化學(xué)微生物學(xué)第8章-生物活性物質(zhì)

1、微生物生物活性物質(zhì) 參考書(shū)： 藥物微生物技術(shù)，李越中主編，化學(xué)工業(yè)出版社 海洋微生物及其代謝產(chǎn)物海洋微生物及其代謝產(chǎn)物，林永成，林永成主編，主編，化學(xué)工業(yè)出版社，2003 第一節(jié)第一節(jié) 重要的藥源微生物類(lèi)群重要的藥源微生物類(lèi)群 一、初級(jí)代謝和次級(jí)代謝微生物對(duì)物質(zhì)的代謝可以分成三個(gè)階段。 首先是各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。根據(jù)物質(zhì)的性質(zhì)不同，進(jìn)入細(xì)胞的方式也是不同的，可以是自由擴(kuò)散，也可能是被動(dòng)擴(kuò)散，還可以是主動(dòng)運(yùn)輸。進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)通常是小分子物質(zhì)，大分子物質(zhì)需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞外的一個(gè)降解過(guò)程后才能進(jìn)入細(xì)胞。而降解大分子物質(zhì)的酶類(lèi)也可以是微生物細(xì)胞所分泌的。 代謝的第二個(gè)階段是進(jìn)入細(xì)胞的各種物質(zhì)被代謝成各種

2、不同的中間產(chǎn)物。 最后一個(gè)階段是中間產(chǎn)物通過(guò)合成反應(yīng)形成細(xì)胞自身物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、輔酶等)或是通過(guò)分解反應(yīng)釋放大量能量，同時(shí)形成代謝終產(chǎn)物(如C02、H20等)，在厭氧條件下則形成乙醇、乙酸、乳酸等。這些代謝過(guò)程通常被稱(chēng)為細(xì)胞的初級(jí)代謝。 而次級(jí)代謝則是指在細(xì)胞指數(shù)增值結(jié)束以后的生理過(guò)程。許多微生物能夠?qū)⒅虚g產(chǎn)物轉(zhuǎn)化合成為各種對(duì)細(xì)胞存活“沒(méi)有用”的代謝物，即所謂的次級(jí)代謝產(chǎn)物。從生理功能上看，初級(jí)代謝產(chǎn)物似乎對(duì)微生物的生存更為重要。 表1-1比較了初級(jí)代謝和次級(jí)代謝的異同之處。 從表1-1中可以得出次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的特點(diǎn)，即： 次級(jí)代謝產(chǎn)物多在細(xì)胞生長(zhǎng)停止以后合成；初級(jí)代謝產(chǎn)物可直接

3、或修飾后成為次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的前體；合成反應(yīng)常包括聚合作用和修飾；次級(jí)代謝產(chǎn)物分泌胞外；合成反應(yīng)受初級(jí)代謝影響，但控制較為間接、松弛，主要受次級(jí)代謝自身系統(tǒng)控制。 對(duì)于次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的原因人們做了很多的分析，但至今仍無(wú)一個(gè)定論。目前，研究人員分析次級(jí)代謝產(chǎn)物可能的合成理由是：食物儲(chǔ)備；拮抗作用；次級(jí)代謝過(guò)程的重要性；誘導(dǎo)產(chǎn)生菌的細(xì)胞分化；誘導(dǎo)其他生物的細(xì)胞分化。 在這五項(xiàng)理由中，可能第三條更具有普遍意義可能第三條更具有普遍意義。即次級(jí)代謝過(guò)程可能比次級(jí)代謝產(chǎn)物本身的化學(xué)性質(zhì)對(duì)產(chǎn)生菌更具重要意義。 一方面，為了減輕初級(jí)代謝產(chǎn)物積累對(duì)細(xì)胞造成的毒性，需要有代謝途徑將這些過(guò)剩的代謝物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為對(duì)

4、細(xì)胞沒(méi)有毒性的產(chǎn)物，并分泌到細(xì)胞外。進(jìn)一步轉(zhuǎn)化過(guò)剩初級(jí)代謝產(chǎn)物的途徑即是次級(jí)代謝途徑。 另一方面，次級(jí)代謝的產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞初級(jí)代謝的蛋白質(zhì)的合成起到阻遏作用，使得微生物細(xì)胞逐步進(jìn)入休眠階段。 至于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的其他功能如對(duì)其他微生物細(xì)胞的拮抗作用、誘導(dǎo)其他細(xì)胞分化的作用及藥物用途等，僅應(yīng)看作是次級(jí)代謝的副產(chǎn)物”。 二、微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物 天然的微生物藥物是微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。 次級(jí)代謝產(chǎn)物這個(gè)詞原先是植物生理學(xué)家用來(lái)描述植物生物堿代謝的，由BuLock在20世紀(jì)60年代早期引入微生物，用以描述在某些微生物分類(lèi)組群中發(fā)現(xiàn)的、分化過(guò)程分泌的、對(duì)細(xì)胞功能并非必需的代謝物。這些物質(zhì)明顯地與初級(jí)代

