酶學(xué)分析技術(shù)一

1、第五章酶學(xué)分析技術(shù)酶學(xué)分析技術(shù)1酶（酶（enzymeenzyme）的本質(zhì)：）的本質(zhì)： 高度特異性、高度不穩(wěn)定性，高效性、可調(diào)節(jié)性高度特異性、高度不穩(wěn)定性，高效性、可調(diào)節(jié)性 酶的應(yīng)用：酶的應(yīng)用：由由活細(xì)胞活細(xì)胞產(chǎn)生的能產(chǎn)生的能高效催化高效催化特異生化反應(yīng)的特異生化反應(yīng)的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)，屬于生物催化劑，屬于生物催化劑 酶的特點(diǎn)：酶的特點(diǎn)： 酶活性的檢測(cè)、代謝物的酶學(xué)分析和同工酶及亞型測(cè)定用于臨酶活性的檢測(cè)、代謝物的酶學(xué)分析和同工酶及亞型測(cè)定用于臨床診斷和療效判斷床診斷和療效判斷2主要內(nèi)容：主要內(nèi)容：l酶活性測(cè)定的基本知識(shí)酶活性測(cè)定的基本知識(shí)l酶活性的測(cè)定酶活性的測(cè)定 l代謝物的酶法檢測(cè)代謝物的酶法檢

2、測(cè)l同工酶測(cè)定同工酶測(cè)定 3l掌握掌握酶活性單位的表示方法與計(jì)算、酶活性測(cè)定的酶活性單位的表示方法與計(jì)算、酶活性測(cè)定的定時(shí)法與連續(xù)監(jiān)測(cè)法、代謝物的酶法測(cè)定。定時(shí)法與連續(xù)監(jiān)測(cè)法、代謝物的酶法測(cè)定。l熟悉熟悉酶促反應(yīng)進(jìn)程、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、酶活性測(cè)定酶促反應(yīng)進(jìn)程、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、酶活性測(cè)定的直接法與間接法、酶活性測(cè)定的影響因素。的直接法與間接法、酶活性測(cè)定的影響因素。l了解了解同工酶產(chǎn)生的機(jī)理與測(cè)定方法、酶活性單位的同工酶產(chǎn)生的機(jī)理與測(cè)定方法、酶活性單位的校準(zhǔn)、工具酶的應(yīng)用。校準(zhǔn)、工具酶的應(yīng)用。教學(xué)要求：教學(xué)要求：4第一節(jié)第一節(jié) 酶活性測(cè)定的基本知識(shí)酶活性測(cè)定的基本知識(shí)酶測(cè)定酶測(cè)定絕對(duì)定量法（酶量直

3、接測(cè)定法）：免疫學(xué)方法絕對(duì)定量法（酶量直接測(cè)定法）：免疫學(xué)方法相對(duì)定量法（酶活性間接測(cè)定法）：生化檢測(cè)方法相對(duì)定量法（酶活性間接測(cè)定法）：生化檢測(cè)方法 EE5簡(jiǎn)介內(nèi)容：簡(jiǎn)介內(nèi)容：一、酶活性一、酶活性二、酶活性單位與酶活性濃度二、酶活性單位與酶活性濃度三、酶促反應(yīng)進(jìn)程三、酶促反應(yīng)進(jìn)程 四、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)四、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 6一、酶活性一、酶活性n定義：酶活性（定義：酶活性（enzyme activityenzyme activity）也稱為酶活力，指）也稱為酶活力，指酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)速率速率，即，即規(guī)定條件下規(guī)定條件下在在單位時(shí)間單位時(shí)間內(nèi)內(nèi)產(chǎn)物的生成產(chǎn)物的生成量量或或底物的減少量。底物的減少量

