基因工程所需的基本條本

1、基因工程所需的基本條本基因工程操作過程第1頁/共203頁 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶(如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNA聚合酶等)作為工具對基因進行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶”。第2頁/共203頁 一類來源于原核生物的，能夠識別雙鏈DNA分子中某種特定核苷酸序列（回文序列，48bp），并切割DNA雙鏈,使磷酸二酯鍵斷開的核酸內(nèi)切酶。 1.定義第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction endonuclease ）第3頁/共203頁II型限制性內(nèi)切酶：同型二聚體結(jié)構(gòu)與DNA雙鏈結(jié)合，兩個催化Mg2+與DNA裂解位點相鄰限制性內(nèi)切酶EcoR

2、I的結(jié)構(gòu)第4頁/共203頁 （2）修飾（Modification）細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護,不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割。2、細菌的限制和修飾系統(tǒng)（R/M體系）（1）限制（Restriction）限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷。第5頁/共203頁研究發(fā)現(xiàn)，限制-修飾系統(tǒng)廣泛存在在原核細菌中，與三個連鎖基因相關(guān)：Genes for restriction-modification enzymes are often clustered together in a region called an immigration control region.

3、The immigration island from E. coli K-12 is about 14 Kbp. 第6頁/共203頁噬菌體DNA進入細菌后，其基因組DNA被降解第7頁/共203頁3、類型分類的主要依據(jù)： 亞單位組成 識別序列的種類 是否需要輔助因子 分三類(I, II ,III) 第8頁/共203頁第9頁/共203頁 （1）酶結(jié)構(gòu)三亞基，包括：R（限制酶亞基）；M（甲基化酶亞基）；S（識別DNA序列亞基）（2）切割位點切割位點在識別位點1000 bp以外，無特異性4、I型限制性內(nèi)切酶首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年從大腸桿菌 B株和 K株分離的，如 E

4、coB和 EcoK，研究較少。Recognize sitecut1-1.5kb第10頁/共203頁（3）結(jié)合方式 I類限制性內(nèi)切酶與DNA結(jié)合依賴M亞基與輔助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用。 第11頁/共203頁例子：EcoB的識別序列為T-G-A*-N8-T-G-C-TA-C-T-N8-A*-C-G-AEcoK的識別序列為A-A*-C-N8-G-T-G-CT-T-G-N8-C-A*-C-G第12頁/共203頁 2. II類限制性內(nèi)切酶(93%) （1）酶結(jié)構(gòu) 修飾和限制活性由分開的兩個酶(甲基化酶和限制性內(nèi)切酶)來完成，其中甲基化酶由一條肽鏈構(gòu)成，限制酶由相反方向結(jié)合的同源二聚體構(gòu)

5、成。 第13頁/共203頁 （2）識別序列 DNA雙鏈上的回文對稱序列（旋轉(zhuǎn)對稱序列，反向重復序列），一般長4-8bp ，與DNA的來源無關(guān)。 EcoR I： 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5EcoR V 第14頁/共203頁EcoR I 5EcoR I 5-GAATTC-3-GAATTC-3 3 3-CTTAAG-5-CTTAAG-5 Pst I 5Pst I 5-CTGCA-CTGCAG-3G-3 3 3-G-GACGTC-5ACGTC-5 產(chǎn)生粘性末端產(chǎn)生粘性末端EcoR V 5EcoR V 5-GAT-GATATC-3ATC-3 3 3-CTA-CTATAG-5TAG-5 產(chǎn)

6、生平齊末端產(chǎn)生平齊末端（3）切割位點識別位點處切開雙鏈DNA，形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。第15頁/共203頁幾種II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點Pst IProvindencia stuartii 164 CTGCAGGACGTCHaemophilus influenzae Rd 第16頁/共203頁（4）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）含有幾個核苷酸單鏈的末端分兩種類型： 5端凸出（如EcoR I切點）GAATTC CTTAA G G AATTC CTTAAG5-3 3-5 5-3 3-5 第17頁/共203頁EcoR

7、I等產(chǎn)生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OH POHP第18頁/共203頁Pst I等產(chǎn)生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-

8、C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火 4-7 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OH POHP第19頁/共203頁PvuII等產(chǎn)生的平頭末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 第20頁/共203頁粘性末端促進連接便利 i）不

9、同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補就可以連接。ii）同一個DNA分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。第21頁/共203頁第22頁/共203頁識別相同序列的限制性內(nèi)切酶稱同裂酶。 （5）同裂酶（Isoschizomers)同序同切酶（完全同裂酶）： 識別位點和切點完全相同。 如Hind 和Hsu I。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 第23頁/共203頁識別位點相同，但切點不同。 如Xma I 和 Sma I。 同序異切酶（不完全同裂酶）：Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sm

10、a I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 第24頁/共203頁 識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端的酶。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等 （6）同尾酶(Isocaudamers） 第25頁/共203頁 Sau 3A 同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別。BamH IBgl BamH IBgl Sau 3A第26頁/共203頁（7）DNA末端長度對限制酶切割的影響Pst IG GCTGCAGCTGCAGC C TGCATGCACTGCAGCTGCAGTGCA TGCA AAAACTGCAGCTGCAGAACCAAAACCAA0 10 90