5、謝物，特別是基礎(chǔ)細(xì)胞代謝物質(zhì)如氨基酸或核苷酸有所區(qū)別。 微生物藥物，包括抗生素，是具有某種生物學(xué)活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。但反過(guò)來(lái)并不是所有的次級(jí)代謝產(chǎn)物都有“生物學(xué)活性”。人們把生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物這個(gè)名稱(chēng)賦予如微生物藥物一類(lèi)的小分子化合物，現(xiàn)在已經(jīng)成為特指的專(zhuān)有名詞。 次級(jí)代謝物是具有如下特性的低分子量具有如下特性的低分子量的化合物的化合物：僅由某些微生物菌株合成；在培養(yǎng)物或菌落的生長(zhǎng)中沒(méi)有明顯的功能，因突變而丟失并不對(duì)菌的生長(zhǎng)和存活有明顯的影響；經(jīng)常與分化過(guò)程關(guān)聯(lián)著產(chǎn)生；常常以一族相似化合物的形式合成；僅在生長(zhǎng)抑制狀態(tài)下表達(dá)。 但應(yīng)該說(shuō)明的是，以上這些性質(zhì)并不是在所有次級(jí)代謝產(chǎn)物中都同時(shí)存在；

6、 “對(duì)生長(zhǎng)無(wú)明顯作用”不同于“完全沒(méi)有作用”，缺乏必需的代謝作用并不意味著在生態(tài)概念中缺乏選擇作用，例如，在生態(tài)條件下對(duì)其他微生物的拮抗。 微生物藥物的產(chǎn)生并不具有嚴(yán)格的種屬專(zhuān)一性，屬于同一種的不同菌株可能會(huì)產(chǎn)生完全不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物。 一個(gè)經(jīng)典的例子是灰色鏈霉菌，它的不同菌株可產(chǎn)生氨基糖苷類(lèi)的鏈霉素，帶一個(gè)復(fù)雜芳香環(huán)的糖苷類(lèi)新生霉素，從乙酸單位衍生的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的放線(xiàn)菌酮，縮肽綠灰菌素，含鐵的灰霉素等。 此外，同樣的藥物分子結(jié)構(gòu)也可由屬于不同類(lèi)別的微生物菌株產(chǎn)生。例如，鏈霉菌和假單胞菌中均可分離出環(huán)絲氨酸，而青霉素N也可由霉菌和放線(xiàn)菌中分離。 但一般的規(guī)律是，兩種微生物在分類(lèi)學(xué)上的差距越大，它

7、們產(chǎn)生同樣藥物分子的可能性就越小。三、重要藥源微生物類(lèi)群 雖然在藥物發(fā)現(xiàn)中關(guān)注微生物的多樣性，但并不是所有稀奇古怪的微生物中都存在藥物”。也就是說(shuō)，并不是所有的微生物都能形成生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物。盡管可以藥用的活性代謝產(chǎn)物在各種微生物中廣泛存在，但在不同的微生物類(lèi)群中的分布是不均勻的，或者說(shuō)不是隨機(jī)分布的。不同的微生物類(lèi)群，次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成能力有著巨大的差目。甚至，在產(chǎn)生“藥物。較多的種屬之間，產(chǎn)物的類(lèi)型也有著巨大的差異。只有少數(shù)的微生物種屬是優(yōu)秀的藥物產(chǎn)生菌藥源微生物。藥源微生物是新藥篩選的最重要來(lái)源。 從微生物藥物的大量篩選中至少可以得出如下一些經(jīng)驗(yàn)性的結(jié)論； 次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成在微生物

8、不同類(lèi)群中的分布是普遍的，但不是隨機(jī)的，有些菌類(lèi)群的產(chǎn)物較多； 能夠較為豐富地產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的細(xì)菌通常是那些具有細(xì)胞分化能力的類(lèi)群； 在不同屬，或同屬不同種，甚至同種不同菌株之間，產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力和代謝產(chǎn)物的種類(lèi)是不同的； 某種生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與菌株生活的生態(tài)環(huán)境可能有著密切的聯(lián)系； 土壤是微生物的大本營(yíng)，也是分離生物活性代謝物產(chǎn)生菌的目標(biāo)資源； 在一些新的微生物類(lèi)群，即研究較少的類(lèi)群中分高到新型活性代謝產(chǎn)物的可能性要大得多； 極端環(huán)境，或特異環(huán)境下生活的微生物往往可以產(chǎn)生一些新奇作用機(jī)制或化學(xué)結(jié)構(gòu)的次級(jí)代謝物。 半個(gè)多世紀(jì)的微主物藥物的篩選與開(kāi)發(fā)，為人們提供了大量的各種類(lèi)型