4、。 n表示方法：表示方法： dtPdv或或dtSdv 式中式中v v：反應(yīng)速率，：反應(yīng)速率，P P ：產(chǎn)物濃度，：產(chǎn)物濃度，t t：時(shí)間，：時(shí)間，SS：底物濃度。：底物濃度。 7二、酶活性單位與酶活性濃度二、酶活性單位與酶活性濃度（一）（一）酶活性單位酶活性單位u定義：表示酶的定義：表示酶的相對(duì)含量相對(duì)含量，指在一定條件下，指在一定條件下，單位時(shí)間內(nèi)單位時(shí)間內(nèi)生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所催化的酶量生成一定量的產(chǎn)物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 u表示方法：表示方法：慣用單位（一定的反應(yīng)量慣用單位（一定的反應(yīng)量/ /一定的反應(yīng)時(shí)間）一定的反應(yīng)時(shí)間）國(guó)際單位國(guó)際單位IUIU（mol/mi

5、nmol/min）KatalKatal單位（單位（mol/smol/s） 81 1慣用單位：慣用單位： 2020世紀(jì)世紀(jì)6060年代以前根據(jù)酶活性測(cè)定方法建立者的姓氏命名的單位年代以前根據(jù)酶活性測(cè)定方法建立者的姓氏命名的單位 ALPALP的金氏單位（的金氏單位（KingKing）氨基移轉(zhuǎn)酶的卡門氏單位（氨基移轉(zhuǎn)酶的卡門氏單位（KarmenKarmen） 特點(diǎn)：各單位對(duì)溫度、時(shí)間、物質(zhì)量的定義不同，導(dǎo)致各測(cè)特點(diǎn)：各單位對(duì)溫度、時(shí)間、物質(zhì)量的定義不同，導(dǎo)致各測(cè)定值、參考范圍相差很大，彼此間無(wú)法比較定值、參考范圍相差很大，彼此間無(wú)法比較, ,現(xiàn)在臨床應(yīng)用較現(xiàn)在臨床應(yīng)用較少。少。卡門氏單位：卡門氏單位

6、：1.0ml1.0ml血清在血清在2525，340nm340nm，反應(yīng)體積，反應(yīng)體積3.0ml,3.0ml,光徑光徑1.0cm1.0cm時(shí)每分鐘測(cè)定吸光度下降時(shí)每分鐘測(cè)定吸光度下降0.0010.001，即消耗，即消耗4.82 4.82 10 10-4mol NADH-4mol NADH為一為一個(gè)卡門氏單位個(gè)卡門氏單位舉例：舉例：金氏單位：金氏單位：100ml100ml血清血清ALPALP在在3737與底物作用與底物作用15min15min，產(chǎn)生，產(chǎn)生1mg1mg酚。酚。92.2.國(guó)際單位國(guó)際單位IUIU（mol/minmol/min）定義：在規(guī)定條件下（定義：在規(guī)定條件下（2525及其他最適條

7、件），每及其他最適條件），每minmin催化催化1 1molmol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量，為底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量，為1IU1IU或或1U1U，1IU=11IU=1mol/minmol/min。 IFCC,2001IFCC,2001年年37373 3KatalKatal單位單位 定義：定義：1Katal1Katal是在規(guī)定條件下，是在規(guī)定條件下，每秒鐘每秒鐘催化催化1mol1mol底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的酶量。酶量。1Katal1Katal1mol/s1mol/s。 IUIU與與KatalKatal單位的關(guān)系：?jiǎn)挝坏年P(guān)系：1katal = 601katal = 6010106 6IUIU，

8、1IU = 16.67nkatal 1IU = 16.67nkatal 10（二）酶活性濃度（二）酶活性濃度 酶的含量嚴(yán)格說(shuō)是指酶分子的質(zhì)量濃度（酶的含量嚴(yán)格說(shuō)是指酶分子的質(zhì)量濃度（g/L,mg/L）,但但人體內(nèi)酶的含量很微量（人體內(nèi)酶的含量很微量（ug/L）,常規(guī)測(cè)定很困難常規(guī)測(cè)定很困難。 酶活性濃度指酶活性濃度指單位體積樣本中的酶活性單位單位體積樣本中的酶活性單位。國(guó)際單位用國(guó)際單位用IU/LIU/L或或U/LU/L表示表示。酶活性濃度才具有臨床可比性，但其多數(shù)情。酶活性濃度才具有臨床可比性，但其多數(shù)情況下都被不嚴(yán)格地稱為酶活性單位乃至酶活性況下都被不嚴(yán)格地稱為酶活性單位乃至酶活性. .

