ELISA實(shí)驗(yàn)操作中常見問題分析

1、由于ELISA（酶聯(lián)免疫試驗(yàn)）具有靈敏度較高、特異性好的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于各種傳染性疾病的篩查如肝炎、愛滋、優(yōu)生優(yōu)育等。雖然洗板只是ELISA實(shí)驗(yàn)重要環(huán)節(jié)中的一個(gè)，但作為專業(yè)的洗板機(jī)生產(chǎn)廠家，我們必須對(duì)影響ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果各因素有一定的認(rèn)識(shí)。優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。如不注意，就易出現(xiàn)白板、花板、色弱和假陽性等現(xiàn)象。尤其是花板現(xiàn)象（就是空白、陰性、陽性對(duì)照以及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常，而標(biāo)本孔的OD值卻明顯偏高）是各個(gè)廠家洗板機(jī)調(diào)試中經(jīng)常遇到的問題?，F(xiàn)將ELISA實(shí)驗(yàn)操作中注意事項(xiàng)總結(jié)如下，以期給大家?guī)硪恍﹩l(fā)，以改善洗板機(jī)的安裝調(diào)試水平，提高

2、臨床檢測質(zhì)量。1標(biāo)本及采集、貯運(yùn)因素嚴(yán)重溶血，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中，殘留在孔內(nèi)的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽性；混有紅細(xì)胞的血清易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈；如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會(huì)產(chǎn)生假陽性反應(yīng)；標(biāo)本凝固不全，有時(shí)為了爭取時(shí)間快速檢測，常在血液還未開始凝固時(shí)即強(qiáng)行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；采血試管洗滌不徹底、反復(fù)使用易交叉污染；塑料試管能吸附抗原物質(zhì)，樣本久置在塑料管內(nèi)會(huì)使樣本內(nèi)抗原含量下降造成假陰性。血清標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測，嚴(yán)重溶血標(biāo)本禁用。一

3、般說來，在5天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4°C，標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過長導(dǎo)致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需一20C保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存；最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標(biāo)本，肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值，可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶活性；血液標(biāo)本采集后必須使其充分凝

4、固后再分離血清，或標(biāo)本采集時(shí)用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽?、試劑的影響ELISA診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來衡量ELISA反應(yīng)試劑盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學(xué)敏感度不夠，穩(wěn)定性也成問題。也有廠家堅(jiān)持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)地對(duì)待反應(yīng)結(jié)果?；蚬こ炭乖^合成肽抗原有無可比擬的優(yōu)越性，就HCV-ELISA試劑盒來講，第一代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是HCV特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當(dāng)時(shí)的基因工程抗原不全，

5、僅包括了HCV的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提高了?；蚬こ炭乖c合成肽抗原的區(qū)別如下：基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為表達(dá)系統(tǒng)。該類抗原與合成肽相比具有以下特點(diǎn)：a. 分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到數(shù)百個(gè)氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。b. 穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的試劑盒效期只有3-4個(gè)月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。C.基因工

6、程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高試劑盒的靈敏度，提高檢出率。d.純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g(shù)難度較大。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特點(diǎn)：a.分子量太小；b.一般只含有一個(gè)抗原決定簇；c.純度高；d.穩(wěn)定性差。國內(nèi)乙肝兩對(duì)半試劑廠家較多；不同廠家出產(chǎn)的試劑靈敏度與特異性存在一定的差別，資料顯示，不同廠家試劑的特異性和敏感性分別為89.4%99.3%,78%89%存在較大差異。有的廠家酶標(biāo)板孔間A值差大于15%；標(biāo)記酶的活性及顯色液的穩(wěn)定比較差。使用質(zhì)劣的試劑必然導(dǎo)致結(jié)果的假陽性或假

