課程設計范例

1、 山東農(nóng)業(yè)大學 生物技術課程設計題目： 不同啟動子對RNA介導的病毒抗性的影響 姓名： 學號： 年級： 專業(yè)： 指導教師： 山東農(nóng)業(yè)大學生命科學學院二 年 月 日一、選題依據(jù)（擬開展研究項目的研究目的、意義）雙鏈RNA 導致基因沉默RNA 干涉,它是一種普遍存在于生物界的生命現(xiàn)象, 也是現(xiàn)在生命科學領域的一個研究熱點。盡管對RNAi 的機制研究已經(jīng)取得許多重要的成果, 但是仍有許多環(huán)節(jié)需要進一步地探查。RNA 干涉(RNAi)是利用雙鏈RNA 特異性的降解相應序列的mRNA , 從而特異性的阻斷相應基因的表達。RNA介導的病毒抗性技術是利用病毒本身的一些基因導入植物從而獲得抗病毒植株，也稱為源

2、于病原誘導的抗病，是植物病毒基因工程常用的策略。馬鈴薯Y病毒(PVY)對馬鈴薯、煙草等重要經(jīng)濟作物危害十分嚴重，其侵染所造成的損失可達80%，尤其是馬鈴薯Y病毒壞死株系（PVYN）可以造成寄主提前死亡而絕收。本研究以馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因3端400bp 的序列為靶目標設計反向重復序列,插入含有三種不同類型啟動子的表達載體PCAMBIA1300中，構建hpRNA結構的植物表達載體，轉化煙草，進行抗病性鑒定，分析不同啟動子對RNA介導的病毒抗性的影響，尋找能夠引發(fā)RNA介導病毒抗性產(chǎn)生的最佳類型的啟動子，同時探討啟動子對RNA介導病毒抗性的作用本質。二、文獻綜述內(nèi)容（在充分收集研究主題相關資料的

3、基礎上，分析國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，提出問題，找到研究主題的切入點，附主要參考文獻）RNA干擾（RNA interference, RNAi）現(xiàn)象最早是在植物中發(fā)現(xiàn)的。1990年，Napoli等將查爾酮合成酶(CHS)基因導入到紫花矮牽牛中，旨在加深花的顏色，但結果花的顏色不但沒有加深，而變成白色或紫白相間。分析發(fā)現(xiàn)轉基因植株并沒有新的基因表達，反而使植物本身的色素合成基因也受到了抑制。當時將這種現(xiàn)象稱為共抑制（Co-suppression）或轉錄后的基因沉默（PTGS）。隨后， Dougherty等（1992年）用煙草蝕紋病毒（tobacco etch virus，TEV）的非翻譯CP基因轉化煙草，

4、發(fā)現(xiàn)在表現(xiàn)抗性的植物細胞核中，轉入病毒CP基因的轉錄正常，甚至加強，但在細胞質中的積累大大降低。這與在研究chs基因的結果極為相似，也是一種轉錄后基因沉默（PTGS）。這種抗性被稱為RNA介導的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance, RMVR）。繼在植物中發(fā)現(xiàn)PTGS后，目前已在微生物、動物中也發(fā)現(xiàn)與PTGS類似的現(xiàn)象，如在真菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)的“quelling”(Guo, 1995)、線蟲、果蠅內(nèi)發(fā)現(xiàn)的RNAi（Fire,1998 ；Zamore,2000）。根據(jù)上述各種基因沉默的特點和性質，可統(tǒng)稱為RNA干擾或RNA沉默。RNA沉默是生物體內(nèi)由雙鏈RNA（doubl

5、e-strand RNA，dsRNA）引發(fā)的同源mRNA降解現(xiàn)象(Hammond, 2001; Phillip, 2002; Kawasaki, 2003)。在細胞中，dsRNA在Dicer酶的作用下從兩端逐段酶解大小約2125nt的小分子雙鏈RNA (Small interfering RNAs，siRNAs)片段。雙鏈siRNAs形成后，與RNA誘導的RNA沉默復合體（RNA-Induced Silencing Complex，RISC）結合，在ATP酶的作用下將雙鏈siRNA解開成單鏈RNA。在ss-siRNA的引導下，識別與其同源的靶mRNA，一旦siRNA和靶mRNA互補配對，RIS

