高效液相色譜法培訓(xùn)課件

1、高效液相色譜法（HPLC）是60年代末以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論與實驗方法，流動相用高壓泵輸送，采用高效固定相和在線檢測等手段發(fā)展而成的分離分析方法 。與氣相色譜法相比具有：適用范圍廣，樣品預(yù)處理簡單，分離效率高，流動相選擇范圍廣，檢測方法多為非破壞性的，流出組分可回收等優(yōu)點(diǎn)。第一節(jié) 概述HPLC液-固吸附液-液分配正相色譜反相色譜一般反相色譜離子對色譜離子抑制色譜離子交換色譜一般離子交換色譜離子色譜氨基酸分析空間排斥色譜凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜假相色譜膠束色譜環(huán)糊精色譜親合色譜，手性色譜，毛細(xì)管電泳鍵合相色譜n正相色譜正相色譜（normal phase）n流動相極性小于固定

2、相極性的分配色譜法稱為正相分配色譜。常用的分析柱有:n氨基柱、氰基柱、硅膠柱。n常用流動相為極性小的有機(jī)溶劑。n反相色譜反相色譜（reversed phase）n流動相極性大于固定相極性的分配色譜法稱為反相分配色譜法。常用的分析柱有：ODS( C18)， C8， C2。n常用流動相為甲醇-水，乙腈-水。n離子抑制色譜離子抑制色譜（ion suppression chromatography）調(diào)節(jié)流動相的pH值，抑制組分的解離，增加組分在固定相中的溶解度，改善峰形，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸和弱堿的目的。n離子對色譜離子對色譜（ion pair chromatography）將反離子加入流動相中，與呈解

3、離狀態(tài)的被測物作用，生成脂溶性的中性離子對絡(luò)合物，從而增加了被測物在非極性固定相中的溶解度，改善分離效果，達(dá)到分離目的。n常用反離子有：季銨鹽 用于酸類 烷基磺酸鹽用于堿類離子色譜法離子色譜法（ ion chromatography ）離子色譜是由經(jīng)典的離子交換色譜發(fā)展起來的一種液相色譜技術(shù)，利用物質(zhì)在離子交換柱上遷移的差異而達(dá)到分離，用于親水性陰陽離子的測定。根據(jù)是否采用抑制柱，可分為抑制型離子色譜和非抑制型離子色譜。n空間排斥色譜（空間排斥色譜（steric exclusion ）n也稱凝膠色譜，依據(jù)被分離組分分子尺寸與凝膠空徑大小之間的相對關(guān)系而分離，類似于分子篩作用。在一定分子線團(tuán)尺寸

4、內(nèi)，分子越大，保留時間越短。n凝膠滲透以有機(jī)溶劑為流動相n凝膠過濾以水溶液為流動相n對于相同化學(xué)組成的高分子化合物，其分子尺寸大小與分子量成正比，因此凝膠色譜可以研究高分子化合物的分子量分布。膠束色譜膠束色譜(micellar chromatography)表面活性劑在水中超過某一濃度（臨界濃度）時，多余的表面活性劑不再溶解，聚集而成膠束（膠粒）。以膠束分散體系為流動相的色譜法稱為膠束色譜法。它的流動相為膠束多相分散體系，不是真溶液；流動相中不含有機(jī)溶劑。因膠束色譜法的流動相是多相分散體系，在整個色譜體系中又增加了一相，故也被稱為假相色譜（pseudo phase chromatography

5、）。n手性色譜手性色譜(chiral chromatography)n用于分離手性藥物對映體的一種有效技術(shù)，可分為直接法和間接法兩類：n直接法n手性固定相法（chiral stationary phase;CSP)n手性流動相法(chiral mobile phase additive;CMPA)n間接法手性試劑衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)第二節(jié) 高效液相色譜儀色譜柱進(jìn)樣閥流動相檢測器高壓泵脫氣裝置 輸液系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng) 色譜泵自動進(jìn)樣器 檢測器廢液數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)啟動液相色譜儀器的流程 l開啟HPLC系統(tǒng)各個設(shè)備的電源