11、0 10 90 EcoR I G GGAATTCGAATTCC C CGCGGAATTCGAATTCCG CG CCGCCGGAATTCGAATTCCGG CGG 90 90 90 90 90 90第27頁/共203頁（8）酶切反應條件緩沖液：MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強度 Tris-HCl： 維持pH； 二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定反應溫度：大多數(shù)為37反應時間：通常1h,許多酶延長反應時間可減少酶量終止酶切的方法：a、10mM/LEDTAb、加熱，大多數(shù)酶可用65溫育20分鐘失活C、苯酚抽提蛋白，然后用乙醇沉淀DNA第2

12、8頁/共203頁 一個酶單位（U）指：在理想的反應條件（適宜的緩沖液和反應溫度，通常為37）下，50L反應體系中完全降解1g DNA所需要的酶量。影響酶活性的因素很多，最重要的有：A DNA的純度和甲基化程度B 甘油的含量（不超過5%）C 反應體系中的離子強度D 反應體系的pH值F 反應的溫度條件（通常為37 ）Buffer (10X) 2.0 LWater 16.5 LDNA 1.0 LEnzyme 0.5 LVolume 20.0 L 酶單位的定義和影響酶活性的因素第29頁/共203頁酶 切 反 應 的 基 本 步 驟電泳紫外分析37 1h加反應液CKM1.0kb1.0kb0.4kb0.5

13、kb0.6kbCKMTT酶量的確定：2-3 倍才能保證完全消化；第30頁/共203頁（10）雙酶切反應1）對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切2）對鹽濃度要求不同的酶，也可采取同步雙酶切：選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。3）如果找不到一種可以同時適合兩種酶的緩沖液，就只能采用分步酶切。分步酶切應從反應要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢后再調(diào)整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然后加入第二種酶完成雙酶切反應。第31頁/共203頁第32頁/共203頁 3. III類限制性內(nèi)切酶（1%） 由R亞基和MS亞基二亞基組成雙功能酶，其中MS亞基具有位點識別和甲基化修飾雙重活性。在切割位點下

14、游24-26bp處，反應需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。 該類酶與DNA識別位點的結(jié)合嚴格依賴ATP。修飾作用和切割作用取決于兩個亞基之間的競爭。修飾作用在識別位點內(nèi)進行。切割序列位于識別位點一側(cè)若干堿基對處，無序列特異性。在基因工程操作中用途不大。 第33頁/共203頁EcoP15I M.EcoP15I 第34頁/共203頁1973年H.O Smith和D. Nathans提議的命名系統(tǒng)，命名原則如下： 三、限制性內(nèi)切酶的命名 1.用屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成3個字母的略語表示寄主菌的物種名。 大腸桿菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血

15、菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。2. 用一個大寫字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR。 3. 如果一種特殊的寄主菌內(nèi)有幾種不同的限制與修復系統(tǒng)，用羅馬字母表示。如EcoR I，EcoR V。第35頁/共203頁限制性核酸內(nèi)切酶的命名第36頁/共203頁四、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1. DNA的純度 DNA中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。 一般采取純化DNA，如用2.5倍體積的冰冷乙醇沉淀加大酶的用量 延長保溫時間 擴大反應體積（ 20l）第37頁/共203頁2.DNA的甲基化程度大腸桿菌一般有兩種甲基化酶修飾質(zhì)粒：da

16、m甲基化酶（修飾GATC中的A）； dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）?；蚬こ讨斜仨毷褂眉谆甘Щ钔蛔兊木辏〉?8頁/共203頁3. 溫度不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度不同。大多數(shù)是37 oC ，少數(shù)要求40-65 oC 。酶酶最適最適溫度溫度o oC C酶酶最適最適溫度溫度o oC C酶酶最適最適溫度溫度o oC CApa I Apa I Bcl I Bcl I Mae II Mae II 30 30 50 50 50 50 Apy I Apy I BstE II BstE II Mae IIIMae III30 30 60 60 5555Ban I Ban I Mae I M

17、ae I Sma ISma I50 50 45 45 2525第39頁/共203頁4. 緩沖液(Buffer)是影響限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。緩沖液的化學組成MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強度； Tris-HCl： 維持pH； 二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定； 第40頁/共203頁第二節(jié) 基因工程中常用的DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶 2. Klenow 片段3. T4 噬菌體DNA聚合酶4. T7 噬菌體DNA聚合酶 5. 反轉(zhuǎn)錄酶6.末端轉(zhuǎn)移酶第41頁/共203頁1. 共同特點把dNTPs

18、連續(xù)地加到引物的3OH端。2.主要區(qū)別持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。 如：T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個dNTPs就會從模板上解離下來。常用的DNA聚合酶的特點第42頁/共203頁1. 大腸桿菌DNA聚合酶 I（1）大腸桿菌DNA聚合酶I（DNA Pol I）的性質(zhì)一條多肽單鏈53 DNA聚合酶活性53外切酶活性，位于N端，用枯草桿菌蛋白酶處理可以切掉N端的53外切酶活性部分，就成為Klenow fragment 3 5外切酶活性。 第43頁/共203頁 底物： dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） M