9、1112酶蛋白質(zhì)量濃度表示法酶蛋白質(zhì)量濃度表示法免疫學(xué)方法：利用酶蛋白分子具有抗原性的特點(diǎn)，可以通過(guò)抗原免疫學(xué)方法：利用酶蛋白分子具有抗原性的特點(diǎn)，可以通過(guò)抗原-抗體反抗體反應(yīng)的原理直接測(cè)定應(yīng)的原理直接測(cè)定酶的質(zhì)量（酶的質(zhì)量（ng/L,ug/L）.優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高靈敏度高 可測(cè)定少量酶或者痕量酶可測(cè)定少量酶或者痕量酶 特意性高特意性高 不受體液中其他物質(zhì)影響，如酶抑制劑，激活劑等不受體液中其他物質(zhì)影響，如酶抑制劑，激活劑等 測(cè)定不表現(xiàn)活性的酶蛋白測(cè)定不表現(xiàn)活性的酶蛋白 如酶原，去輔基酶蛋白，無(wú)活性的酶蛋白如酶原，去輔基酶蛋白，無(wú)活性的酶蛋白 同工酶測(cè)定同工酶測(cè)定缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 需要制備足夠

10、量的提純酶作為抗原和具有免疫化學(xué)性質(zhì)的抗血清需要制備足夠量的提純酶作為抗原和具有免疫化學(xué)性質(zhì)的抗血清 測(cè)定步驟多，操作繁瑣測(cè)定步驟多，操作繁瑣 成本高成本高三、酶促反應(yīng)進(jìn)程三、酶促反應(yīng)進(jìn)程 以以產(chǎn)物生成量（或反產(chǎn)物生成量（或反應(yīng)物減少量）為縱坐標(biāo)、應(yīng)物減少量）為縱坐標(biāo)、反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖所作圖所得到的一條曲線，稱為反得到的一條曲線，稱為反應(yīng)進(jìn)程曲線（或反應(yīng)時(shí)間應(yīng)進(jìn)程曲線（或反應(yīng)時(shí)間曲線、速率曲線、時(shí)間曲曲線、速率曲線、時(shí)間曲線）線） t1 t2 時(shí)間時(shí)間t 圖5-1酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線吸光度吸光度A延滯期延滯期線性期線性期非線性期非線性期13（一）延滯期（一）延滯期（lag ph

11、ase、延遲期、延遲期 ）u特點(diǎn)：為反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)速率一開始時(shí)較慢，通常為幾秒到幾分鐘特點(diǎn)：為反應(yīng)的初始階段，反應(yīng)速率一開始時(shí)較慢，通常為幾秒到幾分鐘 t1 t2 時(shí)間t 圖5-1酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線吸光度A線性期非線性期R1R2延滯期孵育期延滯期14（二）線性期（二）線性期 u特點(diǎn)：酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大速度，并且保持恒定速度特點(diǎn)：酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大速度，并且保持恒定速度進(jìn)行反應(yīng)的時(shí)期。進(jìn)行反應(yīng)的時(shí)期。反應(yīng)速度不受底物濃度影響，稱為零級(jí)反應(yīng)。反應(yīng)速度不受底物濃度影響，稱為零級(jí)反應(yīng)。此期間酶活性與酶促反應(yīng)速度呈正比，為此期間酶活性與酶促反應(yīng)速度呈正比，為酶活性測(cè)定的最酶活性測(cè)定的最佳時(shí)期佳時(shí)