7、陰性。因此。選擇高質(zhì)量的試劑是保證結(jié)果準(zhǔn)確的關(guān)鍵之一。 選擇試劑時(shí)應(yīng)選擇靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性好、批間差小、操作方便省時(shí)的優(yōu)良檢測試劑，國家參比實(shí)驗(yàn)室每年對(duì)各廠家的試劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估并定期公布評(píng)估結(jié)果，可作為選擇試劑的主要依據(jù)。 要注意試劑的批號(hào)和出廠日期，雖然試劑的有效期多為1年。最好選擇剛出廠的試劑使用。不同廠家的試劑不能混用。不同方法學(xué)的檢測試劑，會(huì)使兩對(duì)半結(jié)果出現(xiàn)一些不同。例如：在實(shí)際工作中常用ELISA檢測HBsAg結(jié)果為陰性，而電化學(xué)發(fā)光檢測為陽性。除方法學(xué)的靈敏度外；還存在使用單抗或多克隆抗體試劑的差別。單抗對(duì)變異抗原或亞型乙肝標(biāo)志物檢測存在差異，建議試劑廠家對(duì)劑的制備應(yīng)該考慮

8、亞型及型濃度的問題。3、操作技術(shù)的影響操作過程的控制：嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。操作前將試劑在室溫下平衡3060min。加樣后及時(shí)放人孵箱。標(biāo)本較多時(shí)，要分批操作。按說明步驟嚴(yán)格控制操作時(shí)間，防止孵育時(shí)間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗徹底。(3) 封板溫育時(shí)，各孔一定要封嚴(yán)，防止陽性標(biāo)本的液體蒸發(fā)，產(chǎn)生周邊現(xiàn)象從而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。(4) 用洗板機(jī)洗板時(shí)，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完板后最好在吸水紙(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干：還要防止針口有纖維蛋白或異物，這些異物在洗板的過程中易產(chǎn)生拖帶現(xiàn)象而導(dǎo)致“花板”的出現(xiàn)。(5) 合理安排檢測量，以免反應(yīng)板

9、過多造成洗板等待時(shí)間長。(6) 加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干。(7) 顯色劑盡量在臨用前配制，堅(jiān)持不用過期顯色劑，肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用。(8) 加樣時(shí)保持顯色劑不外流；A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。（9）應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔，整個(gè)操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至最低限度。從而提高檢測的特異性。并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。加樣吸嘴的潔凈與否和吸量的準(zhǔn)確性，直接影響檢測結(jié)果。由于吸嘴構(gòu)造特殊，導(dǎo)致清洗困難，加大了交叉污染的機(jī)會(huì)。建議用一次性吸嘴。加樣器也要經(jīng)常清洗，定期校準(zhǔn)。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在

10、孔壁上部，并注意不可濺出。溫浴影響，在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37°C經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會(huì)造成值偏高或花板。另外溫育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會(huì)偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。96孔酶標(biāo)板結(jié)構(gòu)特別；易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)對(duì)溫度有嚴(yán)格要求，酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同，造成周邊與內(nèi)部孔結(jié)果差異；干浴與

11、水浴存在明顯的差異，盡可能使用水浴，并要求固相板放入水中，減少受熱不均，貼密封膜，防止污物浸入。洗滌在ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液，各種試劑盒的洗液不要混用。聚苯乙

12、烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋。配制洗液應(yīng)用新鮮的和高質(zhì)量的純化水，電導(dǎo)率小于1.5ps/cm，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。手洗條件一致性較差，對(duì)結(jié)果影響較大，防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。半自動(dòng)與全自動(dòng)冼板機(jī)使用不當(dāng)也會(huì)影響結(jié)果，血

13、清中殘留的的纖維蛋白絲或洗滌液析出的結(jié)晶易使洗板機(jī)針小孔全阻塞或半阻塞狀態(tài)，造成未結(jié)合標(biāo)記酶洗脫不徹底，導(dǎo)致“花板”造成假陽性或假陰性；所以操作洗板機(jī)過程中要不時(shí)觀察洗板機(jī)針孔內(nèi)洗液的通暢狀況，及時(shí)糾正，洗板機(jī)不用時(shí)應(yīng)用去離子水清冼幾遍。保證洗板浸泡時(shí)間為40秒左右，孔內(nèi)液體被洗板機(jī)吸得越干凈洗滌效果更好，手工洗板4. 顯色和比色TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長時(shí)間（12-24小時(shí)）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液

