組織化學(xué)技術(shù)教程2ppt課件

1、第三章第三章 組織化學(xué)的基本技術(shù)組織化學(xué)的基本技術(shù) 組織化學(xué)發(fā)展到今天，它的技組織化學(xué)發(fā)展到今天，它的技術(shù)多而復(fù)雜，但基本技術(shù)是容易掌術(shù)多而復(fù)雜，但基本技術(shù)是容易掌握的。從樣品的取材、固定劑的選握的。從樣品的取材、固定劑的選擇、切片的制備、孵育反應(yīng)、各種擇、切片的制備、孵育反應(yīng)、各種溶液的配制以及光鏡組織化學(xué)技術(shù)溶液的配制以及光鏡組織化學(xué)技術(shù)和電鏡組織化學(xué)技術(shù)等，每項技術(shù)和電鏡組織化學(xué)技術(shù)等，每項技術(shù)都有明確的要求和規(guī)范的操作程序。都有明確的要求和規(guī)范的操作程序。進行沒項工作，應(yīng)事先做好準備，進行沒項工作，應(yīng)事先做好準備，按技術(shù)程序進行，可做一定的預(yù)備按技術(shù)程序進行，可做一定的預(yù)備實驗，效果穩(wěn)

2、定后，再開始實驗研實驗，效果穩(wěn)定后，再開始實驗研究，這樣才能達到預(yù)期的科研效果。究，這樣才能達到預(yù)期的科研效果。一、樣品的取材樣品制備的第一步就是取材，取材的好壞關(guān)系到實驗的結(jié)果。所以必須做好準備工作。如取材的器材；動物標本準備，一般輕微麻醉，迅速取材為好?，F(xiàn)將取材的原則和具體要求分述如下：刀剪銳利、干凈。快速、準確、盡量保持生活狀態(tài)，力爭1分鐘之內(nèi)放入固定液，最遲不能超過3分鐘。要清楚取材的部位和內(nèi)部，對病理組織還應(yīng)做到以下幾點：材部位必須是主要病變區(qū)。必須取病灶與正常組織的交界區(qū)必要時取遠離病灶的正常組織做對照。 一刀切取，切取應(yīng)在蠟版或濾紙上進行， 避免拉鋸、牽拉或擠壓等動作。 低溫操作

3、，防止自溶現(xiàn)象，通常以0-4 的低溫條件下操作為佳。 定位準確，取材時必須注意樣品的定向和 定位，即頭、尾、左、右以及上、下方向。 切好的樣品貼放在濾紙片上，標記好定向標 志，防入預(yù)冷固定液內(nèi)，或冰凍切片或短時 間冷凍保存。 樣品大小適當，光鏡樣品一般在1.0cm以內(nèi)， 免疫組織化學(xué)樣品大約在 : 2cm1.5cm0.3cm厚度控制在0.3cm。 電鏡樣品規(guī)格要求切成0.5-1.0cm3小塊。 二、二、 固定固定 1 1固定的目的要求固定的目的要求 固定是將組織盡可能保持原有生活狀態(tài)以固定是將組織盡可能保持原有生活狀態(tài)以 適用于某些研究程序的一種方法。固定有適用于某些研究程序的一種方法。固定有

4、 如下幾方面的目的。如下幾方面的目的。 不僅保持組織生前的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還要保持不僅保持組織生前的形態(tài)結(jié)構(gòu)，還要保持 結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分和活性。結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分和活性。 促使組織凝固、硬化，保持一定的形狀、促使組織凝固、硬化，保持一定的形狀、 體積。體積。 增加媒染作用，便于染色；增加折光率，增加媒染作用，便于染色；增加折光率， 便于觀察。便于觀察。 殺死活細胞或活組織，以進行組織化學(xué)反 應(yīng)。由于固定的上述目的要求，許多良好 的組織學(xué)固定液，卻不能用于組織化學(xué)標 本，特別是酶組織化學(xué)標本和免疫組織化 學(xué)標本。2固定劑的選擇 用于組織化學(xué)的固定劑有很多種，一 般可分為單純固定劑和混合固定劑兩大類。 所有的

5、組織化學(xué)標本固定必須根據(jù)其性質(zhì)及 所進行的組織化學(xué)反應(yīng)選擇適當?shù)墓潭▌?常用組織化學(xué)固定劑舉例如下： 醛類固定劑：甲醛、戊二醛；中性 福爾馬林，多聚甲醛等。 非醛類：丙酮、酒精、Zenkers液 和Carnoy氏液等等。 應(yīng)用固定劑時應(yīng)查閱有關(guān)的文獻資 料，對前人未做的方法應(yīng)慎用。固 定劑穿透組織的速率有很大特異性， 不同的固定液其穿透組織速率可有明 顯的不同穿透因子不同）： t = kde t=時間；d=組織深度； k、e為穿透因子常數(shù)）3 3 固定的方法固定的方法 原位固定法原位固定法 原位固定法是在保持動物對其器官組織血原位固定法是在保持動物對其器官組織血液供應(yīng)的條件下，邊解剖邊向所取