9、的天然化合物，占全部發(fā)現(xiàn)的生物活性天然化合物的80以上。在微生物來(lái)源的生物活性天然化合物中大多數(shù)是由放線(xiàn)菌(約占70)，尤其是鏈霉菌(占放線(xiàn)菌中發(fā)現(xiàn)物質(zhì)的75左右)中獲得的。 但隨著篩選工作廠(chǎng)泛深入的開(kāi)展，從放線(xiàn)菌等“高產(chǎn)”微生物中篩選新生物活性物質(zhì)的重復(fù)幾率越來(lái)越高，從其生物活性產(chǎn)物中獲得新化合物的比例已經(jīng)降到了不足0.1。 因此， 目前微主物藥物的篩選已由傳統(tǒng)的“高產(chǎn)”微生物轉(zhuǎn)向新的微生物類(lèi)群，如傳統(tǒng)的中藥用微生物、海洋微生物、極端微生物以及尚未開(kāi)發(fā)或開(kāi)發(fā)不足的“新”微生物類(lèi)群等。 這里根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的研究結(jié)果列出了如下一些微生物類(lèi)群。 (1)放線(xiàn)菌放線(xiàn)菌 盡管放線(xiàn)菌屆于細(xì)菌的一個(gè)類(lèi)群，但由

10、于其在藥物產(chǎn)生中的重要性而被單獨(dú)列出。目前國(guó)際上已經(jīng)描述和發(fā)表的放線(xiàn)菌近60個(gè)屬、2000多種。 放線(xiàn)菌是已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生微生物藥物最多，同時(shí)也是藥物研究最多的生物類(lèi)群。其中最重要最重要的是鏈霉菌屬的是鏈霉菌屬。此外還有產(chǎn)生放線(xiàn)菌素、慶大霉素等的小單孢菌屬;產(chǎn)生利福霉素等的諾卡菌屬；以及研究較少的稀有放線(xiàn)菌屬。 稀有放線(xiàn)菌不是分類(lèi)單位，發(fā)現(xiàn)新的次級(jí)代謝產(chǎn)物較多的主要包括游動(dòng)放線(xiàn)菌屬，尤馬馬杜拉放線(xiàn)菌屬，糖多孢菌屬等。 (2)細(xì)菌細(xì)菌 除了放線(xiàn)菌之外，還有不少類(lèi)群的細(xì)菌能夠產(chǎn)生各種各樣的藥物。其中著著名的有芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬等名的有芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬等。 在芽孢桿菌屬和假單胞桿菌屬主要的生

11、物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物是肽類(lèi)肽類(lèi)，新近也發(fā)現(xiàn)了其他類(lèi)型的生物活性代謝化合物。 盡管由于多肽類(lèi)的微生物藥物通常毒性較大，但由于剛剛興起的組合生物合成技術(shù)，多肽類(lèi)的藥物有可能經(jīng)過(guò)人工改造而產(chǎn)生出大量新型的藥物。 在藥源在藥源細(xì)菌中尤其值得一提的是粘細(xì)菌。細(xì)菌中尤其值得一提的是粘細(xì)菌。 粘細(xì)菌和放線(xiàn)菌相似，作為一大類(lèi)群具有特別的多細(xì)胞行為的細(xì)菌類(lèi)群，已被人們認(rèn)為是繼放線(xiàn)菌之后發(fā)現(xiàn)的最重要的藥源菌類(lèi)群。粘細(xì)菌，尤其是降解纖維素的粘細(xì)菌堆囊堆囊菌屬菌屬是目前已知產(chǎn)生生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的陽(yáng)性菌比例最高的生物類(lèi)群，甚至超過(guò)鏈霉菌。 并目，根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的粘細(xì)菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)看，粘細(xì)菌的產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)

12、新穎、多樣的特點(diǎn)，是很好的藥源菌類(lèi)群。 (3)真菌真菌 除了各種產(chǎn)生藥物的細(xì)菌外，真菌也有部分的類(lèi)群是重要的藥源微生物。Fleming最初發(fā)現(xiàn)的青霉素即是由 一株青霉菌產(chǎn)生的。重要的藥源真菌主要是半知菌類(lèi)中的曲霉菌科的青霉屬、曲霉屬和頭孢菌屬。 在傳統(tǒng)中藥中，包含了大量的大型真菌，如靈芝、蟲(chóng)草等。這些大型真菌被稱(chēng)為藥用真菌，屬于擔(dān)子菌目?，F(xiàn)代的研究表明，藥用真菌也是通過(guò)產(chǎn)生具有藥理活性的代謝產(chǎn)物而起作用，如大分子的多糖、小分子的萜類(lèi)、多肽等。因此，藥用真菌也是重要的藥源微生物。 產(chǎn)生生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物較高的生物類(lèi)群是產(chǎn)生生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物較高的生物類(lèi)群是進(jìn)行微生物藥物研究開(kāi)發(fā)的重要參考進(jìn)行