19、g2+ 帶有3OH游離端的引物 DNA模板（2）DNA聚合酶I的反應條件-OH5 3 dNTPs第44頁/共203頁5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5 （3）DNA聚合酶I基本用途：制備32P標記的探針DNAase IDNA Pol IMg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（a-

20、32P-dATP）DNAase I：為一內(nèi)切核酸酶，它優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈DNA，形成單鏈切口 第45頁/共203頁2. Klenow fragment（1）Klenow fragment的性質(zhì)具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。DNA Pol I Klenow fragment (76KD） 枯草桿菌蛋白酶第46頁/共203頁 3端補平補平限制性內(nèi)切酶切后形成的3隱蔽端。5 5 klenow DNA 3末端標記在3隱蔽端加上放射性標記的dNTP。klenow（2）主要用途第47頁/共203頁3隱蔽末端的DNA片斷Klenow fragment補平根據(jù)

21、末端的順序選擇一種 a-32P-dNTPs末端標記的DNA 限制性內(nèi)切酶切5-G3 3-CTTAA5 5-GAA3 3-CTTAA5 5-GAATT3 3-CTTAA5 5-G3 3-CCTAG5 5-GG3 3-CCTAG5 5-GGATC3 3-CCTAG5 EcoR IBamH Ia-32P-dATPa-32P-dGTP25oC 1h第48頁/共203頁（1） T4 DNA聚合酶的性質(zhì)從T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化。有53聚合酶活性和35外切酶活性（約為Klenow 片段活性的200倍）。3. T4 DNA聚合酶用35外切酶活性作用于末端制造出3隱蔽端。再利用它的53聚合酶

22、活性補平，并加入放射性標記的dNTP。第49頁/共203頁5 5 3 3 5 5 3 3 T4 DNA聚合酶無dNTPsT4 DNA聚合酶有dNTPs5 5 當沒有dNTP時，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隱蔽端。當有dNTP時， T4DNA聚合酶行使53聚合酶功能，填平3隱蔽端。第50頁/共203頁5. 逆轉(zhuǎn)錄酶 依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導的DNA聚合酶），來源于RNA腫瘤病毒,最普遍使用的是來源于鳥類骨髓母細胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）。作用：以oligo dT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補結(jié)合），合成cDNA。

23、AAAAATTTTT5 3 mRNA 5 cDNA第51頁/共203頁不需要模板的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPs5 p3 HOOH 3 p 5 末端轉(zhuǎn)移酶Mg2+ dATP5 p3 HOAAAAAAAAAAAA OH3 p 5 6.末端轉(zhuǎn)移酶來源于小牛胸腺，是一種不依賴于模板的DNA聚合酶?？稍赾DNA或載體的3末端加同聚物尾巴，便于克隆。第52頁/共203頁一、連接酶1. 兩種DNA連接酶（1）大腸桿菌連接酶:只能連接粘性末端。（2）T4噬菌體的連接酶:不但能連接粘性末端,還能連接齊平末端。2. 連接條件（1）必須是兩條雙鏈DNA。 （2）DNA3端有游離的-OH,5端有一個磷酸基團。（3

24、）需要能量 動物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中: NAD+第三節(jié) 其它分子克隆工具酶第53頁/共203頁OHP3、功能：（1）修復DNA鏈上切口處的磷酸二酯鍵：T4-DNA連接酶5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5nick5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5第54頁/共203頁（2）連接多個平頭雙鏈DNA分子：5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P

25、-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 T4-DNA連接酶第55頁/共203頁4、 連接反應的溫度最佳溫度：連接酶反應的最佳溫度是37C。實用溫度：在37下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)定，所以一般采用 416 C。插入片段與載體的濃度比例： 1020倍（摩爾之比）目的：增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象。第56頁/共203頁DNA連接酶DNA連接酶的反應條件Tris-HCl50 - 100 mM pH 7.5MgCl210 mMATP0.5 - 1 mMDTT5 mMVolume10 - 20 ul4 - 15 4 - 16 hr

26、1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應條件下16 反應 1 小時，完全連接 1 g -DNA（Hind III片段）所需的酶量第57頁/共203頁 二、堿性磷酸酶1. 堿性磷酸酶種類從大腸桿菌中分離出來，具有抗熱性。Bacterial alkaline phosphatase，BAP（1）細菌性堿性磷酸酶（2）小牛腸堿性磷酸酶Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP從小牛腸中純化出來，SDS中加熱68oC可完全失活。第58頁/共203頁2. 堿性磷酸酶的特性催化脫掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。3 P-OH5 3 HO-P5 5 3 HO-OH5 3