12、期，一般為，一般為1-5分鐘。分鐘。15（三）非線性期（三）非線性期（偏離線性期、平坦期偏離線性期、平坦期 ）u進(jìn)入非線性期的原因：進(jìn)入非線性期的原因： 反應(yīng)的不斷進(jìn)行，反應(yīng)的不斷進(jìn)行，底物消耗越來(lái)越多，酶變性失活增加、可逆反底物消耗越來(lái)越多，酶變性失活增加、可逆反應(yīng)增強(qiáng)、產(chǎn)物抑制增加應(yīng)增強(qiáng)、產(chǎn)物抑制增加等使得反應(yīng)速率明顯下降。等使得反應(yīng)速率明顯下降。u特點(diǎn)：特點(diǎn)： 若為單底物的反應(yīng)，則此時(shí)反應(yīng)速率與單底物濃度若為單底物的反應(yīng)，則此時(shí)反應(yīng)速率與單底物濃度SS的一次方的一次方成正比，為成正比，為一級(jí)反應(yīng)一級(jí)反應(yīng)。如果反應(yīng)速度受如果反應(yīng)速度受2 2種或種或2 2種以上物質(zhì)濃度的影種以上物質(zhì)濃度的影

13、響，則反應(yīng)為一級(jí)，二級(jí)，多級(jí)反應(yīng)。響，則反應(yīng)為一級(jí)，二級(jí)，多級(jí)反應(yīng)。此時(shí)酶促反應(yīng)速度不再與酶此時(shí)酶促反應(yīng)速度不再與酶活性成正比?；钚猿烧取?617要準(zhǔn)確要準(zhǔn)確測(cè)定酶活性測(cè)定酶活性，必須找到酶促反應(yīng)的，必須找到酶促反應(yīng)的線性期線性期，即在即在過(guò)量底物過(guò)量底物存在條件下的存在條件下的零級(jí)反應(yīng)期的速度零級(jí)反應(yīng)期的速度，此，此時(shí)測(cè)定的反應(yīng)速度才能代表酶活性，也是檢驗(yàn)酶促時(shí)測(cè)定的反應(yīng)速度才能代表酶活性，也是檢驗(yàn)酶促反應(yīng)和檢測(cè)系統(tǒng)是否適宜的標(biāo)準(zhǔn)。反應(yīng)和檢測(cè)系統(tǒng)是否適宜的標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)手工方法無(wú)法準(zhǔn)確在線性期測(cè)定酶促反應(yīng)速度，傳統(tǒng)手工方法無(wú)法準(zhǔn)確在線性期測(cè)定酶促反應(yīng)速度，故結(jié)果不準(zhǔn)確。故結(jié)果不準(zhǔn)確。自動(dòng)生化儀

14、能方便，準(zhǔn)確找到線性期，結(jié)果可靠準(zhǔn)自動(dòng)生化儀能方便，準(zhǔn)確找到線性期，結(jié)果可靠準(zhǔn)確確。四、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)四、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)n研究?jī)?nèi)容：研究?jī)?nèi)容： 研究研究酶促反應(yīng)的速率酶促反應(yīng)的速率及其及其各種影響因素各種影響因素（如底物濃度、（如底物濃度、酶活性濃度、溫度、酶活性濃度、溫度、pHpH、激活劑和抑制劑等）的科學(xué)、激活劑和抑制劑等）的科學(xué) 指導(dǎo)指導(dǎo)選擇底物種類、確定底物濃度，確定最適溫度、最選擇底物種類、確定底物濃度，確定最適溫度、最適適pHpH、激活劑和抑制劑類型與含量、激活劑和抑制劑類型與含量等，從而準(zhǔn)確測(cè)定酶活性等，從而準(zhǔn)確測(cè)定酶活性或代謝物濃度?；虼x物濃度。n研究意義研究意義:18（一）