13、微生物藥物研究開(kāi)發(fā)的重要參考。 但是，生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物并不是藥物。一種物質(zhì)的生物學(xué)活性在體外系統(tǒng)被闡明，僅僅是該物質(zhì)成為藥物所必須具備的數(shù)個(gè)特性的第一個(gè)，并要求此活性必須很高且具有選擇性。 在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量的活性化合物的時(shí)代，應(yīng)應(yīng)該更加關(guān)注該物質(zhì)是否作用機(jī)制特別，是否是該更加關(guān)注該物質(zhì)是否作用機(jī)制特別，是否是一個(gè)全新的化學(xué)結(jié)構(gòu)。一個(gè)全新的化學(xué)結(jié)構(gòu)。如果發(fā)現(xiàn)的是一種與青霉素作用機(jī)制完全一樣的化合物，那么它的開(kāi)發(fā)研究?jī)r(jià)值就要大打折扣。 潛在的藥物還必須潛在的藥物還必須能夠在體內(nèi)很好地被吸收和分布，以足夠的濃度到達(dá)寫(xiě)作用部位，沒(méi)有毒性或沒(méi)有嚴(yán)重的副作用。而且，還有必要比較曰有藥物與研究的活性物

14、質(zhì)的各項(xiàng)性能，才能確定該物質(zhì)是否有必要，或能不能轉(zhuǎn)化為藥品。因此，具有生物活性的微生物化合物中僅僅有因此，具有生物活性的微生物化合物中僅僅有一小部分能被開(kāi)發(fā)成藥品。一小部分能被開(kāi)發(fā)成藥品。 四、藥用微生物四、藥用微生物 藥用微生物通常是指?jìng)鹘y(tǒng)中藥(漢方藥)中的大型藥用真菌，如靈芝、蟲(chóng)草等。但也不排斥細(xì)菌作為藥用菌，如粘細(xì)菌的子實(shí)體結(jié)構(gòu)部分。 隨著中藥國(guó)際化和明確分析中藥中活性組分的要求，藥用菌的研究將更主要地被歸結(jié)為生物活性成分的研究，即作為藥源菌的生物活性代謝產(chǎn)物的研究。 同時(shí)，藥用微生物也指各種具有明顯藥效作用的菌劑。最著名的如在人體免疫中廣泛使用的減毒或滅活的微生物疫苗。此外，還應(yīng)包括具

15、有明顯生理調(diào)節(jié)功能的有益腸道菌制劑，在農(nóng)業(yè)上廣泛使用的農(nóng)用微生物菌劑等。第二節(jié)第二節(jié) 微生物活性代謝物的發(fā)現(xiàn)微生物活性代謝物的發(fā)現(xiàn)和篩選和篩選 自從1929年弗來(lái)明從真菌發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，微生物活性代謝產(chǎn)物成了藥物的豐富源泉。在過(guò)去60多年中，已經(jīng)從微生物中發(fā)現(xiàn)了3000050000種天然產(chǎn)物，其中10000多種有生物活性，8000多種是抗菌和抗腫瘤劑。今天已有100多種由微生物生產(chǎn)的應(yīng)用于臨床的抗菌素、抗腫瘤劑和農(nóng)藥。全球抗生素年產(chǎn)量超過(guò)10萬(wàn)噸，產(chǎn)值50多億美元。由此可見(jiàn)，微生物的活性物質(zhì)對(duì)人類(lèi)健康的極端重要性。微生物活性物質(zhì)還有其它的價(jià)值，例如所產(chǎn)生的酶可制成酶制劑，可產(chǎn)生維生素和氨基酸。

16、在食品發(fā)酵和制革工業(yè)也有廣泛應(yīng)用。 迄今在藥物工業(yè)上人們正做出巨大的努力，探查土壤細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物(估計(jì)每年超過(guò)90億美元)，化學(xué)家在世界范圍內(nèi)正大力研究細(xì)菌發(fā)酵代謝物的分子結(jié)構(gòu)及其化學(xué)和藥理活性。盡管土壤細(xì)菌連續(xù)被廣泛地研究，但是很明顯的是，發(fā)現(xiàn)新代謝產(chǎn)物的速度正在減少。 另一方面?zhèn)魅拘圆【鷮?duì)傳統(tǒng)抗生素的抗藥性正在迅速發(fā)展，已觀(guān)察到肺結(jié)核菌種產(chǎn)生抗藥性，控制這個(gè)特別細(xì)菌的抗生素已變得無(wú)效。此病每年奪去三百萬(wàn)人的性命，據(jù)加拿大細(xì)菌疾病網(wǎng)絡(luò)主任麥科克報(bào)道，目前約有種重要病菌已有抗藥性，由于抗藥病原菌的蔓延，新病原菌的出現(xiàn)以及癌癥和心血管病的增加，尋找新活性物質(zhì)成了當(dāng)務(wù)之急。 一、 微生物的篩選微生物