14、則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指專用于測讀ELISA結(jié)果吸光度的光度計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下，操作時(shí)室溫宜在15-30C，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2）,兩次測定間不移動(dòng)ELI

15、SA板的位置，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。肉眼判斷結(jié)果時(shí)，顯色淺不易觀察，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須使用酶標(biāo)儀檢測，以保結(jié)果一致性。5.HooK效應(yīng)影響隨著ELISA一步法的應(yīng)用，一些標(biāo)本中抗原含量過高，產(chǎn)生HooK效應(yīng)。影響檢測結(jié)果，采用同步稀釋測定或使用線性范圍高的兩對(duì)半定量法可以減HooK反應(yīng)的發(fā)生。6. 干擾物質(zhì)的影響有人認(rèn)為大約40%的人血清標(biāo)本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果；常見的干擾物質(zhì)有：類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導(dǎo)的抗鼠lg（s）抗體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF

16、因子可與標(biāo)記二抗的FC段法結(jié)合造成假陽性，補(bǔ)體從C1q活化，使一抗和酶標(biāo)二抗的抗體分子發(fā)生變構(gòu)，F(xiàn)c的C1q分子結(jié)合點(diǎn)暴露出來，則補(bǔ)體C1q可將二者連接起來造成假陽性，采用56°C30分鐘滅活補(bǔ)體可降低假陽性率，高濃度的AFP（如孕婦），在儲(chǔ)存過程中可能形成二聚體會(huì)導(dǎo)致本底過深影響檢測結(jié)果。7. 藥物的影響高效價(jià)的乙肝免疫球蛋白會(huì)與HBsAg形成復(fù)合物，影響HBsAg的檢出，所以一些HBsAg陽性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg檢測會(huì)呈陰性反應(yīng)，導(dǎo)致乙肝兩對(duì)半少見模式的出現(xiàn)，如我們常遇到乙肝大三陽的孕婦，為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時(shí)，在孕第8、9、10月常規(guī)注射200mg乙肝免疫球蛋

17、白，不僅影響孕婦HBsAg的檢出；而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現(xiàn)HBsAg陰性，HBeAg陽性和HBcAb陽性等少見模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬IgG抗體能通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)與胎兒血液中的HBsAg結(jié)合形成復(fù)合物；則新生兒HBsAg檢測呈陰性；用0.5M的鹽酸處理標(biāo)本1小時(shí)可提高出率。為預(yù)防乙肝，部分HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的1一2周內(nèi)，血清中可檢出HBsAg成份，形成一過性HBsAg陽性，這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能夠把它檢出；如電化學(xué)發(fā)光法，建議接種乙肝疫苗后1個(gè)月內(nèi)不應(yīng)作HBsAg檢測。8. 抗原自身因素融合蛋白對(duì)基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為

18、例為例，因?yàn)榘坏幕蚬こ炭乖瓰槿诤系鞍?，包含了來自表達(dá)載體的一些序列可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標(biāo)本。少數(shù)HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后絕大多數(shù)感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg,含量在5ng600pg/ml之間。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，到目前為止在獻(xiàn)血員中所發(fā)現(xiàn)的HBsAg攜帶者最低含量為0.2ng/ml。含量高者可達(dá)2000pg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測定為陰性，如暴發(fā)性乙型肝炎、HBV的S基因發(fā)生變異等。急性重癥乙型肝炎，肝細(xì)胞中以合成HBeAg為主，很少或不合成HBsAg,從而使外周血中無HBsAg°HBV的前S/S基因編碼HB

