微波輔助萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1、微波輔助萃取微波輔助萃取氣相色譜氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用質(zhì)譜聯(lián)用 分析石蒜中的加蘭他敏分析石蒜中的加蘭他敏 指導(dǎo)老師：指導(dǎo)老師： 李攻科教授李攻科教授報(bào)告人：報(bào)告人： 汪軍霞汪軍霞1. 前言前言 u前蘇聯(lián)科學(xué)家首次分離出了加蘭他敏。前蘇聯(lián)科學(xué)家首次分離出了加蘭他敏。u加蘭他敏是一種具有可逆性和選擇性的加蘭他敏是一種具有可逆性和選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑（乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChE），可以），可以作為治療作為治療AD的藥物。的藥物。 1.1 加蘭他敏及其氫溴酸鹽的化學(xué)性質(zhì)和組成加蘭他敏及其氫溴酸鹽的化學(xué)性質(zhì)和組成分子式分子式 ：C17H21NO3 分子量分子量 ：287.36化學(xué)名稱化學(xué)名稱 ：4a,

2、5,9,10,11,12-Hexahydro-3-methoxy-11-methyl-6H-benzofuro3a,3,2-ef2benzazepin-6-ol 1.2 分析研究現(xiàn)狀分析研究現(xiàn)狀u藥理作用研究概況藥理作用研究概況u加蘭他敏的傳統(tǒng)提取方法加蘭他敏的傳統(tǒng)提取方法u加蘭他敏的分析檢測方法加蘭他敏的分析檢測方法1.2.1 藥理作用研究概況藥理作用研究概況u重癥肌無力重癥肌無力u脊髓前角灰質(zhì)炎（小兒麻痹癥）后遺癥脊髓前角灰質(zhì)炎（小兒麻痹癥）后遺癥u術(shù)后腸肌麻痹術(shù)后腸肌麻痹u尿潴留尿潴留 u解箭毒解箭毒u阿爾茨海默病阿爾茨海默病1.2.1.1 藥理作用特點(diǎn)藥理作用特點(diǎn)u具有可逆性和選擇性的

3、乙酰膽堿酯酶抑具有可逆性和選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑（制劑（AChE）u作用時間長作用時間長u無毒性或致癌作用無毒性或致癌作用u 耐受性好耐受性好 1.2.2 加蘭他敏的傳統(tǒng)提取方法概述加蘭他敏的傳統(tǒng)提取方法概述u傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝：將石蒜通過乙醇熱提，洗傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝：將石蒜通過乙醇熱提，洗滌，萃取，重結(jié)晶，得到氫溴酸加蘭他敏滌，萃取，重結(jié)晶，得到氫溴酸加蘭他敏原料藥。原料藥。u缺點(diǎn)：能耗高、原輔料損耗大、生產(chǎn)周期缺點(diǎn)：能耗高、原輔料損耗大、生產(chǎn)周期 長，而且加蘭他敏提取不完全。長，而且加蘭他敏提取不完全。 1.2.3 加蘭他敏的分析檢測方法綜述加蘭他敏的分析檢測方法綜述u薄層色譜（薄層色譜（TLC

4、）u高效液相色譜（高效液相色譜（HPLC） u氣相色譜法（氣相色譜法（GC） u免疫分析法（免疫分析法（IA） u高效毛細(xì)管電泳（高效毛細(xì)管電泳（HPCE）u聯(lián)用方法聯(lián)用方法1.3 微波輔助萃取技術(shù)微波輔助萃取技術(shù)u微波輔助萃取原理微波輔助萃取原理u微波輔助萃取特點(diǎn)微波輔助萃取特點(diǎn)u微波輔助萃取系統(tǒng)微波輔助萃取系統(tǒng)uMAE在植物提取中的應(yīng)用在植物提取中的應(yīng)用1.3.1 微波輔助萃取原理微波輔助萃取原理 u微波加熱有兩種機(jī)理：離子傳導(dǎo)和偶極微波加熱有兩種機(jī)理：離子傳導(dǎo)和偶極子轉(zhuǎn)動。子轉(zhuǎn)動。u物質(zhì)吸收微波的程度主要取決于其介電物質(zhì)吸收微波的程度主要取決于其介電常數(shù)，被萃取物質(zhì)進(jìn)入介電常數(shù)小，微常數(shù)