17、的篩選 根據(jù)生態(tài)學(xué)的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)去尋找特定功根據(jù)生態(tài)學(xué)的知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)去尋找特定功能或活性的代謝物及其生產(chǎn)者能或活性的代謝物及其生產(chǎn)者微生物，微生物，是一種較為成功的做法。是一種較為成功的做法。當(dāng)人們發(fā)現(xiàn)一些咸水蝦的卵子被真菌感染，而另一些蝦卵卻保持完好時(shí)，開(kāi)始從無(wú)感染的卵子上找原因，研究者相信，卵子不被感染應(yīng)該歸功于抗真菌的物質(zhì)，結(jié)果在完好的卵子表面發(fā)現(xiàn)一種細(xì)菌，從該細(xì)菌果真找到一種抗真菌代謝物； 另外，從熱泉中尋找耐熱菌，從這些菌中尋找熱穩(wěn)定的酶；從日光曝曬的海邊巖石找到抗紫外線(xiàn)的藍(lán)細(xì)菌，并從中找到抗紫外物質(zhì)，從健康的植物中找到產(chǎn)生植物保護(hù)劑的內(nèi)生菌，從污染的港灣獲得農(nóng)藥降解菌，并從中發(fā)現(xiàn)有關(guān)酶

18、和基因；從海洋動(dòng)、植物表面尋找防腐物質(zhì)或微生物。所有這些做法已證明是成功的。 然而，不是說(shuō)上述微生物中不可能發(fā)現(xiàn)對(duì)人類(lèi)疾病治療有效的藥物，相反，對(duì)人類(lèi)有用的化合物可以在很多環(huán)境分離的微生物中找到，只要應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮Y選模型或方法就有可能獲得特定生理活性的化合物。在抗生素發(fā)現(xiàn)后的最初20年，除了抗生素外很少報(bào)道微生物中發(fā)現(xiàn)有其他藥理活性化合物；然而，近20年，越來(lái)越多的具有各種各樣抗病活性的微生物代謝物被發(fā)現(xiàn)，這一發(fā)展應(yīng)該歸功于新的篩選思路和模型的建立。二、代謝物生物活性的篩選二、代謝物生物活性的篩選 從龐大的微生物群體中尋找特定活性化合物最好首先對(duì)微生物進(jìn)行篩選，第一步是選擇微生物存在的環(huán)境基質(zhì)，

19、根據(jù)生物學(xué)和生態(tài)學(xué)的知識(shí)，確定采樣的環(huán)境和材料，第二步對(duì)獲得的菌株進(jìn)行初篩，選出有可能獲得目標(biāo)產(chǎn)物的菌株；第三步，從選出的菌株中分離代謝物。第四步，對(duì)所得代謝物，再進(jìn)行篩選。 生物活性的篩選方法各式各樣，篩選效率直接與試驗(yàn)的設(shè)計(jì)有關(guān)，靶標(biāo)越明確，越有可能獲得特定活性的產(chǎn)物，因此如果對(duì)病理和藥理方面有越深入越具體的了解，就越有利于篩選。三、常用的活性篩選方法 1）抗菌活性）抗菌活性 一種最簡(jiǎn)單的測(cè)試方法，稱(chēng)生長(zhǎng)抑制法，常用于抗菌活性檢測(cè)。很多抗生素是這樣篩選的。樣品被置于無(wú)菌濾紙上，濾紙先被置于接有目標(biāo)菌的固態(tài)培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)后觀(guān)察和測(cè)量生長(zhǎng)抑制圈的大小。 2）對(duì)動(dòng)物的影響活性）對(duì)動(dòng)物的影響活性

20、 （1）對(duì)動(dòng)物幼體的定殖或變態(tài)的抑制）對(duì)動(dòng)物幼體的定殖或變態(tài)的抑制 環(huán)節(jié)動(dòng)物、鮑魚(yú)以及咸水蝦的幼體可用于檢測(cè)樣品對(duì)動(dòng)物的毒性或其它影響，通常把多個(gè)幼體置于樣品液中，然后觀(guān)察對(duì)致死性或?qū)ψ儜B(tài)過(guò)程、定殖效果，蟲(chóng)室形成等方面的影響。 （2）對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物運(yùn)動(dòng)的影響）對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物運(yùn)動(dòng)的影響 在加有樣品的溶液中，如果一個(gè)飼養(yǎng)著的水?；蚱渌鼊?dòng)物的附肢總是保持收縮狀態(tài)，可認(rèn)為是遇到了有毒性的代謝物。 （3）金魚(yú)毒性試驗(yàn)）金魚(yú)毒性試驗(yàn) 樣品對(duì)小金魚(yú)的影響，可表現(xiàn)為致死，或失去平衡等。 （4）通過(guò)器官和生理系統(tǒng)檢測(cè)：可檢測(cè)對(duì)心臟、對(duì)血壓、對(duì)肌肉等的作用活性。 3）細(xì)胞水平篩選）細(xì)胞水平篩選 樣品可通過(guò)對(duì)各種細(xì)胞株