27、 HO-OH堿性磷酸酶3. 堿性磷酸酶的功能（1）防止線性化的載體分子自我連接第59頁/共203頁單一酶切口的載體的粘性末端容易自我連接。AAGCTT TTCGAAHind酶切A-OH TTCGA-PP-AGCTT HO-A堿性磷酸酶5 5 5 第60頁/共203頁A-OH TTCGA-OHHO-AGCTT HO-AOH與OH不能形成磷酸二酯鍵，所以不能自我連接。但同一酶切后的外源DNA的5端有P，能與脫磷酸的載體OH連接。第61頁/共203頁ATTCGA AGCTT AAGCTTA A TTCGA 連接酶-OH與-OH連不住其中每條鏈上都有一個nick，但轉(zhuǎn)入細菌后會被修復。3 P-AGCT

28、TA-OH5 3 HO-ATTCGA-P5 外源DNA第62頁/共203頁四、核酸酶1、單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII） 大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+ExoVII35353535第63頁/共203頁2、雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）大腸桿菌的核酸外切酶 III 特異性地從3 端外切ExoIII3535Mg2+3535第64頁/共203頁Exo3535Mg2+3、雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶（ Exo） 核酸外切酶特異性地從5 端外切3535第65頁/共203頁4、單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶S1核酸酶的基本特性：來自稻谷曲霉菌（Aspergillus

29、 oryzae）降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍Zn2+必需最適pH范圍為4.0 - 4.3需要NaCl 10 - 300 mM降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍第66頁/共203頁一、載體的功能及特征1、定義：把目的基因通過運載工具送到受體細胞內(nèi)，這種運載工具就叫載體（vector)。2、載體的特征1）在宿主細胞內(nèi)必須能夠自主復制（具備復制起點）2）具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點，供外源DNA片斷插入，同時不影響復制3）有一定的選擇標記，用于篩選第四節(jié) 用于基因克隆的載體第67頁/共203頁質(zhì)粒載體（plasmid） 噬菌體載體（phage）動物病毒（viru

30、s） 噬菌粒載體考斯質(zhì)粒（cosmid） 人造染色體（artifical chromosome）第68頁/共203頁二、質(zhì)粒載體 質(zhì)粒（plasmid）：獨立于染色體以外的能自主復制的雙鏈、共價、閉合、環(huán)狀DNA分子,大小范圍在1kb-200kb以上不等。存在于細菌、霉菌、藍藻、酵母等細胞中。第69頁/共203頁致育質(zhì)粒，F(xiàn)質(zhì)粒（fertility plasmid），編碼有性生殖功能，帶有F質(zhì)粒的細菌為雄性菌，能長出性菌毛，無F質(zhì)粒的細菌為雌性菌，無性菌毛。 耐藥性質(zhì)粒編碼細菌對抗菌藥物或重金屬鹽類的耐藥性，耐藥性質(zhì)粒分為二類，其中可以通過細菌間的接合進行傳遞的稱接合性耐藥質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒(r

31、esistance plasmid)。另一類是不能通過接合傳遞的非接合性耐藥質(zhì)粒，但它可通過噬菌體傳遞。細菌粘附定植在腸粘膜表面是由K質(zhì)粒決定的。 細菌素質(zhì)粒編碼各種細菌產(chǎn)生細菌素，如Col質(zhì)粒編碼大腸桿菌素，對同品系或近緣的細菌具有抑制作用，實際是對產(chǎn)生細菌素細菌本身起保護作用。 代謝質(zhì)粒編碼產(chǎn)生相關(guān)的代謝酶，如沙門菌發(fā)酵乳糖的能力通常是由質(zhì)粒決定的。 細菌攜帶有哪種質(zhì)粒，則有相應的功能，但也有某種質(zhì)?？赏瑫r決定幾種功能，如F質(zhì)粒除有致育性功能外，還能提供輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的能力，某些耐藥性質(zhì)粒上還帶有編碼毒力的基因，故帶此種質(zhì)粒的細菌，不僅獲得了耐藥性，而且致病性也得到了增強。毒力質(zhì)?；騐i質(zhì)粒

32、（virulence plasmid）編碼與該菌致病性有關(guān)的毒力因子。第70頁/共203頁 天然質(zhì)粒用作載體的局限性天然質(zhì)天然質(zhì) 粒粒 相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量拷貝數(shù)拷貝數(shù)單一酶切位點單一酶切位點選擇性標記選擇性標記復制類型復制類型pSC1015.81069.09 kb13EcoR Itetr嚴緊嚴緊ColE14.210620EcoR I大腸桿菌素大腸桿菌素松弛松弛RSF21247.410610EcoR I (BamH I)ampr松弛松弛局限性：分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位點少、選擇標記不合適第71頁/共203頁 共價閉合環(huán)狀DNA（ Covalent close circular

33、DNA， cccDNA)，呈超螺旋（super coil ，SC ）一條鏈上有一至數(shù)個缺口。DNA超螺旋結(jié)構(gòu)第72頁/共203頁質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率：同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。SCOCL第73頁/共203頁2 2、質(zhì)粒的基本性質(zhì)、質(zhì)粒的基本性質(zhì) 1 1）質(zhì)粒的自主復制性）質(zhì)粒的自主復制性 質(zhì)粒能利用寄主細胞的質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNADNA復制系統(tǒng)進行自主復制。復制系統(tǒng)進行自主復制。 根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為兩大復制類型。可分為兩大復制類型。 嚴緊型質(zhì)

