生化試驗(yàn)觀察血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力變化

1、實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六 觀察血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力變化觀察血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力變化Experiment 6 Observing Enzyme Activity Changes of Alanine Aminotransferase in Sample一、目的要求一、目的要求1、了解血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力變化的意義、了解血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力變化的意義2、掌握血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定方法、掌握血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力的測(cè)定方法二、相關(guān)知識(shí)點(diǎn)二、相關(guān)知識(shí)點(diǎn)1. 轉(zhuǎn)氨作用轉(zhuǎn)氨作用 transamination2. 氨基轉(zhuǎn)移酶氨基轉(zhuǎn)移酶 轉(zhuǎn)氨酶（轉(zhuǎn)氨酶（aminotransferase，transaminase） 催化氨基

2、酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶 谷丙轉(zhuǎn)氨酶谷丙轉(zhuǎn)氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又稱丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶又稱丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶alanine aminotransferase ALT谷草轉(zhuǎn)氨酶谷草轉(zhuǎn)氨酶 glutamic oxaloacetic transaminase GOT又稱天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶又稱天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 aspartate transaminase, AST3.轉(zhuǎn)氨作用的機(jī)制：轉(zhuǎn)氨作用的機(jī)制：4轉(zhuǎn)氨作用的意義轉(zhuǎn)氨作用的意義正常時(shí)轉(zhuǎn)氨酶主要分布在細(xì)胞內(nèi)，血清中酶活正常時(shí)轉(zhuǎn)氨酶主要分布在細(xì)胞內(nèi)，血清中酶活力很低力很低GOT以以心

3、臟細(xì)胞心臟細(xì)胞中活力最大，其次為中活力最大，其次為肝臟細(xì)胞肝臟細(xì)胞GPT則以則以肝臟細(xì)胞肝臟細(xì)胞中活力最大中活力最大正常組織正常組織異常組織異常組織心臟心臟 肝臟肝臟心臟心臟 肝臟肝臟細(xì)胞細(xì)胞中酶活力中酶活力GOT高高 GOT/GPT高高細(xì)胞破損酶溢出細(xì)胞破損酶溢出血清血清中酶活力中酶活力GOT低低 GOT/GPT低低GOT升高升高 GOT/GPT 升高升高 5.谷丙轉(zhuǎn)氨酶的臨床意義谷丙轉(zhuǎn)氨酶的臨床意義如果如果GPT血清值超過(guò)正常上限血清值超過(guò)正常上限23倍，并持續(xù)兩倍，并持續(xù)兩周以上，表明有肝膽疾病存在的可能。周以上，表明有肝膽疾病存在的可能。ALT的正常上限是的正常上限是40單位，單位，2

4、.5倍為倍為100單位，單位，20倍為倍為800單位。單位。三、實(shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)原理丙酮酸二硝基苯腙紅棕色2,4-二硝基苯肼SUBSTRATEPyruvate dinitrate phenylhydrazone2,4-dinitrate phenylhydrazinealanine-ketoglutarateRed brownpyruvic acidpyrivic acid glutamic acidSALT單位的定義是：?jiǎn)挝坏亩x是：1ml 血清在血清在37與底物作與底物作用用30min，每產(chǎn)生，每產(chǎn)生2.5g丙酮酸所需酶的量為一個(gè)丙酮酸所需酶的量為一個(gè)SALT單位。單位。四、實(shí)驗(yàn)操作四、實(shí)

5、驗(yàn)操作1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制試劑試劑 管號(hào)管號(hào)012345丙酮酸丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液，mlSALT底物溶液底物溶液，ml磷酸緩沖液，磷酸緩沖液，ml0.000.500.100.050.450.100.100.400.100.150.350.100.200.300.100.250.250.1037水浴中保溫水浴中保溫10min2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼 0.500.500.500.500.500.5037水浴保溫水浴保溫20min 氫氧化鈉氫氧化鈉ml555555室溫下靜置室溫下靜置10min 10min 蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，于蒸餾水調(diào)零點(diǎn)，于520nm520nm處測(cè)吸光度處測(cè)吸光度 1.