5、，被萃取物質(zhì)進(jìn)入介電常數(shù)小，微波吸收能力相對較差的萃取劑中波吸收能力相對較差的萃取劑中 。 1.3.2 微波輔助萃取特點(diǎn)微波輔助萃取特點(diǎn)u升溫速度快升溫速度快u加熱均勻加熱均勻u選擇性好選擇性好u萃取效率高萃取效率高u伴有生物效應(yīng)伴有生物效應(yīng) 1.3.3 微波輔助萃取系統(tǒng)微波輔助萃取系統(tǒng) 高壓密閉微波萃取系統(tǒng)高壓密閉微波萃取系統(tǒng) ：u 磁控管磁控管u 波導(dǎo)管波導(dǎo)管u 微波腔微波腔u 波形攪拌器波形攪拌器u 循環(huán)裝置循環(huán)裝置u 轉(zhuǎn)臺轉(zhuǎn)臺 1.3.4 MAE在植物提取中的應(yīng)用在植物提取中的應(yīng)用 u最早的報(bào)道來自最早的報(bào)道來自1986年，匈牙利學(xué)者年，匈牙利學(xué)者Ganzler K用微波提取了羽扇豆、

6、玉米等作物中的油脂、用微波提取了羽扇豆、玉米等作物中的油脂、棉籽酚等有效成分棉籽酚等有效成分 。u國內(nèi)外已有很多將國內(nèi)外已有很多將MAE應(yīng)用于中藥中有效成應(yīng)用于中藥中有效成分提取的文獻(xiàn)報(bào)道。分提取的文獻(xiàn)報(bào)道。u本實(shí)驗(yàn)室的研究人員在這方面也做了大量的本實(shí)驗(yàn)室的研究人員在這方面也做了大量的工作。工作。 2 實(shí)驗(yàn)部分實(shí)驗(yàn)部分u儀器及操作條件儀器及操作條件u試劑和樣品試劑和樣品u樣品處理過程樣品處理過程u定性和定量定性和定量2.1 儀器及操作條件儀器及操作條件 儀器儀器uMars型微波爐（型微波爐（CEM，USA）；）；uR201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申科機(jī)械研究所）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申科機(jī)械研究所）；uH

7、P-6890GC-5973MSD配配G1701B.02.05工作站工作站（Hewlett-Packard，USA）;uDB-5MS熔融毛細(xì)管柱（熔融毛細(xì)管柱（J&W，CA）。）。操作條件操作條件u色譜條件：升溫程序初溫色譜條件：升溫程序初溫150 ，保持，保持3 min，以，以6 / min的速度升至的速度升至300 ，保持保持5 min。進(jìn)樣口溫度。進(jìn)樣口溫度250 ，不分流，不分流進(jìn)樣。載氣為高純氦氣，流速進(jìn)樣。載氣為高純氦氣，流速1.0 mL / min。u質(zhì)譜條件：接口溫度質(zhì)譜條件：接口溫度280 ，EI，電子，電子能量能量70 eV，離子源溫度，離子源溫度230 ，四極桿，四

8、極桿溫度溫度150 ，質(zhì)量掃描范圍，質(zhì)量掃描范圍50 550 amu。 2.2 試劑和樣品試劑和樣品u氫溴酸加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品購自氫溴酸加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。公司。u甲醇、乙醇、石油醚（沸程：甲醇、乙醇、石油醚（沸程：90120 ）、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、鹽酸、）、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、鹽酸、濃氨水、碳酸鈉（分析純試劑，廣州化濃氨水、碳酸鈉（分析純試劑，廣州化學(xué)試劑廠）。學(xué)試劑廠）。u石蒜：鱗莖棕黑色片狀物，有特殊香味石蒜：鱗莖棕黑色片狀物，有特殊香味。2.3 樣品處理過程樣品處理過程u前處理：前處理： 粉碎，過篩，儲存在干燥器中。粉碎，過篩，儲存在干燥器中。u微波輔助萃?。憾糠Q取樣