15、酶促反應(yīng)（一）酶促反應(yīng)u酶促反應(yīng)式酶促反應(yīng)式u米氏方程：米氏方程：K419（二）（二）Km的含義與意義的含義與意義1 1K Km m的含義的含義: :2maxVv 當(dāng)當(dāng)K Km m=S=S時(shí)，時(shí)， ，可見(jiàn)，可見(jiàn)K Km m值等于反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率值等于反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率V Vmaxmax一半時(shí)的底物濃度。一半時(shí)的底物濃度。2 2KmKm的意義的意義 KmKm是酶的一個(gè)特征性常數(shù)（其他如等電點(diǎn)），是酶的一個(gè)特征性常數(shù)（其他如等電點(diǎn)），KmKm的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)的大小只與酶的性質(zhì)有關(guān)反映酶對(duì)底物親和力的大小反映酶對(duì)底物親和力的大小 選擇酶的最適底物或天然底物選擇酶的最適底物或天然底

16、物 計(jì)算不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)程度計(jì)算不同底物濃度時(shí)的反應(yīng)程度 鑒別酶的種類鑒別酶的種類 如同工酶的測(cè)定如同工酶的測(cè)定判斷可逆反應(yīng)的速率判斷可逆反應(yīng)的速率 判斷酶偶聯(lián)反應(yīng)的限速反應(yīng)判斷酶偶聯(lián)反應(yīng)的限速反應(yīng)計(jì)算工具酶的用量計(jì)算工具酶的用量20（三）（三）Vmax的含義的含義u定義：定義：VmaxVmax表示在一定酶量時(shí)的最大反應(yīng)速率，即酶完全表示在一定酶量時(shí)的最大反應(yīng)速率，即酶完全被底物所飽和時(shí)的反應(yīng)速率，與酶活性濃度呈正比。被底物所飽和時(shí)的反應(yīng)速率，與酶活性濃度呈正比。 u應(yīng)用：計(jì)算酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（應(yīng)用：計(jì)算酶的轉(zhuǎn)換數(shù)（TN，催化常數(shù)，催化常數(shù)Kcat）單位時(shí)間內(nèi)每單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子將底物分子轉(zhuǎn)換

17、成產(chǎn)物的最大值個(gè)酶分子將底物分子轉(zhuǎn)換成產(chǎn)物的最大值 。計(jì)算公式為：計(jì)算公式為： EVTNmax ( (單位是單位是s s-1-1) ) 計(jì)算時(shí)要保證酶的濃度單位與底物的濃度單位一致）計(jì)算時(shí)要保證酶的濃度單位與底物的濃度單位一致）21第三節(jié)第三節(jié) 酶活性的測(cè)定酶活性的測(cè)定n測(cè)定方法分類：測(cè)定方法分類： 按照儀器檢測(cè)方法分類按照儀器檢測(cè)方法分類：分光光度法、濁度法、熒光法、：分光光度法、濁度法、熒光法、放射性核素法、電位滴定法、電極法、量氣法。放射性核素法、電位滴定法、電極法、量氣法。 按照反應(yīng)時(shí)間分類按照反應(yīng)時(shí)間分類；分為；分為定時(shí)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法定時(shí)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法和平衡法。和平衡法。 按照檢測(cè)對(duì)

18、象分類按照檢測(cè)對(duì)象分類：分為直接法和間接法。：分為直接法和間接法。 22一、按照反應(yīng)時(shí)間分類的酶活性測(cè)定方法一、按照反應(yīng)時(shí)間分類的酶活性測(cè)定方法（一）定時(shí)法（一）定時(shí)法u原理：原理： 定時(shí)法是固定時(shí)間法的簡(jiǎn)稱，是指測(cè)定反應(yīng)開始后一段時(shí)間（定時(shí)法是固定時(shí)間法的簡(jiǎn)稱，是指測(cè)定反應(yīng)開始后一段時(shí)間（t1t1t2t2）產(chǎn)物的增加量或底物的減少量以測(cè)定酶活性的方法。）產(chǎn)物的增加量或底物的減少量以測(cè)定酶活性的方法。該方法一般需要該方法一般需要在反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止反應(yīng)在反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、蛋白沉淀劑等終止反應(yīng)。 u特點(diǎn)：特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，因?yàn)樽詈鬁y(cè)定時(shí)酶促反