6、C中的核酸酶就將靶RNA從siRNA中點的對應位置處切斷，導致靶RNA降解。RNA沉默的顯著特征是這種沉默作用可以被擴大。這種擴大作用可能是由于反義siRNA與靶mRNA結合，在RdRP的作用下擴增出dsRNA。然后在Dicer的作用下可形成大量的siRNA。建立dsRNA的高效植物表達載體，對于成功地應用RNAi技術培育抗病毒的轉基因植物起著至關重要的作用。對于轉基因來說，dsRNA形成的途徑的最佳途徑是通過構建的發(fā)夾結構（hairpin）的外源基因轉錄產(chǎn)生。具有發(fā)夾結構的外源基因由兩段反向重復（IR） DNA序列和一段其他DNA（spacer）序列組成，兩段IR DNA由spacer連接起

7、來。這樣的結構所轉錄的RNA會形成發(fā)夾結構（hairpin RNA, 簡稱hpRNA）。hpRNA由具有雙鏈結構的“莖”（stem， 是IR DNA轉錄的產(chǎn)物配對形成雙鏈）和單鏈結構的“環(huán)”（loop，是spacer DNA轉錄的產(chǎn)物）組成。研究發(fā)現(xiàn)，在一般的轉基因植物中（即含有非hpRNA結構外源基因的轉基因植物），產(chǎn)生基因沉默的幾率一般為10%30%；而轉錄后能形成雙鏈RNA的轉基因（hpRNA結構的轉基因）誘發(fā)基因沉默的幾率較高，可達到6080%以上；尤其對于轉錄后形成的“環(huán)”（loop）為內(nèi)含子的發(fā)夾結構（ihpRNA），誘發(fā)基因沉默的效率更高，有的可達100%（朱俊華, 2004;

8、竺曉平, 2006; Smith, 2000; Wesley, 2001; Zamore, 2002; Helliwell, 2003; Pandolfini, 2003） ?；趆pRNA表達而誘導的基因沉默已在多種生物、多種基因上獲得成功（Smith, 2000; Wesley, 2001; Piccin, 2001; Paddison, 2002; Stoutjesdijk, 2002; Helliwell, 2003）。通過對hpRNA的研究表明，hpRNA中的雙鏈“莖”（stem）部分是誘發(fā)基因沉默的關鍵部位。莖的長短可影響RNA沉默的效率及穩(wěn)定性。在植物轉基因研究中，Helliwe

9、ll（2003）等研究發(fā)現(xiàn)，501000bp的基因片段均能誘發(fā)基因沉默，但基因片段越短，基因沉默的效率越低；并認為片段長度為300600bp時，是合適的，且可以獲得最高的基因沉默效率。在RNA介導的病毒抗性研究中，我們的研究結果表明stem的長度為200bp、100bp和50bp的莖長度均可高效的誘導病毒抗性，但200bp的效率更高（竺曉平，2006；遲勝起，2005；李鵬，2007）。莖長度選擇的原則是，在保證足夠效率的基礎上，選擇盡可能短的片段。這樣，第一，可減少外源DNA的插入對植物細胞染色體DNA造成的不良影響；第二，可進一步提高轉基因植物的生物安全性；第三，可很方便地將同一病毒不同功

10、能基因的cDNA區(qū)段或不同病毒的cDNA連接在同一載體上，從而更高、更持久抗性或多病毒抗性的植物。從目前已有的研究結果看，較短的適宜莖長度為300bp左右。hpRNA中的“環(huán)”（loop）也可對PTGS （RNA沉默）產(chǎn)生影響，loop的長度直接影響hpRNA的形成和穩(wěn)定性。在一定范圍內(nèi)，短loop有利于hpRNA的形成和穩(wěn)定，但loop過短會影響IR結構DNA的在細菌內(nèi)的克隆。Piccin等（2001）在研究hpRNA引發(fā)果蠅Y基因（長度為1120bp）沉默中的研究中使用GFP基因片段為spacer，結果表明當loop長度為330nt時，對dsRNA引發(fā)的RNAi無顯著影響，且極大地提高了I

11、R克隆的效率；而當loop長度為150nt時，則對提高IR克隆的效率沒有幫助。Wesley（2001）等報道，在植物中，當loop長度為3050nt，stem的長度為98bp時，就可引發(fā)100%的基因沉默。我們的研究表明，當stem為200nt長度時，50nt長度的loop可有效地形成穩(wěn)定的hpRNA（朱俊華等，2004）；當stem長度為300nt時，載體的構建相當困難。從目前的研究結果看，較適宜的莖環(huán)比例應為3/14/1（溫孚江，2004國家基金）。適宜莖長度和莖環(huán)比例的確定為研究中構建dsRNA的高效表達載體提供了依據(jù)。高效啟動子的選用可能也是高效誘發(fā)RNAi的另一重要因素。Que等（1