21、影響，而得到評(píng)價(jià)。對(duì)某些腫瘤細(xì)胞株的抑制活性是最常用的評(píng)價(jià)內(nèi)容。 4）酶抑制劑篩選法）酶抑制劑篩選法 在病理學(xué)和生物化學(xué)研究中，已對(duì)多種疾病的成因有所了解，有些情況，已經(jīng)知道引起疾病的具體生物化學(xué)異常，即已確定生化途徑中那一步驟發(fā)生了差錯(cuò)，而在很多情況下是由某一種酶活性的增強(qiáng)或減弱所導(dǎo)致的。 已經(jīng)知道多種病癥因?yàn)樘囟富钚缘脑鰪?qiáng)而引起的。這樣以該酶為靶標(biāo)篩選抑制劑，將使獲得適用的活性代謝物的可能性大大增加。這是一種針對(duì)具體靶標(biāo)分子的篩選方法，比起應(yīng)用整個(gè)動(dòng)物或整個(gè)細(xì)胞作為試驗(yàn)標(biāo)靶有其優(yōu)越之處。 應(yīng)用酶抑制劑篩選法，可以獲得具體抗腫瘤、抗血栓、抗糖尿病、抗病毒、抗炎癥以及降血脂、降血壓等活性代謝

22、物。 抗腫瘤活性篩選的靶酶抗腫瘤活性篩選的靶酶有DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、芳香酶、法尼基轉(zhuǎn)移酶、蛋白激酶等。 抗血栓形成活性抗血栓形成活性篩選的靶酶篩選的靶酶包括凝血酶，血小板活化因子?；D(zhuǎn)移酶等。 抗病毒活性抗病毒活性篩選的靶酶篩選的靶酶有蛋白酶、復(fù)制有關(guān)的酶等。 抗糖尿病抗糖尿病活性篩選的靶酶活性篩選的靶酶有醛糖還原酶等。 抗炎癥抗炎癥活性篩選的靶酶活性篩選的靶酶有溶磷脂酶，磷酸脂酶A2，脂氨酶等。 抗神經(jīng)退化抗神經(jīng)退化活性篩選的靶酶活性篩選的靶酶有乙酰膽堿酯酶（需要同時(shí)篩選對(duì)丁酰膽堿酯酶不抑制的活性）。 降血脂降血脂活性的篩選靶酶活性的篩選靶酶有鯊烯合成酶，脂酰輔酶A膽固醇酰轉(zhuǎn)移酶（ACAT）。

23、-羥基-甲基戊二酰輔酶A（HMG-COA）等。 降血壓降血壓活性的篩選靶酶活性的篩選靶酶有腎上腺素合成酶，內(nèi)皮質(zhì)素轉(zhuǎn)換酶等。 5）免疫調(diào)節(jié)活性代謝物的篩選法）免疫調(diào)節(jié)活性代謝物的篩選法 免疫調(diào)節(jié)活性物為增強(qiáng)活性和抑制活性，在醫(yī)學(xué)上分別有其重要應(yīng)用?？赏ㄟ^(guò)皮膚注射反應(yīng)觀(guān)察樣品對(duì)抗原免疫反應(yīng)的增強(qiáng)或抑制作用，也可在體外應(yīng)用淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫試驗(yàn)。 6）受體拮抗活性篩選）受體拮抗活性篩選 每一生化反應(yīng)系統(tǒng)，需要受到嚴(yán)密的機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，信號(hào)分子往往需要與受體分子結(jié)合而起動(dòng)某一生理、生化過(guò)程。如樣品能與受體親和結(jié)合即與正常信號(hào)分子產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)從而抑制該生化過(guò)程。 用于抗腫瘤活性篩選的受體包括非甾體類(lèi)雌激素受體

24、或雄激素受體等； 用于抗血栓活性篩選的受體包括纖維蛋白原受體； 用于降血壓活性篩選的受體包括內(nèi)皮素受體、血管緊張素受體。四、微生物代謝產(chǎn)物的作用機(jī)制 1、微生物代謝產(chǎn)物的作用機(jī)制研究、微生物代謝產(chǎn)物的作用機(jī)制研究 微生物代謝產(chǎn)物作用的靶分子通常是一些生物大子，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)，但也可以是小分子代謝物如酶反應(yīng)底物或膜組分。藥物能夠起作用，不但要求能夠作用于靶分子，還應(yīng)該能夠以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)入宿主體內(nèi)，并有效分布；能夠進(jìn)入病理細(xì)胞，或進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)積累。為了闡明一種藥物的作用機(jī)制，需要一系列的實(shí)驗(yàn)。根據(jù)研究的水平，可以將這些實(shí)驗(yàn)分為三類(lèi)。 (1）完整細(xì)胞水平）完整細(xì)胞水平 一個(gè)非常有用的方

