端N-端NCOCHRC-端NH2HNHH+1212bn系列離子yn系列離子 第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)54氨基酸名稱單同位素相對分子量羥胺正離子質(zhì)量氨基酸名稱單同位素相對分子量羥胺正離子質(zhì)量甘氨酸 (glycine, Gly/G)57.0214630天冬氨酸 (aspartic acid, Asp/D)115.0269487丙氨酸 (alanine, Ala/A)71.0371144谷氨酰胺 (glutamine, Gln/Q)128.05858101絲氨酸 (serine, Ser/S)87.0

41、320360賴氨酸 (lysine, Lys/K)128.09496101脯氨酸 (proline, Pro/ P)97.0527670谷氨酸 (glutamic acid, Glu/E)129.04259102纈氨酸 (valine, Val/V)99.0684172甲硫氨酸 (methionine, Met/M)131.04049104蘇氨酸 (threonine, Thr/T)101.0476874組氨酸 (histidine, His/H)137.05891110半胱氨酸 (cysteine, Cys/C)103.0091976苯丙氨酸 (phenylalanine, Phe/F)14

42、7.06841120異亮氨酸 (isoleucine, Ile/I)113.0840686精氨酸 (arginine, Arg/R)156.10111129亮氨酸 (leucine, Leu/L)113.0840686酪氨酸 (tyrosine, Tyr/Y)163.06333136天冬酰氨 (asparagine, Asn/N)114.0429388色氨酸 (tryptophan, Trp/W)186.0793115920種氨基酸殘基（NH-HCR-C=O）和羥胺正離子的質(zhì)量第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)5550060070080090010001100120013001400150016001

43、7001800m/z0100%998.2942.7893.2848.6808.3616.2771.5738.0617.21060.5999.61131.11061.81211.81132.51137.51305.01413.71541.91696.3160001700018000m/z0100%16951.4去卷積deconvolution20 fmole 馬心肌紅蛋白馬心肌紅蛋白 (Horse Heart Myoglobin) ESI 質(zhì)譜圖質(zhì)譜圖第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)56原始數(shù)據(jù)去卷積混合物：主要兩種beta lactuglobulin第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)57人血紅蛋白 MALD

44、I-TOF 質(zhì)譜圖第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)58雞蛋溶菌酶ESI質(zhì)譜圖第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)59m/z1 = 895m/z2 = 945肌紅蛋白ESI質(zhì)譜圖第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)605.6 蛋白質(zhì)組學(xué)及應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)及應(yīng)用 由基因組，細(xì)胞或組織所表達的所有蛋白質(zhì)成分。F 研究基因組功能的重要途徑。藥物目標(biāo) - - 在分子水平研究健康和疾病的相關(guān)。 蛋白質(zhì)組學(xué)是一門在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律的新興學(xué)科。 蛋白質(zhì)組學(xué)的終極目標(biāo)是測定生物物種的所有生命活動中的所有蛋白質(zhì)。Why蛋白質(zhì)組學(xué)?F mRNA表達水平不能預(yù)測蛋白質(zhì)表達水平F 蛋白質(zhì)的修飾和加工不能從基因序列直接推導(dǎo)

45、F 蛋白質(zhì)組是動態(tài)的并反映生物系統(tǒng)的狀態(tài)第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)61 蛋白質(zhì)沒有可進行量的放大方法(如DNR的PCR方法)。 在生物處理過程中蛋白質(zhì)是高度動態(tài)變化的。 物理化學(xué)性質(zhì)的多樣性。 動態(tài)范圍的挑戰(zhàn)：相對含量超過106范圍(血清中可達1012) 質(zhì)譜是肽(不是蛋白質(zhì))的一級序列分析的最普遍和最有效的工具。 質(zhì)譜是一種精確的定量工具，尤其是內(nèi)標(biāo)法定量(如對同位素比的 測量)。 質(zhì)譜在確定蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)時不是很有效。 質(zhì)譜對已知肽和蛋白質(zhì)重復(fù)定量分析不是很有效。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)62經(jīng)典的氨基酸序列分析方法FN端氨基酸單元的分析 最常用的有下列兩種方法：桑格爾(Sanger F)