6、樣本的部液供應(yīng)的條件下，邊解剖邊向所取樣本的部位滴加預(yù)冷的固定液的一種方法。這種方法位滴加預(yù)冷的固定液的一種方法。這種方法有益于組織細胞酶活性和結(jié)構(gòu)的保存，不足有益于組織細胞酶活性和結(jié)構(gòu)的保存，不足之處是對動物刺激時間較長，因此應(yīng)快速取之處是對動物刺激時間較長，因此應(yīng)快速取樣，斷頭處死動物。樣，斷頭處死動物。 浸透固定法浸透固定法 浸透固定法是將組織塊浸泡在固定液內(nèi)而浸透固定法是將組織塊浸泡在固定液內(nèi)而固定的一種方法。在組織化學(xué)樣品的處理上，固定的一種方法。在組織化學(xué)樣品的處理上，對浸透的時間、溫度有一定的要求，特別是對浸透的時間、溫度有一定的要求，特別是免疫組織化學(xué)樣品的要求更嚴一些。免疫組

7、織化學(xué)樣品的要求更嚴一些。 灌流故定法灌流故定法 灌流故定法是通過血管的途徑，將固定灌流故定法是通過血管的途徑，將固定液灌注到所要固定的器官組織內(nèi)，將生活的液灌注到所要固定的器官組織內(nèi)，將生活的細胞在原位及時的固定后，在摘取樣品的方細胞在原位及時的固定后，在摘取樣品的方法。這種方法的特點是：快速、固定充分，法。這種方法的特點是：快速、固定充分，但是對固定液的溫度、壓力及取材時間有嚴但是對固定液的溫度、壓力及取材時間有嚴格的要求。格的要求。 培養(yǎng)細胞和外周血細胞固定法培養(yǎng)細胞和外周血細胞固定法 培養(yǎng)細胞核外周血細胞的固定方法比較特培養(yǎng)細胞核外周血細胞的固定方法比較特殊，對培養(yǎng)細胞通常取蓋片入殊，

8、對培養(yǎng)細胞通常取蓋片入37的的 Hanks液中，漂洗兩次液中，漂洗兩次(每次每次35min)，洗除血清，洗除血清后，再置于甲醛緩沖固定液內(nèi)后，再置于甲醛緩沖固定液內(nèi)1030min。.如果進行電鏡觀察就以如果進行電鏡觀察就以2%戊二醛固定或采戊二醛固定或采取雙重固定法。取雙重固定法。外周血通常采用涂片，以甲醛緩沖固定液固定。電鏡酶組化則須離心沉淀后，用戊二醛固定具體法見第4，5，6章）。4固定后的處理漂洗已固定的組織樣品，在切片之前必須進行漂洗，其主要目的是洗去組織中存余的固定液。這樣做有助于酶活性的提高，可避免樣品下一步和其它液相的液體接觸，引起組織的結(jié)構(gòu)改變和酶活性的降低，漂洗要求最適的PH

9、值、滲透壓、溫度和時間來進行,否則會影響試驗的結(jié)果。三三 組織切片技術(shù)組織切片技術(shù) 一般的組織化學(xué)染色切片厚度一般的組織化學(xué)染色切片厚度要求在要求在57 m左右，神經(jīng)組織切左右，神經(jīng)組織切片的厚度要求比較特殊，一般在片的厚度要求比較特殊，一般在20100 m之間，以便觀察神經(jīng)之間，以便觀察神經(jīng)纖維的走行。對于不同的組化反應(yīng)纖維的走行。對于不同的組化反應(yīng)在切片制作上有不同的要求。目前在切片制作上有不同的要求。目前的切片技術(shù)主要有：冰凍切片、石的切片技術(shù)主要有：冰凍切片、石蠟切片、超薄切片電鏡學(xué)）。蠟切片、超薄切片電鏡學(xué)）。 1冰凍切片冰凍切片 冰凍切片是酶組織化學(xué)和免疫冰凍切片是酶組織化學(xué)和免疫

10、組織化學(xué)最常用的方法。它的突出組織化學(xué)最常用的方法。它的突出特點：能比較好地保存組織的酶活特點：能比較好地保存組織的酶活性，較完好地保存組織抗原的免疫性，較完好地保存組織抗原的免疫活性?；钚?。 驟冷驟冷Quenching） 1驟冷的目的驟冷的目的 最主要的目的是防止標本內(nèi)的水結(jié)成最主要的目的是防止標本內(nèi)的水結(jié)成 冰晶冰晶破壞標本結(jié)構(gòu)。破壞標本結(jié)構(gòu)。 殺死組織細胞）。殺死組織細胞）。 快捷制片?？旖葜破?。 2驟冷的方法驟冷的方法 一般可以用四種方法驟冷，應(yīng)根據(jù)實一般可以用四種方法驟冷，應(yīng)根據(jù)實驗室條件選擇。驗室條件選擇。 Chayen氏驟冷法氏驟冷法 （目前常用的驟冷法（目前常用的驟冷法之一）之