6、為什么在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)要加入底物溶液為什么在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)要加入底物溶液2.為什么加入底物溶液的體積不同，對(duì)反應(yīng)沒(méi)有影響為什么加入底物溶液的體積不同，對(duì)反應(yīng)沒(méi)有影響3.怎么計(jì)算丙酮酸的質(zhì)量怎么計(jì)算丙酮酸的質(zhì)量丙酮酸微克數(shù)丙酮酸微克數(shù)- -吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線2 SALT活力測(cè)定：潔凈干燥試管活力測(cè)定：潔凈干燥試管4支，即支，即測(cè)定管、對(duì)照管各測(cè)定管、對(duì)照管各2支支 試劑試劑測(cè)定管測(cè)定管對(duì)照管對(duì)照管血清，血清， mlSALT底物溶液，底物溶液， ml0.10.50.1_37水浴水浴30min2,4-二硝基苯肼溶液，二硝基苯肼溶液， mlSALT底物溶液，底物溶液， ml0.5_0.50.

7、537水浴水浴20min0.4mol/L氫氧化鈉溶液，氫氧化鈉溶液， ml5.05.0室溫下靜置室溫下靜置10min 1.4根干燥試管的用途是什么？根干燥試管的用途是什么？2.樣品測(cè)定為什么要使用對(duì)照管？樣品測(cè)定為什么要使用對(duì)照管？3.樣品測(cè)定的酶反應(yīng)怎樣終止？樣品測(cè)定的酶反應(yīng)怎樣終止？4.血清樣品和底物在使用前最好提前放置于水浴中預(yù)熱，血清樣品和底物在使用前最好提前放置于水浴中預(yù)熱，保證反應(yīng)時(shí)的溫度的準(zhǔn)確性保證反應(yīng)時(shí)的溫度的準(zhǔn)確性5.反應(yīng)溫度和計(jì)時(shí)要準(zhǔn)確反應(yīng)溫度和計(jì)時(shí)要準(zhǔn)確SALT活力活力=測(cè)定管微克數(shù)測(cè)定管微克數(shù)對(duì)照管微克數(shù)對(duì)照管微克數(shù) 2.50.1 （單位）（單位） 五、注意事項(xiàng)五、注意

8、事項(xiàng)1. 2，4-二硝基苯肼可與有酮基的化合物作用形成苯腙二硝基苯肼可與有酮基的化合物作用形成苯腙2. 吸量應(yīng)準(zhǔn)確，嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間和溫度。吸量應(yīng)準(zhǔn)確，嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間和溫度。3. 在測(cè)定在測(cè)定SALT活力時(shí)，應(yīng)事先將底物、血清在活力時(shí)，應(yīng)事先將底物、血清在37水浴中恒水浴中恒溫溫4. 溶血標(biāo)本不宜采用，因血細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活力較高，影響測(cè)定溶血標(biāo)本不宜采用，因血細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活力較高，影響測(cè)定結(jié)果。結(jié)果。5在測(cè)定時(shí)，如酶活力較大（大于在測(cè)定時(shí)，如酶活力較大（大于100單位），應(yīng)將樣品稀釋單位），應(yīng)將樣品稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。后再進(jìn)行測(cè)定。六、專業(yè)詞匯六、專業(yè)詞匯 glutamic-pyruvic tr

9、ansminase GPT alanine aminotransferase ALTglutamic oxaloacetic transaminase GOT aspartate transaminase, ASTenzyme activityserumAminotransferase/ transaminasecatalyzealanine-ketoglutarateglutamic acidpyruvic acidalkalisubstrateABSTRACT Observing Enzyme Activity Changes of Alanine Aminotransferase in

10、Sample Abstract: Objetcive: To determine the activity of serum ALT in sample. Method: SALT was measured by Reitman-Frankel colorimetric end point method Results: The normal SALT activity is ( ) unit, the abnormal SALT activity is ( ) unit. Conclusion: The activity of SALT in abnormal sample is much

11、higher than that in normal sample Key Words: alanine aminotransferase， aspartate transaminase, enzyme activity, serum, -ketoglutarate, substrate,（1）draw calibration curvetubesAdd standard pyrivic acid solution, SALT substrate solution and phosphate bufferWater bathing at 37 for 10Add 2,4-dinitrate p

12、henylhydrazine and water bath at 37 for 20Add NaOH solution and keep in room temperature for 10Assay at 520nm（2）determining the activity of SALTNormal tubesAbnormal tubesseraSALT substrate solutionsera_Water bathing at 37 for 30Water bathing at 37 for 302,4-dinitrate phenylhydrazine2,4-dinitrate phenylhydrazine_SALT substrate sol