12、997）研究發(fā)現(xiàn)由強啟動子驅動的chs轉基因引起的PTGS比用弱啟動子驅動轉基因要有效的多。Waterhouse 等（1998）用35S啟動子驅動殘缺的部分基因被排列成發(fā)夾RNA（hairpin RNA）轉錄物的反向重復uidA轉基因，結果獲得很高的沉默發(fā)生率（90%），而用不帶啟動子的反向重復結構基因沉默則明顯地減少，推測高強度的轉錄可能較低強度的轉錄更易于產(chǎn)生dsRNA，說明轉錄產(chǎn)物產(chǎn)生的速率對于激發(fā)PTGS是非常重要的。玉米乙醇脫氫酶基因啟動子（ubi ）具有高效啟動轉錄的作用,并且它基本不受組織細胞的限制，是禾本科植物中較為常見的啟動子，能夠有效地提高外源基因在水稻愈傷中的瞬間表達，效

13、率為35S啟動子的4倍。Pnzip 啟動子是一種具有嚴格組織專一性的啟動子, 它能驅動外源基因在光合組織中特異、高效表達，效率為35S啟動子的9倍。在RNA介導的植物病毒抗性研究中，目前尚未見有關比較不同類型啟動子抗病性的系統(tǒng)報道，本研究將在這方面進行深入、系統(tǒng)地探討。主要參考文獻：1 Boogaart TV, et al. Replicase-derived resistance against Pea early browning virus in Nicotiana benthaminaa is an unstable resistance based upon posttranscri

14、ptional gene silencing. MPMI,2001,14(2):196-203.2 Boutla A, et al. Short 5-phosphorylated double-stranded RNAs induce RNAinterference in Drosophila. Cuurr Biol, 2001, 11: 1776-1780.3 Cogoni C & Macino G.Posttranscriptional gene silencing in Neurospora by a RecQ DNA helicase . Science, 1999,286:2342-

15、2344.4 Cogoni C, et al. Suppression of gene expression by homologous transgenes. Antonie Van Leeuwenhoek, 1994, 65 (3): 205 - 209.5 Derek M, et al. Silencing viral infection. PLoS Medicine, 2006, 3 (7):1000-1004.6 Dougherty W G, et al. Transgenes and gene suppression: Telling us something new?. Curr

16、 Opin Cell Biol, 1995, 7:399-405.7 Einav Y, et al. shRNA-mediated RNA interference as a tool for genetic synthetic lethality screening in mouse embryo fibroblasts. FEBS Lett. 2005, 579(1):199-202.8 Elbashir S M, et al. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAsJ. Genes Dev ,2001, 15:

17、188-200.9 Fire A, et al.Potent and spacific genetic interferenoe by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans . Nature, 1998, 391:806-811.10 Gil, J. & Esteban, M. (2000) Apoptosis 5, 107114.11 Grishok A, et al. Genes and mechanisms related to RNA interference regulate expression of the small te

18、mporal RNAs that control C. elegans developmental timing. Cell, 2001,106:2334.12 Herrera Estrella L,et al.Light-induced and chloroplast-associated experession of chimearic gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti plasmid vectorJ.Nature,1984,310:115120.13 Vasil V,et al.Herbicide resistant fe

19、rtile transgenic wheat plants obtained by particle bombardment of regenerable callusJ.Bio/Tech,1992,10:667674.14 Wilson T M A.Strategies to protect crop plants against virus:pathogen-derived resistance blossomsJ.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:3134!3141.15 Fujimoto H,et al.Insect resistant rice gener

20、ated by the introduction of a modifide-endotoxin gene of Bacillus thuringiensisJ. Bio/Tech,1993,11:11511155.16 Oeller P W, et al. Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNAJ.Sciece,1991,254:437439.17 Mariani C, et al. Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonu

21、clease geneJ.Nature,1990,347:737741.18 Gasser C S, Fraley R T. Genetically engineering plants for crop impovementJ.Science,1989,244:1293!1299.19 Van der Salm T, et al. Insect resistance of transgenic plants that express modified Bacillus thuringiensis cryIA(b) and cryIC genes:a resistande management