34、粒（嚴緊型質(zhì)粒（stringent plasmidstringent plasmid）拷貝數(shù)少拷貝數(shù)少，大約有大約有1-1-幾個拷貝。幾個拷貝。 松弛型質(zhì)粒（松弛型質(zhì)粒（relaxed plasmidrelaxed plasmid）拷貝數(shù)多拷貝數(shù)多，有，有10106060份拷貝。份拷貝。 第74頁/共203頁2 2）質(zhì)粒的不相容性）質(zhì)粒的不相容性 任何兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，任何兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒質(zhì)粒的不相容性的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群。不相容性群。以大腸

35、桿菌的質(zhì)粒為例：以大腸桿菌的質(zhì)粒為例： ColE1ColE1、pMB1 pMB1 擁有相擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容；似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容； pSC101pSC101、F F、RP4 RP4 擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容。擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容。第75頁/共203頁質(zhì)粒的不相容性分子機制： 兩種含有不同復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定。因此在經(jīng)過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內(nèi)。 兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，由于競爭作用致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其

36、中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢。 第76頁/共203頁質(zhì)粒不親和性a：在同一個細胞中含有兩種不相容的質(zhì)粒b：隨著細胞的分裂質(zhì)粒分配到兩個子細胞中去c：在下一次細胞分裂之前，質(zhì)?？截悢?shù)加倍，但因為存在競爭，增加拷貝數(shù)不同d：兩種不相容質(zhì)?？截悢?shù)比例發(fā)生變化，最終產(chǎn)生出只含有一種類型質(zhì)粒的子細胞第77頁/共203頁在大腸桿菌中的質(zhì)粒，可以分為：接合型質(zhì)粒:能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用），多為低拷貝的大質(zhì)粒，含有完整的轉(zhuǎn)移操縱子基因（tra）和轉(zhuǎn)移起始位點。能在同種或親緣關(guān)系近的菌體細胞間進行轉(zhuǎn)移。非接合型質(zhì)粒：不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用，多為高拷

37、貝的小質(zhì)粒，如大腸桿菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少轉(zhuǎn)移基因（tra），不能自主轉(zhuǎn)移，但由于含有與F質(zhì)粒類似的bom位點或誘動基因mob（mobilization），因而能被帶有tra基因的轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒誘動而發(fā)生轉(zhuǎn)移。 3 3）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性第78頁/共203頁F因子：又叫致育因子，在某些大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種最具代表性的單拷貝的接合型質(zhì)粒，94kb，總共編碼19個轉(zhuǎn)移基因（tra），以三種形式存在。第79頁/共203頁 3 3、質(zhì)粒上的標記基因、質(zhì)粒上的標記基因 野生型的質(zhì)粒野生型的質(zhì)粒DNADNA上往往攜帶一個或多個遺傳標上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)

38、生正常生長非必需的附記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，但是加性狀，但是對對DNADNA重組分子的篩選具有重要意義重組分子的篩選具有重要意義 包括：包括： 物質(zhì)抗性：物質(zhì)抗性：抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物機物 物質(zhì)合成：物質(zhì)合成：細菌毒素、天然色素、有機堿細菌毒素、天然色素、有機堿第80頁/共203頁第81頁/共203頁第82頁/共203頁第83頁/共203頁標記基因用途：1）選擇標記基因：鑒別目的DNA（載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來。2）篩選標記基因：用于將攜帶了外源DNA片斷的重組子挑選出來。第84頁/共203頁4

39、、質(zhì)粒的命名 用小寫字母p代表質(zhì)粒（plasmid），在p字母后用兩個大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質(zhì)粒的作者或?qū)嶒炇颐Q，再加上質(zhì)粒編號。如：pBR322：p表示一種質(zhì)粒，而“BR”則是分別取自該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322為編號。第85頁/共203頁1）克隆載體（cloning vector） ： 主要用于擴增或保存DNA片斷，其上有復制子，最好是松弛型高拷貝；2）表達載體（expression vector）： 能使目的基因在宿主細胞中表達的一類載體。這類載體既有復制子，更要有強啟動子；3）穿梭載體（shuttle vector）： 裝有針對兩種

40、不同受體的復制子，便于基因克隆。 這類載體可以在原核細胞中復制，也可在真核細胞中擴增和表達。第86頁/共203頁1）克隆載體天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎進行人工構(gòu)建。第87頁/共203頁 pSC101 8.8 kb,拷貝數(shù)5、四環(huán)素抗性標記基因 TetrColE1 6.5 kb,拷貝數(shù)20 30、大腸桿菌內(nèi)毒素標記基因 E1 RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒、氨芐青霉素抗性標記基因 Ampr第88頁/共203頁組成:它由三部分組成：來自pSCl01的四環(huán)素抗性基因Tetr來自RSF

41、2124的氨芐青霉素抗性基因Ampr。來自ColEl的衍生物pMBl的松弛復制起點ori第89頁/共203頁pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來源第90頁/共203頁特點特點: :具有多個單一的限制性內(nèi)切酶位點。 Tetr中有BamH1切點（GGATCC）和Sal切點（GAATTC），Ampr中有Pst切點（CTGCAG）。利用ColEl的復制子，所以在細胞中是多拷貝的。第91頁/共203頁外源基因插入在Tetr中，基因型為Tets Ampr ；外源基因插入在Ampr中，基因型為Tetr Ampr；Tetr：在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生長；Tets：在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長；Ampr：在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基