9、品放入微波微波輔助萃?。憾糠Q取樣品放入微波罐中，加入一定體積的萃取溶劑，在一罐中，加入一定體積的萃取溶劑，在一定的控制溫度下萃取一定的時間。取出定的控制溫度下萃取一定的時間。取出萃取液，過濾，濾液旋干后甲醇溶解，萃取液，過濾，濾液旋干后甲醇溶解，定容至定容至5 mL。u乙醇加熱回流萃?。簻?zhǔn)確稱取乙醇加熱回流萃取：準(zhǔn)確稱取1 g1 g石蒜石蒜樣品，放入圓底燒瓶中，加入一定體積樣品，放入圓底燒瓶中，加入一定體積的萃取溶劑，水浴加熱回流的萃取溶劑，水浴加熱回流2 h2 h后，冷后，冷卻過濾，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇定卻過濾，再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇定容至容至5 mL5 mL，取，取1 L1 L用用

10、GC-MSGC-MS測定。測定。2.4 定性和定量定性和定量 采用未經(jīng)衍生化的采用未經(jīng)衍生化的GC-MS方法方法進(jìn)行定性，以峰面積進(jìn)行定性，以峰面積定量，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量定量，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 L。 圖一圖一 加蘭他敏甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖加蘭他敏甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖4.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.000200000400000600000800000100000012000001400000160000018000002000000220000024000002600000280000

11、030000003200000340000036000003800000Time-AbundanceTIC: 0114S01.D 4.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.0002000004000006000008000001000000120000014000001600000180000020000002200000240000026000002800000300000032000003400000360000038000004000000Time-AbundanceTIC: 0115Y3M

12、P.D21 圖二圖二 石蒜樣品的甲醇溶液色譜圖（標(biāo)記為石蒜樣品的甲醇溶液色譜圖（標(biāo)記為1的是加蘭他敏的是加蘭他敏的峰）的峰）3 結(jié)果與討論結(jié)果與討論u微波萃取溶劑的選擇微波萃取溶劑的選擇u微波條件的優(yōu)化微波條件的優(yōu)化u微波輔助萃取方法的線性范圍、檢出限、微波輔助萃取方法的線性范圍、檢出限、回收率和精密度回收率和精密度u和傳統(tǒng)方法的對比和傳統(tǒng)方法的對比3.1 微波萃取溶劑的選擇微波萃取溶劑的選擇u正確選擇萃取溶劑是實(shí)現(xiàn)高效率萃取的關(guān)鍵正確選擇萃取溶劑是實(shí)現(xiàn)高效率萃取的關(guān)鍵 步驟。步驟。uMAE中，所選的溶劑應(yīng)滿足以下條件：中，所選的溶劑應(yīng)滿足以下條件： 1 具有吸收微波及將微波轉(zhuǎn)化為熱能的具有吸

13、收微波及將微波轉(zhuǎn)化為熱能的 能力；能力； 2 能夠選擇性的從樣品基體中將待測物分離萃能夠選擇性的從樣品基體中將待測物分離萃 取出來；取出來； 3 方便于后續(xù)處理過程方便于后續(xù)處理過程。 表表1 不同溶劑萃取效率的比較不同溶劑萃取效率的比較 溶劑溶劑 甲醇甲醇 乙醇乙醇丙酮丙酮 乙酸乙酯乙酸乙酯加蘭他敏加蘭他敏的含量的含量0.02320.0064 3.2微波條件的優(yōu)化微波條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)號實(shí)驗(yàn)號顆 粒 度顆 粒 度/mesh溶劑體積溶劑體積/ml輻射溫度輻射溫度/ C 輻射時間輻射時間 /min 峰面積峰面積相對峰面積相對峰面積 1 2040 10 65 511906302 36.8 2 204