19、sAg,構(gòu)成病毒外膜，根據(jù)所帶亞型決定簇的不同分為adw、adr、ayw和ayr。a決定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg疫苗可引起抗HBs應(yīng)答。如S基因145密碼子變異使得其原來的甘氨酸被精氨酸替代時(shí)，可致a決定簇的抗原性發(fā)生改變，使機(jī)體產(chǎn)生的抗體對(duì)變異株無作用，且可引起HBV感染患者血清中同時(shí)出現(xiàn)HBsAg和抗HBs。同時(shí)乙肝疫苗接種也不能有效預(yù)防此類變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異，變異可發(fā)生在多個(gè)部位，而且?guī)滋幫蛔兛赏瑫r(shí)存在，這些變異有助于病毒攜帶狀態(tài)的持續(xù)存在。近來，有研究表明，前S1區(qū)丟失突變（氨基酸58118）是引起HBsAg

20、陰性的HBV感染的重要原因，S啟動(dòng)子位于前S1,是合成HBsAg的調(diào)節(jié)元件，前S1的丟失突變則會(huì)影響S啟動(dòng)子的功能，進(jìn)而影響HBsAg的合成。總之，優(yōu)質(zhì)的試劑，良好狀態(tài)的儀器，排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。異常結(jié)果描述原因分析對(duì)策試劑已過效期，或不同試劑盒組分混用檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)未過期以及所有組分均屬對(duì)應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑不能混用。顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)板所有孔均無顏色。陽性對(duì)照不顯色。錯(cuò)加、漏加試劑底物、顯色劑A或B嚴(yán)格按說明書的步驟操作,加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致，以減少漏加現(xiàn)象。白板洗板及加樣過程中，酶標(biāo)

21、受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈。終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜锞彌_液配制每次配制時(shí)都應(yīng)看清標(biāo)簽標(biāo)明物質(zhì)。蒸餾水有問題確認(rèn)配制洗液的純化水達(dá)到要求且未污染，與好蒸餾水比較。試劑盒超過期，超過有效期的產(chǎn)品可能會(huì)產(chǎn)生很弱的信號(hào)；試劑盒沒有按規(guī)定進(jìn)行保存，受高溫影響；實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)試劑未過期。不要將試劑盒長時(shí)間置于常溫下，按使用規(guī)定儲(chǔ)藏。試劑、樣品用前未平衡至室溫從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應(yīng)置室溫平衡20分鐘左右。顯色實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，包括陽性對(duì)照、質(zhì)控在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡。加入試劑的體積和時(shí)間有誤，移液器計(jì)量不準(zhǔn),

22、吸嘴內(nèi)水分太多或不清潔；確定所使用的試劑體積正確，加入時(shí)間適當(dāng)。校正移液器，移液器與吸嘴配合要緊密吻合。移液不宜太快,排放應(yīng)完全。弱、靈敏度低洗板及加樣過程中，酶標(biāo)受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力；確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈，確認(rèn)配制洗液的純化水達(dá)到要求且未受污染。孵育時(shí)間及孵育溫度未達(dá)到要求，反應(yīng)板放入培養(yǎng)箱時(shí)注意溫度并及時(shí)調(diào)整。孵育溫度應(yīng)控制在37-38°C，孵育時(shí)間嚴(yán)格按照說明書操作。保溫期內(nèi)不宜多開門，以免影響保溫。洗板次數(shù)過多，或濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求;洗滌沖擊力太大。浸泡時(shí)間太長；嚴(yán)格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板,減小洗滌

23、沖擊力，按說明書要求置留洗滌液時(shí)間和洗滌次數(shù)。顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入；顯色劑滴瓶垂直向下，持力均勻，滴速不宜過快，先加顯色劑A,后加顯色劑B,不可將A、B液混合后加入。靈敏度過高、板底高、高背景底物作用時(shí)間不夠；準(zhǔn)確定時(shí)。蒸餾水水質(zhì)有問題；測定蒸餾水配制試劑對(duì)酶免疫法的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，陰陽性對(duì)照正常，質(zhì)控正常,但臨床標(biāo)本感覺顯色較弱陰陽性對(duì)照正常，但質(zhì)控、參考品或個(gè)別弱陽性標(biāo)本未能檢出。終止后，目測結(jié)果正常，但酶標(biāo)儀讀值結(jié)果偏低終止后，整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色；或陰陽性對(duì)照、質(zhì)控正常，標(biāo)本陰性標(biāo)本OD值過高。出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳孔現(xiàn)象待測標(biāo)本中可能不含強(qiáng)陽性標(biāo)本，故結(jié)果