6、 打開泵、自動進(jìn)樣器、檢測器電源，待設(shè)備通過自檢后，打開計算機(jī)啟動 色譜管理軟件l準(zhǔn)備流動相 過濾，脫氣l色譜泵排氣 用新配制的流動相灌注泵 pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流動相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6溫度： 50流速： 1.0mL/min. 按流動相組成分：單組分和多組分 按極性分：極性、弱極性、非極性 按使用方式分：等度洗脫和梯度洗脫 水： 去離子水 自動純水儀純凈水 商品瓶裝水 溶劑: 色譜純（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，異丙醇）試劑: 分析純 不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新

7、鮮水，水質(zhì)要求越高放置時間越短。 理想的HPLC用水應(yīng)為18.2的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無機(jī)離子及空氣等。 l過濾：0.45um或更小孔徑濾膜 目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。l脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡 氣泡對測定的影響： 1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積 2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形 3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動 過濾與脫氣過濾與脫氣流動相的保存l有機(jī)溶劑流動相： 室溫下密封，避光保存l緩沖鹽流動相： 當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用： 低溫下密封保存，一般不超過3天 防止微生物生長l有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽

8、）混配的流動相： 低溫密封保存 防止有機(jī)相的揮發(fā)l選用適宜的容器流動相的保存l有機(jī)溶劑流動相： 室溫下密封，避光保存l緩沖鹽流動相： 當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用： 低溫下密封保存，一般不超過3天 防止微生物生長l有機(jī)溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相： 低溫密封保存 防止有機(jī)相的揮發(fā)l選用適宜的容器（1）改善分離, 加快分析速度；（2）改善峰形, 減少拖尾, 有利于痕量組分的檢測；（3）增加峰容量；（4）強(qiáng)烈滯留的組分不容易殘留在柱上, 保持柱性能長期良好；（5）下次分析時, 流動相需要一段平衡時間；不同溶劑的UV吸收程度稍有差異, 可能會引起基線漂移 A 流動相/弱溶劑組成； B 流動相/強(qiáng)溶劑組成； 梯度時

9、間； 梯度曲線：線性、凸型或凹型等。強(qiáng)溶劑 A%time125低壓梯度用單泵產(chǎn)生梯度，泵前（低壓端）混合對脫氣要求高不易調(diào)節(jié)梯度的滯后體積如設(shè)計不當(dāng)，梯度的準(zhǔn)確性受影響滯后體積（系統(tǒng)體積）設(shè)計合理死體積/譜帶展寬體積(無色譜柱時)滯后(系統(tǒng))體積滯后(系統(tǒng))體積溶劑輸送系統(tǒng)(泵)檢測器進(jìn)樣器色譜柱色譜柱梯度混合器溶劑輸送系統(tǒng)(泵)高壓梯度注意注意滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼滯后體積包括進(jìn)樣器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例閥檢測器進(jìn)樣器ABCD色譜柱色譜柱溶劑輸送系統(tǒng)(泵)低壓梯度 阻尼器 混合器l滯后體積太大會引起梯度變化的延遲例如：滯后體積為2.0ml，流速1.0ml/min

10、實際梯度會比設(shè)置值晚 2 分鐘響應(yīng)，沒有問題對微柱色譜影響更大，同上例但流速0.1ml/min 實際梯度會比設(shè)置值晚20 分鐘響應(yīng)，不能接受l滯后體積的不同會使方法轉(zhuǎn)換麻煩滯后體積比文獻(xiàn)大或小都會使方法不能重現(xiàn)滯后體積的變化會導(dǎo)致梯度重現(xiàn)性不好l普通分析型液相色譜的滯后體積為24ml設(shè)計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積隨反壓變化滯后體積隨反壓變化的后果：梯度的準(zhǔn)確性不好，造成：方法的適應(yīng)性不好用靜態(tài)梯度混合器；固定滯后體積可明顯改善梯度特性梯度百分比保留時間梯度曲線好的梯度滯后曲線保留時間梯度百分比不好的梯度滯后曲線固定滯后體積，改善了梯度性能普通的低壓梯度系統(tǒng)n輸液泵輸液泵n多用柱塞往復(fù)泵，柱塞