25、法是在敏感細(xì)胞的培養(yǎng)物中，添加待測(cè)藥物，然后觀(guān)察藥物對(duì)大分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、肽聚糖等合成的影響。利用添加放射性標(biāo)記的特異性前體利用添加放射性標(biāo)記的特異性前體，可以對(duì)這些合成過(guò)程進(jìn)行跟蹤，如用標(biāo)記的胸苷示蹤DNA的合成，尿苷示蹤RNA的合成，苯丙氨酸(或其他氨基酸)示蹤蛋白質(zhì)的合成，乙酰葡萄糖胺示蹤肽聚糖的合成等。 每隔一段時(shí)間測(cè)定攙入相應(yīng)大分子中的放射性強(qiáng)弱作為合成速率的指標(biāo)，以此判斷該大分子合成被抑制的程度。但由于細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的任何一種大分子的合成抑制或終止都將會(huì)影響其他所有細(xì)胞的功能，因此，要確定原初的抑制效應(yīng)靶，必須連續(xù)觀(guān)察各種事件和時(shí)間過(guò)程，通常最先觀(guān)察到的便是原初反應(yīng)。

26、2)部分純化的無(wú)細(xì)胞體系部分純化的無(wú)細(xì)胞體系 一旦確定了藥物的原初效應(yīng)，接著就必須闡明藥物干擾的以下過(guò)程；前體物合成或酶的激活；參與的酶或細(xì)胞器；決定前體物攙入聚合物的信號(hào)系統(tǒng)等。 要進(jìn)行這類(lèi)研究，需要制備部分純化的細(xì)胞抽提物。細(xì)胞提取物中含有多個(gè)酶系統(tǒng)，能夠?qū)误w聚合成為大分子。目前能夠制備的無(wú)細(xì)胞體系包括體外合成蛋自質(zhì)、核酸或肽聚糖等。 (3)純化的酶系統(tǒng)純化的酶系統(tǒng) 在多酶反應(yīng)體系中，每一種成分都可能成為藥物的作用靶。有時(shí)，通過(guò)放射化學(xué)法或檢測(cè)蛋白質(zhì)色譜變化或蛋白質(zhì)電泳遷移率的變化，可以鑒定出與藥物結(jié)合的靶蛋白。還可以從耐藥的細(xì)胞中分離出突變的靶蛋白，進(jìn)一步將原始細(xì)胞株中的靶蛋白用突變的

27、組分替代后構(gòu)建重組系統(tǒng)，根據(jù)藥物抑制作用的消失與否確定靶蛋白中與藥物活性相關(guān)的組分。 藥物作用機(jī)制的專(zhuān)一性是選擇藥物的主要因素，藥物應(yīng)盡量滿(mǎn)足對(duì)病有效而對(duì)宿王沒(méi)有毒性或低毒。但藥物通常不但對(duì)病原體表現(xiàn)活性，對(duì)其他生物系統(tǒng)也司以有明顯活性。 例如，利福霉素不但可以抑制結(jié)核菌的生長(zhǎng)，還具有降低膽固醇的功效；紅霉素不但能夠抑菌，還能促進(jìn)胃腸的蠕動(dòng)；瑞斯西丁素(Ri stocetin)不但可用于治療葡萄球菌的感染，還有促進(jìn)血小板凝集作用等。藥物的這些活性與藥物的醫(yī)療作用機(jī)制無(wú)關(guān)，并目大多數(shù)的這類(lèi)副作用是有害的?？梢酝ㄟ^(guò)篩選藥物的新類(lèi)似物或化學(xué)半合成衍生修飾，減弱或消失副作用，同時(shí)保持相應(yīng)的藥療活性不變

28、。 另一方面，同一個(gè)生物活性不但對(duì)病原細(xì)胞有效，對(duì)宿主細(xì)胞或系統(tǒng)也同樣會(huì)有效。如洛伐他訂(lovastatin, mevinolin)或美伐他訂(mevastatin，compactin)藥物的作用即是如此，這兩種化合物通過(guò)抑制類(lèi)異戊二烯的生物合成而具有殺真菌活性，在應(yīng)用于人膽固醇治療上也是有效的。類(lèi)似的情況如環(huán)孢菌素(Cyclosporin)A和FK506。這些免疫抑制劑能夠抑制具有肽基脯氨酰(peptidylproly1)同工酶活性的酶，在器官移植中廠(chǎng)泛使用，同時(shí)，這些微生物代謝物與真菌碎相應(yīng)酶的結(jié)合則會(huì)尋致對(duì)微生物有毒的復(fù)雜毒素的形成。 2、微生物代謝產(chǎn)物的作用類(lèi)型、微生物代謝產(chǎn)物的作用