19、應(yīng)已被終止，故比色時(shí)不需要簡(jiǎn)單，因?yàn)樽詈鬁y(cè)定時(shí)酶促反應(yīng)已被終止，故比色時(shí)不需要保溫設(shè)備，顯色劑的選擇也可不考慮對(duì)酶活性的影響。保溫設(shè)備，顯色劑的選擇也可不考慮對(duì)酶活性的影響。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：如果不做預(yù)試驗(yàn)則無(wú)法了解其酶促反應(yīng)進(jìn)程（如果不做預(yù)試驗(yàn)則無(wú)法了解其酶促反應(yīng)進(jìn)程（t1-t2t1-t2）是否）是否為零級(jí)反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)，故難以確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。，故難以確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。 吸光度A t1時(shí)間 t2圖5-6定時(shí)法的三種反應(yīng)進(jìn)程231定時(shí)法與兩點(diǎn)法、終點(diǎn)法的區(qū)別定時(shí)法與兩點(diǎn)法、終點(diǎn)法的區(qū)別23（二）連續(xù)監(jiān)測(cè)法（二）連續(xù)監(jiān)測(cè)法u原理：原理： 連續(xù)監(jiān)測(cè)法是指在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)測(cè)定產(chǎn)物（或底物）在線性

20、連續(xù)監(jiān)測(cè)法是指在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)連續(xù)測(cè)定產(chǎn)物（或底物）在線性期內(nèi)的生成量（或消耗量）即零級(jí)反應(yīng)速率以測(cè)定酶活性的方法，期內(nèi)的生成量（或消耗量）即零級(jí)反應(yīng)速率以測(cè)定酶活性的方法，又稱速率法、零級(jí)反應(yīng)速率法、斜率法。又稱速率法、零級(jí)反應(yīng)速率法、斜率法。 該方法是在一定的反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi)（至少該方法是在一定的反應(yīng)時(shí)間區(qū)段內(nèi)（至少9 9120s120s）每隔一定時(shí)間）每隔一定時(shí)間（常為（常為2 230s30s）讀取一次吸光度值，連續(xù)測(cè)定多點(diǎn)（至少）讀取一次吸光度值，連續(xù)測(cè)定多點(diǎn)（至少4 4點(diǎn)），點(diǎn)），然然后對(duì)吸光度數(shù)據(jù)作最小二乘法處理，再用線性期內(nèi)的數(shù)據(jù)計(jì)算單位時(shí)后對(duì)吸光度數(shù)據(jù)作最小二乘法處理，再用線性期內(nèi)的

21、數(shù)據(jù)計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)的反應(yīng)速率間內(nèi)的反應(yīng)速率A/minA/min，最后計(jì)算出酶活性。最后計(jì)算出酶活性。vVlALU610min/24KALUmin/K為酶活性濃度定量系數(shù)，為常數(shù)，為摩爾吸光系數(shù)，V溶液體積，v為樣本體積l l l 25u特點(diǎn)：特點(diǎn)：與定時(shí)法相比，屬于與定時(shí)法相比，屬于即時(shí)觀測(cè)，無(wú)需停止酶促反應(yīng)、不需添加其他即時(shí)觀測(cè)，無(wú)需停止酶促反應(yīng)、不需添加其他呈色試劑，呈色試劑，且可將多點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果繪圖連線，快速、直觀查看酶促反且可將多點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果繪圖連線，快速、直觀查看酶促反應(yīng)進(jìn)程，應(yīng)進(jìn)程，很容易找到呈直線的線性期很容易找到呈直線的線性期，檢查到是否偏離零級(jí)反應(yīng)；，檢查到是否偏離零級(jí)反應(yīng)；