14、0 20 75 1521394576 66.1 3 2040 30 85 2527012145 83.5 4 4060 10 75 2522631878 69.9 5 4060 20 85 532366940 100 6 4060 30 65 1531475106 97.2 7 60 10 85 1518904841 58.4 8 60 20 65 2521981459 67.9 9 60 30 75 525350629 78.3表表2 微波萃取條件的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及峰面積結(jié)果（微波萃取條件的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及峰面積結(jié)果（OAD9(43)） 表表3 各因素不同水平對應(yīng)的峰面積之和及平均值（各因素不同

15、水平對應(yīng)的峰面積之和及平均值（% ）注：注：Ki峰面積之和；峰面積之和；ki峰面積平均值。峰面積平均值。 顆粒度顆粒度 mesh 溶劑體積溶劑體積 mL 輻射溫度輻射溫度 輻射時間輻射時間minK1 60313023 53443021 65362867 69623871K2 86473924 75742975 69377083 71774523K3 66236929 83837880 78283926 71625482k1 20104341 17814340 21787622 23207957k2 28824641 25247658 23125694 23924841k3 22078976 2

16、7945960 26094642 23875161 圖三圖三 顆粒度、溶劑體積、控制溫度、輻射時間于萃取效率的影響顆粒度、溶劑體積、控制溫度、輻射時間于萃取效率的影響 0.00E+001.00E+072.00E+073.00E+074.00E+075.00E+076.00E+077.00E+078.00E+079.00E+07回收率顆粒度溶劑體積輻射溫度輻射時間影響因素水平1水平2水平3 表表4 優(yōu)化的微波萃取條件優(yōu)化的微波萃取條件 顆粒度顆粒度mesh溶劑體積溶劑體積 mL輻射溫度輻射溫度 輻射時間輻射時間 min 4060 20 8553.3 微波輔助萃取方法的線性范圍、微波輔助萃取方法的

17、線性范圍、檢出限、回收率和精密度檢出限、回收率和精密度 表表5 線性范圍、檢出限、回收率和精密度線性范圍、檢出限、回收率和精密度線性方程線性方程Y=3.3048E5X1.2784E7線性相關(guān)系數(shù)線性相關(guān)系數(shù)R0.9996線性范圍線性范圍10 100 mgL-1檢出限檢出限3.42 mgL-1回收率回收率99.3 %RSD7.9 %(n=6)3.4 和傳統(tǒng)方法的對比和傳統(tǒng)方法的對比 表表6 微波萃取法與乙醇加熱回流萃取法測定微波萃取法與乙醇加熱回流萃取法測定加蘭他敏的結(jié)果比較加蘭他敏的結(jié)果比較 加蘭他敏的含量加蘭他敏的含量/ mgL-1 RSD/%(n=6)萃取時間萃取時間/min微波萃取法微波

18、萃取法 96.64.45 乙醇加熱回乙醇加熱回流萃取法流萃取法99.4 9.91204. 結(jié)論結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)建立了本實(shí)驗(yàn)建立了MAEMAEGCGCMSMS分析石蒜中加蘭分析石蒜中加蘭他敏的方法，并且利用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了他敏的方法，并且利用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了微波萃取測定石蒜樣品中加蘭他敏的條件微波萃取測定石蒜樣品中加蘭他敏的條件, ,方方法平均回收率法平均回收率99.3 %99.3 %，檢出限，檢出限3.42 mgL3.42 mgL-1-1，RSD = 4.4 %RSD = 4.4 %，線性范圍，線性范圍10 10 100 mgL 100 mgL-1-1。將本方法與乙醇加熱回流提取法相比，結(jié)果將本方法與乙醇加熱回流提取法相比，結(jié)果表明本方法省時、精密度好、操作簡便，適表明本方法省時、精密度好、操作簡便，適合于石蒜中加蘭他敏的快速測定。合于石蒜中加蘭他敏的快速測定。 致致 謝謝 u在本論文的研究工作和寫作過程中，得到了許多人的在本論文的研究工作和寫作過程中，得到了許多人的指導(dǎo)、關(guān)心和幫助。指導(dǎo)、關(guān)心和幫助。u首先，要衷心感謝我的導(dǎo)師李攻科教授，感