11、向前運(yùn)動，液體輸出，流向色譜柱；向后運(yùn)動，將貯液瓶中液體吸入缸體。如此往復(fù)運(yùn)動，將流動相 源源不斷地輸送到色譜柱中。n柱塞往復(fù)泵屬于恒流泵，流量不受柱阻影響，泵壓最高為400kg/cm2。n這種泵具有清洗容易，更換流動相方便等優(yōu)點(diǎn)，但脈動性較大是其缺點(diǎn)。目前多采用雙泵補(bǔ)償法來克服這一問題。避免使用對不銹鋼有腐蝕性的溶劑。例：硝酸、硫酸、鹽酸、鹵化物，四氯化碳與異丙醇或四氫呋喃的混合物，含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液等。過濾用濾膜過濾或垂熔漏斗過濾脫氣采用超聲或過濾的方法注意注意流動相流動相使用前使用前沖洗沖洗使用含酸、堿、緩沖液的流動相后，必須用不含鹽的有機(jī)溶劑-水沖洗！進(jìn)樣閥進(jìn)樣閥1柱柱泵泵324定量圈定

12、量圈進(jìn)樣孔進(jìn)樣孔6廢液廢液5廢液廢液Inject6柱柱泵泵3214定量圈定量圈進(jìn)樣孔進(jìn)樣孔廢液廢液5廢液廢液Load注意：使用后應(yīng)清洗！進(jìn)樣注意點(diǎn)進(jìn)樣注意點(diǎn)進(jìn)樣閥的廢液出口端高度必須與進(jìn)樣針在同一水平位置，以免虹吸作用，使樣品向針筒方向回流，或從廢液口流出。使用前后，要用流動相（不含酸堿等緩沖液）或甲醇或水沖洗針孔，用針孔清洗器）。進(jìn)樣方法進(jìn)樣方法整個定量圈體積進(jìn)樣為獲得好的精密度，進(jìn)樣量應(yīng)大于定量圈量的2-5倍以上。由于層流影響，需要有過量的樣品液來取代管壁上的流動相（見下圖）。Sample Mobile phasen例20l定量圈，進(jìn)樣體積不能超過10 l。否則，部分樣品將會從出口流失。這

13、是因為由于層流的關(guān)系，樣品流經(jīng)管中心的速度是平均速度的兩倍。n進(jìn)樣前應(yīng)用流動相沖洗進(jìn)樣孔，以除去前一針留下的樣品。注射針必須清洗干凈。部分定量圈體積進(jìn)樣當(dāng)樣品量少時，采用部分體積進(jìn)樣，進(jìn)樣量由微量注射器手動控制，要求：不得超過定量圈體積的1/2量n檢測器檢測器n紫外檢測器n可變波長檢測器n光電二極管陣列檢測器n熒光檢測器n電化學(xué)檢測器n蒸發(fā)光散射n示差檢測器n質(zhì)譜色譜圖minH光譜圖nmAA-曲線(定性)A-t 曲線 (定量)蒸發(fā)光散射檢測器是通用檢測器，適用于無紫外吸收的化合物。原理：組分先引入已通氣體（N2,空氣 ）的蒸發(fā)室，加熱，使流動相蒸發(fā)而被除去，樣品組分形成氣溶膠而產(chǎn)生光散射，測定