22、連續(xù)監(jiān)測(cè)法要求不顯色而是直接測(cè)定底物（或輔助底物即中間底物）連續(xù)監(jiān)測(cè)法要求不顯色而是直接測(cè)定底物（或輔助底物即中間底物）或產(chǎn)物量的變化，因此，在測(cè)定原理上，或產(chǎn)物量的變化，因此，在測(cè)定原理上，可以選擇紫外吸收法或生色可以選擇紫外吸收法或生色原顯色法；原顯色法； 要求能夠準(zhǔn)確地控制溫度、要求能夠準(zhǔn)確地控制溫度、pHpH值和底物濃度等值和底物濃度等，要求儀器具有恒溫，要求儀器具有恒溫裝置及自動(dòng)監(jiān)測(cè)功能，半自動(dòng)及全自動(dòng)生化分析儀都能滿足這些要裝置及自動(dòng)監(jiān)測(cè)功能，半自動(dòng)及全自動(dòng)生化分析儀都能滿足這些要求求 ；測(cè)定結(jié)果常較定時(shí)法高測(cè)定結(jié)果常較定時(shí)法高，因?yàn)樵诿复俜磻?yīng)初始階段底物最充裕，而，因?yàn)樵诿复俜磻?yīng)

23、初始階段底物最充裕，而產(chǎn)物的抑制作用、可逆反應(yīng)、酶變性等均很小，所以吸光度等檢測(cè)信產(chǎn)物的抑制作用、可逆反應(yīng)、酶變性等均很小，所以吸光度等檢測(cè)信號(hào)就比定時(shí)法要高且真實(shí)，因而號(hào)就比定時(shí)法要高且真實(shí)，因而測(cè)定結(jié)果也較定時(shí)法準(zhǔn)確。測(cè)定結(jié)果也較定時(shí)法準(zhǔn)確。 26（一）直接法（一）直接法指直接測(cè)定酶促反應(yīng)產(chǎn)物或底物的理化指標(biāo)以測(cè)定酶活性的方法。指直接測(cè)定酶促反應(yīng)產(chǎn)物或底物的理化指標(biāo)以測(cè)定酶活性的方法。 測(cè)定測(cè)定NADNAD（P P）H H的方法的方法測(cè)定人工合成的色素原底物的方法測(cè)定人工合成的色素原底物的方法測(cè)定耗氧量的方法測(cè)定耗氧量的方法測(cè)定測(cè)定pHpH改變的方法改變的方法 等等 二、按照檢測(cè)對(duì)象分類的

24、酶活性測(cè)定方法二、按照檢測(cè)對(duì)象分類的酶活性測(cè)定方法271 1測(cè)定測(cè)定NADNAD（P P）H H的方法的方法 原理：原理：監(jiān)測(cè)監(jiān)測(cè)340nm340nm吸光度的變化可以反映吸光度的變化可以反映NADNAD（P P）H H量的量的變化，其變化與待測(cè)酶的含量正相關(guān)。變化，其變化與待測(cè)酶的含量正相關(guān)。 對(duì)象：對(duì)象：以以NADNAD（P P）+ +或或NADNAD（P P）H H為輔酶的脫氫酶類為輔酶的脫氫酶類。例。例如如LDLD、G-6-PDG-6-PD、GLDHGLDH等等 。 H丙酮酸乳酸NADHNADLLDH28人工合成的色素原底物人工合成的色素原底物待測(cè)酶待測(cè)酶產(chǎn)物的毫摩爾吸光系數(shù)產(chǎn)物的毫摩爾

25、吸光系數(shù)對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉鹽對(duì)硝基苯酚磷酸二鈉鹽（PNPP-Na2）ALP對(duì)硝基酚（對(duì)硝基酚（PNP）（405nm，pH10.3）18.5L-谷氨酰谷氨酰-3-羧基對(duì)硝基羧基對(duì)硝基苯胺苯胺GGT2-硝基硝基-5-氨基苯甲酸氨基苯甲酸（405nm，pH8.1）9.492-氯氯-硝基酚硝基酚-半乳糖半乳糖-麥麥芽糖苷芽糖苷AMS2-氯酚（氯酚（2-CP）（）（405nm，pH6.0）6.12-氯氯-硝基酚硝基酚-巖藻糖苷巖藻糖苷-巖藻糖苷酶（巖藻糖苷酶（AFU）2-CP（405nm，pH6.5）6.22 2測(cè)定人工合成的色素原底物的方法測(cè)定人工合成的色素原底物的方法 原理：原理： 一些水解酶類或轉(zhuǎn)