29、類(lèi)型 根據(jù)藥物作用的靶位，可以將微生物藥物的作用分成如下幾種類(lèi)型。 (1)細(xì)胞壁抑制劑細(xì)胞壁抑制劑 細(xì)胞壁抑制劑可以分成兩類(lèi)：細(xì)菌細(xì)胞壁合成抑制劑和真菌細(xì)胞壁合成抑制劑。細(xì)菌細(xì)胞壁的組成主要是肽聚糖，這也是細(xì)菌與其他種類(lèi)生物的主要區(qū)別之一。因此，抑制肽聚糖的合成是絕大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞壁合成抑制劑的作用機(jī)制，如青霉素、頭孢菌素等； 此外也有一部分細(xì)胞壁抑制劑是作用于細(xì)胞壁其他成分的合成或組裝的。 因此這類(lèi)藥物通常對(duì)于靜止細(xì)胞(如袍子等)沒(méi)有作用。 此外，某些原核生物的細(xì)胞，如支原體、L-型細(xì)菌和原生質(zhì)體缺乏細(xì)胞壁，細(xì)胞壁抑制劑對(duì)它們是沒(méi)有作用的。在古菌的細(xì)胞壁中由于缺少肽聚糖類(lèi)多聚物，也對(duì)-內(nèi)酰胺類(lèi)

30、藥物不敏感。 根據(jù)真菌的細(xì)胞壁的組成，可以將真菌細(xì)胞壁合成抑制劑分為兩類(lèi)，一類(lèi)是作用于幾丁質(zhì)合成過(guò)程的多氧菌素和曰光菌素，其中，日光菌素對(duì)絲狀真菌作用特別強(qiáng)；另一類(lèi)是作用于葡聚糖合成的黑諾殺菌素和泊布拉殺菌素僅對(duì)酵母類(lèi)細(xì)胞有活性，尤其是白色念珠菌。 (2)細(xì)胞膜功能抑制劑細(xì)胞膜功能抑制劑 在生物細(xì)胞膜中，主要組分是蛋白質(zhì)和類(lèi)脂物質(zhì)，另有少量的糖和微量的核酸類(lèi)物質(zhì)。類(lèi)脂類(lèi)物質(zhì)在不同生物中是不同的，細(xì)菌的細(xì)胞膜中不舍有膽固醇；真菌的細(xì)胞膜主要含有麥角甾醇；哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜上主要含有膽固醇。作用于細(xì)胞膜的藥物主要有兩種，一種是破壞細(xì)胞膜的超分子結(jié)構(gòu)，如制霉菌素、灰黃霉素、兩性霉素B等；另一種作用于特

31、異離子運(yùn)載體(離子通道)，如特異性抑制K+、Na+等一價(jià)陽(yáng)離子運(yùn)輸?shù)睦i氨每素、聚醚類(lèi)抗生素等。 (3)核酸合成抑制劑核酸合成抑制劑 這類(lèi)藥物通常是核苷酸類(lèi)似物，如5-溴尿嘧啶、蟲(chóng)草菌素等。由于該類(lèi)物質(zhì)的作用不僅僅針對(duì)病原體，因此其毒性相對(duì)也較大。核酸合成抑制劑可以作用于核苷酸前體的合成，如重氮絲氨酸、殺腺癌菌素、阿洛酮糖素等，也可以是作用于核苷酸聚合的，如放線(xiàn)菌素、絲裂霉素C、利福霉素等。 (4)蛋白質(zhì)合成抑制劑蛋白質(zhì)合成抑制劑 這類(lèi)化合物的作用靶位通常是蛋白質(zhì)合成過(guò)程和蛋白質(zhì)合成的載體核糖體。蛋白質(zhì)合成抑制物的一般特性是：藥物對(duì)蛋白質(zhì)合成的短暫抑制會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；藥物對(duì)蛋白質(zhì)合成的阻斷將對(duì)其

32、他大分子合成造成復(fù)雜的影響；所有的生物體的蛋白質(zhì)合成過(guò)程或多或少有相同之處。抑制蛋白質(zhì)合成的化合物有作用于氨酰tRNA形成的吲哚霉素、疏螺體素、呋喃霉素等，有作用于蛋白質(zhì)合成過(guò)程的鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、林肯霉素、嘌呤霉素等。 (5)能量代謝抑制劑能量代謝抑制劑 真核生物和原核生物的氧化磷酸化系統(tǒng)是不一樣的，細(xì)菌在質(zhì)膜上送行，并且隨著種屬不同而不同；而真核生物的氧化磷酸化是在線(xiàn)粒體中進(jìn)行。抑制能量代謝的藥物有作用于細(xì)胞色素b和細(xì)胞色素c1電子傳遞的抗霉素A，電子傳遞和磷酸化的解偶聯(lián)劑短桿菌肽s，線(xiàn)粒體ATP酶抑制劑寡霉素等。 (6)抗代謝物藥物抗代謝物藥物 這類(lèi)藥物主要是初級(jí)代謝物的拮抗物。如氨基酸的拮抗劑重氮絲氨酸、殺腺癌菌素，核苷酸類(lèi)似物狹霉素A、狹霉素c，維生素拮抗劑等。 (7)免疫調(diào)節(jié)劑免疫調(diào)節(jié)劑 免疫調(diào)節(jié)劑分免疫增強(qiáng)劑和免疫抑制劑兩種。前者如二