42、上不生長；Amps：在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長； 而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長的是非重組型。 這種在一個基因位點中插入外源DNA片段，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫插入失活（insertional inactivation ）。 第92頁/共203頁pBR322質(zhì)粒載體tetr基因插入失活效應第93頁/共203頁常用質(zhì)?？寺≥d體：常用質(zhì)粒克隆載體：pUCpUC系列系列 pUC18/19特點：具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷貝數(shù)（500-700個）。具有多克隆位點，很方便插入外源基因-互補含有一個來自于大腸桿菌的經(jīng)過加工的LacZ基因)第94頁/共203頁第95頁/共203頁OHHH

43、OHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONNpUC18 / 19：正選擇標記 lacZ 的顯色原理5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal-半乳糖苷酶的-肽段lacZMCSPlac突變型lac - E.coli溴氯吲哚第96頁/共203頁LacZ: 大腸桿菌的編碼-半乳糖苷酶基因，編碼1024個氨基酸，切斷乳糖的半乳糖苷鍵產(chǎn)生半乳糖和葡萄糖 LacZ: 編碼-半乳糖苷酶N端146個氨基酸 ，這個編碼區(qū)中插入了一個MCS，但它并不破壞讀框，但是，若在該 DNA 小片段中再插入一個片段，將幾乎不可避免地導致產(chǎn)生無-互補能力的 -半乳糖苷酶片段X-gal ：5-溴-4-

44、氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷，也是-半乳糖苷酶的一種生色底物，經(jīng)降解后可生成溴氯吲哚，呈藍色，也使大腸桿菌菌落從白色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色第97頁/共203頁-互補(Alpha complementation) ： 質(zhì)粒中插入lac Z基因，編碼N端146個氨基酸殘基（ -半乳糖苷酶的片段）。突變型lac - E.coli 可表達該酶的片段（酶的C端）。單獨存在的及片段均無半乳糖苷酶活性，只有宿主細胞與克隆載體同時共表達兩片段時，宿主細胞內(nèi)才有半乳糖苷酶活性，使底物X-gal特異性變?yōu)樗{色化合物，這就是所謂的 - 互補。 Blue White第98頁/共203頁2）真核表達質(zhì)粒酵母表達質(zhì)粒昆蟲表達質(zhì)粒

45、哺乳動物細胞表達質(zhì)粒第99頁/共203頁第100頁/共203頁啟動子（promoter）：是與基因表達啟動相關(guān)的順式作用元件，與RNA聚合酶特異結(jié)合，是基因轉(zhuǎn)錄的起始部位，分為兩類：一類是RNA聚合酶能夠直接識別的，另一類在與RNA聚合酶結(jié)合時需要蛋白質(zhì)輔助因子存在。序列特點：上游有-10，共同序列TATAAT （Pribnow box）；上游有-35，共同序列TTGACA第101頁/共203頁lLac啟動子（Plac）：中等強度啟動子，一般帶有l(wèi)acZ基因片段，實現(xiàn)-互補。l噬菌體左臂（PL)和右臂啟動子（PR) ：是噬菌體早期左臂和右臂轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，啟動效率高，廣泛使用的原核生物啟動子。lT

46、rp啟動子（Ptrp）：是強啟動子，來源于大腸桿菌色氨酸操縱子， 在富含trp的培養(yǎng)基中處于關(guān)閉狀態(tài)，當trp水平下降，Ptrp開始轉(zhuǎn)錄。lT7啟動子（PT7）：來自于T7噬菌體晚期轉(zhuǎn)錄基因啟動子，只能由T7聚合酶識別（其轉(zhuǎn)錄活性是大腸桿菌聚合酶6倍，因此PT7轉(zhuǎn)錄活性高。第102頁/共203頁lac 操縱元結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)序列結(jié)構(gòu)基因操縱子：以乳糖操縱子為例來說明第103頁/共203頁異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside,IPTG)就是其中一種很強的誘導劑，不被細胞代謝而十分穩(wěn)定。第104頁/共203頁核糖體結(jié)合位點（ribosome binding site，RBS

47、）：大腸桿菌中翻譯起始時，首先是核糖體30S小亞基識別并結(jié)合至mRNA5端的翻譯起始部位，該部位就是RBS。RBS包括起始密碼子ATG序列及其上游SD序列。SD序列：ATG上游311堿基處的保守序列AGGAG，可與小亞基中16S rRNA 3端富含嘧啶序列互補結(jié)合，mRNA必須有這一序列才能進入核糖體。第105頁/共203頁轉(zhuǎn)錄終止區(qū)（terminator）：是DNA分子中決定RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄的一段回文核苷酸序列。分為兩類：不依賴因子的終止子的回文序列中富含GC堿基對，在回文序列的下游方向又常有68個AT堿基對；而依賴因子終止子中回文序列的GC對含量較少。在回文序列下游方向的序列沒有固定特