46、方法：利用肽鏈N端游離氨基與2,4二硝基氟苯(DNP)發(fā)生芳香親核取代反應(yīng)，而將 肽鏈上的氨基酸逐個分解。埃德曼(Edman)方法：用異硫氰酸苯酯(PITC)和N端的 游離氨基反應(yīng)，將肽鏈上的氨基酸逐個分解。F C端氨基酸單元的分析：通過羧肽酶催化水解F用特定的酶催化使含某種氨基酸的肽鍵部位水解D經(jīng)典分析方法的缺點 工作量大、測序速度慢、樣品用量大。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)63第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)64 儀器鑒定率 MALDI 50% (Peptide Mass Fingerprinter, PMF ) LC/MS/MS 80% (Peptide Sequence Tag, PST)LC

47、/MS/MS 80% (De Novo)Isotope-Coded Affinity Tags, ICAT)蛋白質(zhì)序列研究的三個層次第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)65蛋白質(zhì)組研究技術(shù)路線樣品(組織、細(xì)胞等)凝膠圖象分析蛋白質(zhì)鑒定二維數(shù)據(jù)庫酶解HPLC-MS、MS/MS數(shù)據(jù)庫檢索二維凝膠電泳酶解肽混合物MS、MS/MS肽指紋譜肽序列標(biāo)簽從新測序第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)66F PMF測定速度快。F PMF靈敏。F PMF需要完整和準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫。第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)671000120014001600180020002200240026002800m/z0100%1619.28968.

48、64836.58893.671251.93969.70970.691013.801060.231061.261252.971254.001570.171448.142313.692312.761621.141670.251671.241672.141873.461853.382019.571876.412271.832036.572314.752315.802366.832367.902368.852369.912718.091000120014001600180020002200240026002800m/z0100%1619.28968.64836.58893.671251.93969.7

49、0970.691013.801060.231061.261252.971254.001570.171448.142313.692312.761621.141670.251671.241672.141873.461853.382019.571876.412271.832036.572314.752315.802366.832367.902368.852369.912718.091000120014001600180020002200240026002800m/z0100%1619.28968.64836.58893.671251.93969.70970.691013.801060.231061.

50、261252.971254.001570.171448.142313.692312.761621.141670.251671.241672.141873.461853.382019.571876.412271.832036.572314.752315.802366.832367.902368.852369.912718.091000120014001600180020002200240026002800m/z0100%1619.28968.64836.58893.671251.93969.70970.691013.801060.231061.261252.971254.001570.17144

51、8.142313.692312.761621.141670.251671.241672.141873.461853.382019.571876.412271.832036.572314.752315.802366.832367.902368.852369.912718.09分離的酶解的蛋白質(zhì)96/384位樣品靶數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)庫檢索質(zhì)譜樣品的準(zhǔn)備MALDI質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)結(jié)果PMF方法的一般流程第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)68F 洗膠/去污F 脫水 F 減少S-S鍵F 洗滌/脫水F Multiprobe (4x96 Well Plat)F 樣品體積0.5-100 L F 板上加熱和冷卻F 消

52、化板加熱 37oCF 肽存儲在-4oC冷卻板F 酶試劑存儲在-4oC冷卻板F 修正-SH基 F 加入trypsin溶液F 5-12小時F 肽提取 靈敏度：靈敏度： 500fmoles BSA in-gel。 移液和消化時間移液和消化時間8小時小時(1x96 well plat)。 最多可進行最多可進行4x96 well plat的同時消化。的同時消化?；灸芰Φ谖逭拢嘿|(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)69設(shè)這檢索的條件，不同軟件有不同的參數(shù)和用法。MALDI-TOF 質(zhì)譜測定parmeters參數(shù)的選擇 樣品-1樣品-2樣品-3Program used MS-FitPeptIdentPeptIdentpI r

53、angeNO373.77.7Protein mass range2050kD1545kD1545kDSpecie searched MAMMALSMAMMALSMAMMALSDigest usedTrypsinTrypsinTrypsinPeptide mass accuracy2Da0.5Da0.5DaMethionice isOxidizedOxidizedOxidizedCysteine isCarbamidomethylation(Cys-CAM)Pepptide masses areAverageMonoisotopicMonoisotopicMumber of peptides55