26、移酶類通過(guò)酶促反應(yīng)后，其化合物中的某一基團(tuán)一些水解酶類或轉(zhuǎn)移酶類通過(guò)酶促反應(yīng)后，其化合物中的某一基團(tuán)被水解或轉(zhuǎn)移，使被水解或轉(zhuǎn)移，使無(wú)色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩漠a(chǎn)物，這類底物稱為色素原無(wú)色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩漠a(chǎn)物，這類底物稱為色素原底物。底物。根據(jù)這一原理，可以人為地合成一系列底物即人工合成的色素原根據(jù)這一原理，可以人為地合成一系列底物即人工合成的色素原底物后測(cè)定酶活性。底物后測(cè)定酶活性。 底物和測(cè)定對(duì)象：底物和測(cè)定對(duì)象：29（二）間接法（二）間接法 酶偶聯(lián)法酶偶聯(lián)法 化學(xué)法化學(xué)法 是指加入相應(yīng)試劑后是指加入相應(yīng)試劑后間接測(cè)定酶促反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化物或間接測(cè)定酶促反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化物或底物轉(zhuǎn)化物的理化指標(biāo)底物

27、轉(zhuǎn)化物的理化指標(biāo)以測(cè)定酶活性的方法。以測(cè)定酶活性的方法。 301 1酶偶聯(lián)法酶偶聯(lián)法 u原理：原理：在測(cè)定待測(cè)酶在測(cè)定待測(cè)酶ExEx的活性時(shí)，常采用偶聯(lián)一個(gè)工具酶（指示酶的活性時(shí)，常采用偶聯(lián)一個(gè)工具酶（指示酶EiEi）或幾個(gè)工具酶（輔助酶或幾個(gè)工具酶（輔助酶EaEa和指示酶和指示酶EiEi）將待測(cè)酶的某一產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為新的）將待測(cè)酶的某一產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為新的產(chǎn)物，反應(yīng)速率達(dá)到平衡時(shí)，測(cè)定指示酶的反應(yīng)速率來(lái)代表待測(cè)酶的活產(chǎn)物，反應(yīng)速率達(dá)到平衡時(shí)，測(cè)定指示酶的反應(yīng)速率來(lái)代表待測(cè)酶的活性。反應(yīng)模式可簡(jiǎn)化為：性。反應(yīng)模式可簡(jiǎn)化為：DCBAEiEaExEx、Ea、Ei這一連串酶促反應(yīng)稱為酶偶聯(lián)體系這一連串酶促反應(yīng)

28、稱為酶偶聯(lián)體系 零級(jí)反應(yīng)零級(jí)反應(yīng) 一級(jí)反應(yīng)一級(jí)反應(yīng) 一級(jí)反應(yīng)一級(jí)反應(yīng) AKmx BKma u指示酶的反應(yīng)系統(tǒng)：指示酶的反應(yīng)系統(tǒng)： 以以NADNAD（P P）+ +或或NADNAD（P P）H H為輔酶的脫氫酶類作為指示酶，監(jiān)測(cè)其反應(yīng)物為輔酶的脫氫酶類作為指示酶，監(jiān)測(cè)其反應(yīng)物NADNAD（P P）H H于于340nm340nm處紫外吸收或在紫外激發(fā)光處紫外吸收或在紫外激發(fā)光365nm365nm波長(zhǎng)照射下，其在波長(zhǎng)照射下，其在460nm460nm發(fā)射強(qiáng)烈熒光的變化速率的測(cè)定系統(tǒng)發(fā)射強(qiáng)烈熒光的變化速率的測(cè)定系統(tǒng) ； 是偶聯(lián)過(guò)氧化氫（是偶聯(lián)過(guò)氧化氫（H H2 2O O2 2）以過(guò)氧化物酶（）以過(guò)氧化物酶（PODPOD）為指示酶的測(cè)定系統(tǒng)。）為指示酶的測(cè)定系統(tǒng)。)(242222紅色醌亞胺酚 OHAAPOHPODT