48、征，其AT對含量比前一種終止子低。 第106頁/共203頁大腸桿菌中蛋白表達形式大腸桿菌中蛋白表達形式 (1)(1)完整目的蛋白完整目的蛋白 (2)(2)融合蛋白融合蛋白：兩個或多個基因的開放閱讀框按一定順序連兩個或多個基因的開放閱讀框按一定順序連接在一起表達形成的蛋白。接在一起表達形成的蛋白。 當?shù)鞍踪|(zhì)表達以后，有效的分離純化或分泌就成為獲得當?shù)鞍踪|(zhì)表達以后，有效的分離純化或分泌就成為獲得目標蛋白的關(guān)鍵因素。通過以融合蛋白的形式表達，并利用目標蛋白的關(guān)鍵因素。通過以融合蛋白的形式表達，并利用載體編碼的蛋白或多肽的特殊性質(zhì)可對目標蛋白進行分離和載體編碼的蛋白或多肽的特殊性質(zhì)可對目標蛋白進行分離

49、和純化。用作分離的載體蛋白被稱為純化。用作分離的載體蛋白被稱為標簽蛋白或標簽多肽標簽蛋白或標簽多肽（TagTag），），常用的有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（常用的有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-glutathione S-transferase, GSTtransferase, GST）、六聚組氨酸肽（）、六聚組氨酸肽（polyHis-6polyHis-6，6 6His His tagtag）、金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)）、金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)A A或或G G（protein A, protein protein A, protein G G ）等。）等。第107頁/共203頁融合蛋白的表達載體（

50、1）GST融合表達載體GST是來源于血吸蟲的小分子酶（26kDa），在E.coli易表達，在融合蛋白狀態(tài)下保持酶學活性，對谷胱甘肽有很強的結(jié)合能力。第108頁/共203頁 GST表達載體在啟動子tac和多克隆位點之間加入了兩個與分離純化有關(guān)的編碼序列，其一是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位點的編碼序列。當外源基因插入到多克隆位點后，可表達出由三部分序列組成的融合蛋白。 將谷胱甘肽固定在瓊脂糖樹脂上形成親和層析柱，當表達融合蛋白的全細胞提取物通過層析柱時，融合蛋白將吸附在樹脂內(nèi)，其它細胞蛋白就被洗脫出來。然后再用含游離的還原型谷胱甘肽的緩沖液洗脫，可將融合蛋白釋放出

51、來。再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可獲得純化的目標蛋白。除了凝血蛋白酶的切割位點外，其它還有腸激酶。第109頁/共203頁（2）his(組氨酸）標簽表達載體啟動子下游有一段編碼6個組氨酸的序列，多聚組氨酸肽能與2價金屬離子結(jié)合（鎳離子），將鎳離子固定在樹脂上，便可對帶His標簽的融合蛋白進行親和層析分離。第110頁/共203頁 真核表達載體真核表達載體l 酵母表達載體酵母表達載體l 昆蟲表達載體昆蟲表達載體l 哺乳動物細胞表達載體哺乳動物細胞表達載體 第111頁/共203頁 l酵母表達載體釀酒酵母和畢赤酵母畢赤酵母載體:均為大腸桿菌-畢赤酵母穿梭載體第112頁/共203頁畢赤酵母啟動子（來自乙

52、醇氧化酶基因AOX1），受到甲醇嚴格控制。第113頁/共203頁l哺乳動物細胞表達質(zhì)粒載體包括:1）大腸桿菌的復制子及抗生素抗性基因：便于基因工程操作2）哺乳動物的啟動子和增強子：使外源基因表達3）含有終止信號及加polyA信號：polyA上游1130bp處有一高度保守的AAUAAA序列，下游富含GU或U第114頁/共203頁Neomycin：G418第115頁/共203頁綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）：從水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白，分子質(zhì)量為26kDa，由238個氨基酸構(gòu)成，第6567位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成發(fā)光團，是主要發(fā)光的位置。其

53、發(fā)光團的形成不具物種專一性，發(fā)出熒光穩(wěn)定，且不需依賴任何輔因子或其他基質(zhì)而發(fā)光。綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)化入宿主細胞后很穩(wěn)定，對多數(shù)宿主的生理無影響，是常用的報道基因。 如利用GFP 的示蹤特性，研究腫瘤細胞內(nèi)某些基因異常表達與腫瘤細胞浸潤的關(guān)系，即可揭示腫瘤細胞浸潤的某些機制。 第116頁/共203頁內(nèi)部核糖體進入位點序列（Internal ribosome entry site, IRES）。 IRES能招募核糖體對mRNA進行獨立地翻譯。第117頁/共203頁3）穿梭質(zhì)粒 穿梭載體（Shuttle vector）是能夠在兩類不同宿主中復制、增殖和選擇的載體。這類載體可以在原核細胞中復制，也可在