11、一） 液氮法液氮法 (也是常用的驟冷方法之一也是常用的驟冷方法之一) 凍干燥法抽干組織中的水分）凍干燥法抽干組織中的水分） 冷凍替代法置換組織中的水分）冷凍替代法置換組織中的水分） 切片切片 驟冷后的組織塊切片機上切片，目前的驟冷后的組織塊切片機上切片，目前的 切片機有兩類：切片機有兩類：1開放式冰凍切片機半導(dǎo)體制冷切片機、開放式冰凍切片機半導(dǎo)體制冷切片機、 甲醇制冷切片機及老式甲醇制冷切片機及老式CO2、氯乙烷等切片、氯乙烷等切片 機）。開放式冰凍切片機由于暴露于空氣機）。開放式冰凍切片機由于暴露于空氣 中，溫度不易控制，技術(shù)難度大，現(xiàn)多已中，溫度不易控制，技術(shù)難度大，現(xiàn)多已 淘汰。淘汰。2

12、恒溫冰凍切片機恒溫冰凍切片機Cryastat）常用常用 恒溫冰凍切片機切片后如不染色，必須冷恒溫冰凍切片機切片后如不染色，必須冷 風吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)或短暫預(yù)固定風吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)或短暫預(yù)固定 后，冰箱貯存。后，冰箱貯存。 2 石蠟切片石蠟切片常規(guī)石蠟切片、常規(guī)石蠟切片、HE染色程序：染色程序： 取材取材 固定固定 脫水：升梯度酒精脫水脫水：升梯度酒精脫水 50%70%80%90%95%100% 34h 1.5h 透明：用二甲苯、觀察組織塊至透明透明：用二甲苯、觀察組織塊至透明 為止為止0.51h，共兩次），共兩次） 浸蠟：一般用兩個蠟缸。石蠟浸蠟：一般用兩個蠟缸。石蠟（ 601h

13、；石蠟；石蠟（60）2 h。 包埋：鐵板架包埋或其他容器，有時要求快速冷卻。切片和貼片：在切片機上切片，置水槽中展片、撈片和貼片。染色HE染色步驟：1）二甲苯510分鐘，脫去切片中的石蠟。2降濃度梯度酒精脫水（100%95%90%80%70%）。每級脫水23分鐘以除二甲苯。3）蒸餾水洗，去乙醇1030分鐘。4）蘇木精，染細胞核，23分鐘。5）0.5%鹽酸酒精分化數(shù)秒。6）流水沖洗，3040分鐘。7）入伊紅23分鐘，細胞染成粉紅色。8）水洗，去浮色，數(shù)秒。9）升梯度酒精脫水（70%80%90%95%100%），每級35分鐘。10）二甲苯10分鐘，使標本透明。11）封固。酶組化和免疫組化與常規(guī)石蠟

14、切片略有不同：脫水透明應(yīng)在4下進行，以盡量減少酶和抗原的損失。組織塊：2cm1.5cm0.3cm。以充分脫水、透明、浸蠟浸蠟、包埋：60，軟蠟為佳。 四、孵育反應(yīng)四、孵育反應(yīng) 1 1 配制孵育液的要求配制孵育液的要求 清洗器具，過酸沖洗。清洗器具，過酸沖洗。 現(xiàn)用現(xiàn)配，保持新鮮?，F(xiàn)用現(xiàn)配，保持新鮮。 嚴格配比，保持平衡。嚴格配比，保持平衡。 防止污染，過濾為佳。防止污染，過濾為佳。 優(yōu)選試劑，注意純度。優(yōu)選試劑，注意純度。 2 2 孵育的溫度和時間孵育的溫度和時間 溫度對酶細胞化學(xué)反應(yīng)影響很大，溫度對酶細胞化學(xué)反應(yīng)影響很大，一般孵育的溫度有一般孵育的溫度有3737（溫箱）；（溫箱）；15152020（室溫；（室溫；0 044可延長時間，可延長時間，一般為幾個小時乃至過夜。最佳條件一般為幾個小時乃至過夜。最佳條件要根據(jù)所用樣品的種類以及固定的不要根據(jù)所用樣品的種類以及固定的不同條件而定，因此應(yīng)借鑒前人的經(jīng)驗同條件而定，因此應(yīng)借鑒前人的經(jīng)驗安排預(yù)實驗。安排預(yù)實驗。3 3孵育的方法孵育的方法 常