54、5Number of missed cleavages111Number of peptide used in search111715第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)70樣品1樣品2樣品3數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果： 帶*號的峰為與數(shù)據(jù)庫中的峰相匹配的峰。樣品1：甘油醛-3-磷酸脫氫酶樣品2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶樣品3：丙糖磷酸異構(gòu)酶第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)71PMF 實驗，同一點上經(jīng)常是蛋白質(zhì)的混合物Some proteins are identified with high confidenceSome proteins are identified with high confidenceSo

55、me proteins are identified with low confidenceRow data第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)72And there are still peptides unassigned to a proteinFinal result第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)73特有的搜索引擎第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)74 蛋白質(zhì)的常見氨基酸有20 種，一般3 個氨基酸的肽段碎片將有8000種可能的排列方式4 個氨基酸將有160000種排列方式，因此即使對于不是很大的原核生物的蛋白質(zhì)組來說，一個短的序列片段也具有很高的特異性。 肽序列標(biāo)簽：一個多肽的部分氨基酸序列和該肽的質(zhì)量以

56、及該肽未測序部分的質(zhì)量。 Mann M. et al, Anal. Chem., 1994,66,4390 for PSTMann M. et al, Trands in Biochem. Sci., 1996,21,494.H2NCHCNHOR1R2ONHCCHR3OOHCCHa1a2b1b2c1c2x1x2y1y2z1z2H2NCHCNHOR1R2CHa2b2c2H2NCHCNHOR1R2OCCHH2NCHCNHOR1R2ONH3+CCH+CNHR2ONHCCHR3OOHCCHO+H3NR2ONHCCHR3OOHCCH+R2ONHCCHR3OOHCCH+x2 y2z2第五章：質(zhì)譜法測定分子

57、結(jié)構(gòu)75例：馬心肌紅蛋白鑒定 馬心肌紅蛋白胰酶酶切產(chǎn)物的ESI-Q-TOF肽指紋譜第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)76馬心肌紅蛋白胰酶酶切肽段m/z908.4(雙電荷離子)的MS/MS譜圖肽序列標(biāo)簽：GLSDGE WQQVLNV WGKy10,1257.8y3, 390.3C端N端 WQQVLNV WY3,390.3y10,1257.8檢索結(jié)果：第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)77N端 YAM IGD PTGALR C端y10,1000.5y7, 715.4例： m/z為691.43Da(M2+)，質(zhì)量數(shù)為1380.6Da。 MS/MS圖肽序列標(biāo)簽：檢索結(jié)果：來自乙醇脫氫酶 715.4(DGI)1000.

58、5第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)78 梯狀測序法梯狀測序法(ladder sequencing)：用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，相互間差一個氨基酸殘基的系列肽，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基，與Edman法相似。AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAnPTC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AanPC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAnPITC + 5% PICATZ(AA1) + AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAnAcid (TFA) after

59、m cyclesFurther cycles (without separation)PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC- AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA4-AA5- -AAn PC-AAm- -AAn一步MALDI-MS階梯序列數(shù)據(jù)B. Chait et al., Science 262, 89, 1993.原理：原理：第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)79血纖維蛋白肽:Protein ladder Sequencing Glu1fibrinopeptide B 第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)80傳統(tǒng)的低能量C

60、ADMS/MS 質(zhì)譜圖第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)81 MALDI PSD 與高能 CID的比較第五章：質(zhì)譜法測定分子結(jié)構(gòu)82F 光誘導(dǎo)解離(UV-193nm) 相當(dāng)于高能CID。F 多光子電離(IR-10.6m) 相當(dāng)于低能CAD。F 表面解離(SID) 相當(dāng)于低能CAD。F 電子捕獲解離(ECD) c和z類型碎片增強。注：這些方法在自動化大批量實驗中并不是常規(guī)的方法。 F 蛋白質(zhì)不在數(shù)據(jù)庫里或者不正確的搜索參數(shù)(酶特征，分類法等等)。F 在數(shù)據(jù)庫里蛋白質(zhì)表達不正確(DNA核苷酸序列，基因內(nèi)區(qū)序列等等預(yù)測失敗)。F 蛋白質(zhì)變性. - 變性的氨基酸殘基 - N端和C端的變化：蛋氨酸的形成，序列信號變化，