54、真核細胞中擴增和表達。 酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等使用的表達載體，一般都有在大腸桿菌中復制的元件，因此都具備穿梭載體的特征，如大腸桿菌/酵母、大腸桿菌/昆蟲細胞、大腸桿菌/哺乳動物細胞穿梭載體等。 第118頁/共203頁5、質(zhì)粒DNA的分離純化實驗室一般使用下列2種方法制備質(zhì)粒DNA： 1)氯化銫密度梯度離心法質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染2)堿裂解法方便、快速，滿足一般需要第119頁/共203頁1 1）氯化銫密度梯度離心法：）氯化銫密度梯度離心法： 原理：是一種沉降平衡離心法，經(jīng)超速離心，離心介質(zhì)原理：是一種沉降平衡離心法，經(jīng)超速離心，離心介質(zhì)CsClCsCl形成形成一連續(xù)

55、的密度梯度，在過量一連續(xù)的密度梯度，在過量EBEB存在的條件下，各種不同密度的物存在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開。其中蛋白質(zhì)密度?。ㄙ|(zhì)經(jīng)離心平衡后得以分開。其中蛋白質(zhì)密度?。?.3 g/cm31.3 g/cm31.4g/cm31.4g/cm3），浮于液面；），浮于液面；RNARNA密度大（密度大（2.0g/cm32.0g/cm3），沉于管底；），沉于管底；各種各種DNADNA密度介于蛋白質(zhì)與密度介于蛋白質(zhì)與RNARNA之間，處于中部。過量之間，處于中部。過量EBEB處理前，處理前，細菌染色體細菌染色體DNADNA與不同分子構(gòu)型的質(zhì)粒與不同分子構(gòu)型的質(zhì)粒DNADNA的密度均為

56、的密度均為1.7g/cm31.7g/cm3左左右，難以區(qū)分。經(jīng)過量右，難以區(qū)分。經(jīng)過量EBEB處理后，不同分子構(gòu)型的處理后，不同分子構(gòu)型的DNADNA與與EBEB的結(jié)合的結(jié)合能力不一樣，因而密度下降不一致，可有效分離。其中，閉環(huán)質(zhì)能力不一樣，因而密度下降不一致，可有效分離。其中，閉環(huán)質(zhì)粒粒DNADNA為超螺旋三級結(jié)構(gòu)，為超螺旋三級結(jié)構(gòu)，EBEB不易插入，結(jié)合量少，密度下降小，不易插入，結(jié)合量少，密度下降小，約為約為1.59 g/cm31.59 g/cm3；而染色體；而染色體DNADNA、開環(huán)質(zhì)粒、開環(huán)質(zhì)粒DNADNA以及帶切口的環(huán)狀以及帶切口的環(huán)狀質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA可以嵌入更多的可以嵌入更多

57、的EBEB，密度下降較多，約為，密度下降較多，約為1.54 g/cm31.54 g/cm3，從而能與閉環(huán)質(zhì)粒從而能與閉環(huán)質(zhì)粒DNADNA分開。分開。 第120頁/共203頁proteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs過程：用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體加溶菌酶裂解細菌細胞壁 加CsCl和溴乙錠超速離心過夜在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀cccDNA第121頁/共203頁 2 2）堿變性法）堿變性法 原理：堿變性法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性原理：堿變性法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓撲學上的差異，染色質(zhì)在拓撲學上的差異，在在pH 12.0-12.6pH 1

58、2.0-12.6堿性環(huán)境堿性環(huán)境中，中，線性的大分子量細菌染色體線性的大分子量細菌染色體DNADNA變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒變性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNADNA仍為自然狀態(tài)；仍為自然狀態(tài)；將將pHpH調(diào)至中性并有高濃度鹽存在的條件下調(diào)至中性并有高濃度鹽存在的條件下，染色體染色體DNADNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNADNA和蛋和蛋白質(zhì)在去污劑白質(zhì)在去污劑SDSSDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNADNA仍為可溶仍為可溶狀態(tài)。通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體狀態(tài)。通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNADNA、RNARNA及蛋白質(zhì)

59、，質(zhì)粒及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNADNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純尚在上清中，再用酚氯仿抽提進一步純化質(zhì)?；|(zhì)粒DNADNA。 由于操作原因，提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開由于操作原因，提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。環(huán)、閉環(huán)超螺旋。 第122頁/共203頁第123頁/共203頁 試劑試劑 1. LB1. LB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 2. 2. 溶液溶液 I I 3. 3. 溶液溶液 4. 4. 溶液溶液IIIIII 5. TE(pH8.0) 5. TE(pH8.0) 穩(wěn)定穩(wěn)定第124頁/共203頁 LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基 配制配制1 1升培養(yǎng)基，應在升培養(yǎng)基，應在950ml950ml去

60、離子水中加入：去離子水中加入： 細菌培養(yǎng)基用胰化蛋白胨細菌培養(yǎng)基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone) 10g(bacto-tryptone) 10g 細菌培養(yǎng)基用酵母提取物細菌培養(yǎng)基用酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g(bacto-yeast extract) 5g NaClNaCl10g10g 搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，5mol/L NaOH(5mol/L NaOH(約約0.2ml)0.2ml)調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH值至值至7.0,7.0,加入去離子水至總體積為加入去離子水至總體積為1L1L，15 lbf/in15 lbf/in2 2(1.