24、可能是正常的如有懷疑，可復(fù)檢標(biāo)本加入疊氮鈉作為防腐劑酶免實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用proclin、硫柳汞等其他防腐劑未達(dá)要求的孵育溫度及孵育時(shí)間可檢出強(qiáng)陽性標(biāo)本，但質(zhì)控或弱陽性標(biāo)本受溫度變化影響較大而被未檢出。確認(rèn)孵育的溫度及孵育時(shí)間達(dá)到要求。質(zhì)控品或標(biāo)本高溫放置過久，或質(zhì)控品或標(biāo)本避免反復(fù)凍融。標(biāo)本在一周內(nèi)使用的，可被反復(fù)凍融致待測物滴度下降，存于2-8°C，如需長期保存，應(yīng)置于-20°C以下保存。而未能檢出質(zhì)控品應(yīng)小量分裝，并置于-20C以下保存。儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配。重新設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配。酶標(biāo)儀參數(shù)設(shè)定不正確。重新設(shè)定酶

25、標(biāo)儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配。整板的黃板現(xiàn)象可能是由于錯(cuò)加其他試劑造成,如同時(shí)操作兩對(duì)半試劑時(shí)，測HbsAb板用于測HBsAg等；實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)所有組分均屬于對(duì)應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑不能混用。酶標(biāo)對(duì)吸頭的污染以及對(duì)盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現(xiàn)象；避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器的干凈。顯色劑在光照條件下放置過久,實(shí)驗(yàn)前已變藍(lán)顯色劑A、B未使用前避光保存孵育溫度過高或孵育時(shí)間過長;孵育溫度應(yīng)控制在37-38C，孵育時(shí)間嚴(yán)格按照說明書操作。未按要求洗板。特別是洗滌時(shí)每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現(xiàn)象嚴(yán)格按說明書要求洗板?；ò?，一般是由于臨床標(biāo)

26、本的收集、處理和保存方法不當(dāng)造成放置時(shí)間（自然放置12h）及離心轉(zhuǎn)速（3000r/min）、離心時(shí)間（15min）應(yīng)引起注意。樣品離心不完全,反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分；充分離心，3000rpm6分鐘以上。加樣時(shí)交叉污染；加標(biāo)本時(shí)盡量避免交叉污染。如盛標(biāo)本的試管周圍常有血痂，易脫落，應(yīng)遠(yuǎn)離酶標(biāo)板。手工洗板造成的交叉污染手工洗板時(shí)前3次注洗液后應(yīng)立即棄去，后幾次再設(shè)定浸泡時(shí)間，可減少交叉污染洗板機(jī)加液頭堵塞導(dǎo)致加液不疏通加液頭，使洗板時(shí)每孔均注滿洗液，吸液時(shí)殘留量滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔要小。拍板時(shí)交叉污染洗板完畢拍板時(shí)用合適的吸水紙巾，不要把無關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔，并盡量不要在同位置拍，以免交叉污染。假陽性假陽性現(xiàn)象是一個(gè)綜合現(xiàn)象，可參考上文"靈敏度過高、板底高、高背景”中的分析。這里只列舉常見的原因及對(duì)策。計(jì)算Cutoff值時(shí)使用的公式不正確，導(dǎo)致計(jì)算得出的CutOff值過低，從而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性CutOff值計(jì)算公式應(yīng)嚴(yán)格參照所屬產(chǎn)品的說明書，應(yīng)注意各個(gè)酶免產(chǎn)品的Cutoff值計(jì)算公式不盡相同。洗板時(shí)未能注滿洗液或洗板次數(shù)、浸泡時(shí)間不夠，洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留導(dǎo)致