22、 strategyJ. Plant Mol Biol,1994,26:5159.20 白慶榮, 等. 利用RNA介導的抗病性獲得抗2種病毒的轉基因煙草。植物病理學報，2005，35（2）：148-154.21 遲勝起. 核基質結合區(qū)對馬鈴薯Y病毒非翻譯CP基因及反向重復片段介導的抗病性影響. 植物病理學報， 2005，35（4）：345-35122 樊龍江, 等. 轉基因植物的基因漂流風險. 應用生態(tài)學報,2001 (4):151-153.23 郭興啟, 等. 利用RNA介導的抗病性獲得高度抗馬鈴薯Y病毒的轉基因煙草. 植物病理學報, 2001b, 31（4）: 349-356.24 郭興啟,

23、 等翻譯和非翻譯馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因介導的抗病性比較，病毒學報， 2001a，17(4)：360-367. 25 賴延東，等。應用定量競爭RT-PCR篩選芳香烴受體基因RNA干擾片段。衛(wèi)生研究， 2006，35（1）：7-9。26 李 鵬, 等. 馬鈴薯Y病毒CP基因5端和3端反向重復結構介導的抗病性研究。植物病理學報, 2007, 37(1):69-76.27 李建龍，等。SiRNA活性與mRNA二級結構關系的研究。生物醫(yī)學工程研究，2006，25（1）：4652.28 劉曉玲, 等. PVX 25kD運動蛋白基因和外殼蛋白基因介導的抗病性研究。作物學報，2005，31（7）：827-8

24、32。29 溫孚江, 等. 轉錄后基因沉沒與植物的病毒抗性. 生物工程學報, 2001, 17(3)：213-235.30 羊正綱，等。 載體法篩選乙型肝炎病毒S基因小干擾RNA靶位體系的建立。中華肝臟病雜志，2004，12（9）：51551831 趙明敏, 等. 瞬時表達靶向TMV外殼蛋白基因的siRNA能干擾病毒侵染. 植物病理學報, 2006, 36(1):35-40.32 趙遠. RNA干擾治療馬凡綜合癥的載體和靶位點基礎. 博士論文, 2003年.33 朱常香, 等. RNA介導的病毒抗性在轉基因煙草中的遺傳. 遺傳學報, 2005,32 (1): 94-103.34 朱俊華, 等.

25、 馬鈴薯Y病毒衣殼蛋白基因片段長度對RNA介導抗病性的影響. 中國科學（C輯）, 2004b 34（1）: 23-30.35 朱俊華, 等. 正向和反向重復RNA介導的抗馬鈴薯Y病毒基因工程比較研究. 植物病理學報, 2004a, 34（2）:133-140.36 竺曉平, 等. 馬鈴薯 Y病毒CP基因的短片段及其反向重復轉基因煙草的RNA介導的抗病性研究. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2006, 39（6）:1153-1158.楊予濤 ，等.一個光合組織特異表達強啟動子的分離及功能分析.中國科學（C輯）.2003, 8, 33（4）：228-306.三、研究方案（主要研究內(nèi)容、研究方法和技術路線）本研究

26、以馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因3端400bp 的序列為靶目標設計反向重復序列,插入含有三種不同啟動子的表達載體PCAMBIA1300中，構建hpRNA結構的植物表達載體，轉化煙草，進行抗病性鑒定，分析不同啟動子對RNA介導的病毒抗性的影響，尋找能夠引發(fā)RNA介導病毒抗性產(chǎn)生的最佳類型的啟動子，同時探討啟動子對RNA介導病毒抗性的作用本質。研究方法1不含內(nèi)含子的反向重復序列的表達載體的構建 hpRNA的構建如圖所示 轉錄 400bp 100bp 2含有內(nèi)含子的反向重復序列的表達載體的構建hpRNA的構建如圖所示載體的構建以雙元載體pCAMBIA1300為基礎。設計引物（兩端加上適宜的限制性內(nèi)切酶位點），PCR分別擴增花椰菜花葉病毒35S（CaMV35S）啟動子、水稻肌動蛋白基因Act1啟動子、玉米乙醇脫氫酶基因Ubi啟動子和PNZIP基因啟動子和胭脂堿合成酶基因3端Nos終止子。將擴增的啟動子和終止子連接于雙元載體pCAMBIA1300中，獲得含有不同啟動子的重組的表達載體。以已克隆的PVY的CP基因3段400bp的cDNA區(qū)段為目的基因，分別反向重復插入含有不同啟動子植物表達載體pCAMBIA1300中。在SacI位點和EcoRI位點之間插入Nos 3終止子，在XhoI單位點插入NptIII抗性基因，在HindIII和BamHI位點