14、散射光強(qiáng)度而獲得組分的濃度信號。 本法中流動相在檢測前已蒸發(fā)，故梯度洗脫基線穩(wěn)定。組分的氣溶膠噴霧蒸發(fā)檢測N2光源溶劑泵色譜柱流出物注意注意：流動相必須是揮發(fā)性的，不能含緩沖鹽，若調(diào)節(jié)pH可用氨水、醋酸。質(zhì)譜檢測器43%22%8%7%5%4%10%1%UV-VISDAD Flu Refra ElecConducotherMs 檢測器使用統(tǒng)計對樣品有響應(yīng)并有一個輸出信號應(yīng)該提供在檢測器響應(yīng)值與樣品濃度之間的線性關(guān)系；并且所設(shè)計的校正技術(shù)應(yīng)該促進(jìn)這種關(guān)系高靈敏度；可忽略的基線噪音寬的線性范圍獨(dú)立于流動相及操作參數(shù)的響應(yīng)對壓力、溫度及流速等變化不敏感長時間操作的穩(wěn)定性低死體積非破壞性選擇性靈敏度是信

15、號與噪音的比值；即峰高與基線噪音的比值（S/N）檢測限（LOD）：S/N = 24定量限（LOQ）：S/N = 810好的信噪比有利于：更好的色譜峰確認(rèn)更好的定量更好地完成色譜峰純度/均一性6:1NS目前實驗室中最流行的選擇多數(shù)公司約75%的檢測器是吸光度檢測器（其中50%是多波長，25%是PDA）測量通過溶液后的紫外或可見光光強(qiáng)度的損失吸光度與樣品濃度呈線性關(guān)系在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大這種檢測器簡單、可靠多數(shù)人熟悉并喜歡這種技術(shù)可以作梯度實驗并且是非破壞性的大多數(shù)有機(jī)化合物有一定程度的吸光度一般來說靈敏度還可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.00

16、1.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabens at 254 nm由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用檢測器對某些化合物的檢測靈敏度不及其他檢測器樣品中不同化合物的最大吸收波長不同時，需要使用多波長檢測，或使用折衷的波長受流動相組成的影響：用截止波長以上至少510nm作為工作波長緩沖鹽、離子對試劑、胺改性劑也會有影響UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O BlankAU0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.901.001.

17、101.201.301.401.50nm200.00210.00220.00230.00240.00250.00260.00270.00280.00290.00H20 with 0.1% TFA50% ACN with 0.1% TFA色譜條件色譜柱：C18, 5 m, 3.9x150mm at 35 C.流動相： A: 0.1% TFA in Water.B: 0.1% TFA in Acetonitrile.梯度： 5 - 40% B in 35 min.流速： 1.0 mL/min.樣品： 水（10 L inj. vol.）檢測： 214 nm 圖1；好的梯度系統(tǒng) 圖2；一般的二元梯度系

18、統(tǒng) 圖3；一般的四元梯度系統(tǒng)五個小肽的5ng進(jìn)樣，好的色譜系統(tǒng)非常容易鑒別出所有峰。在不好的色譜系統(tǒng)中，第一個峰則消失在基線噪音中。1.2241.1831.183Caffeine 271 nmn色譜柱色譜柱n色譜柱有柱管和固定相組成，柱管用不銹鋼制成，柱長1030cm，內(nèi)徑26mm，以4.6mm的內(nèi)徑最常用。n根據(jù)鍵合基團(tuán)極性不同，化學(xué)鍵合相可分為非極性、中等極性和極性三類。n常用色譜柱有：nODS柱、氰基柱、氨基柱等n非極性鍵合相n表面基團(tuán)為非極性烴基，如C18 、C8等，主要用于RP色譜。 C18是最常用的非極性鍵合相，將十八烷基氯硅烷與硅膠表面的硅醇基經(jīng)多步反應(yīng)而成。SiOH + ClS

19、iC18H37R1R2SiOSiC18H37R1R2+ HClR1，R2 =H，Cl ， CH31（2，3）：1n根據(jù)R1、R2基團(tuán)，含碳量可分為高碳、中碳、低碳型鍵合相：n高碳 R1=R2 =CH3 載樣量大，吸附性能大；n中碳 R1=H, SiO Si(H) C18H37n R2 =Cl SiO n低碳 R1=R2 = Cl SiO SiO SiOSiC18H37n中等極性鍵合相中等極性鍵合相常見的有醚基鍵合相，這類鍵合相根據(jù)流動相的極性，可作為正相或反相色譜的固定相，應(yīng)用較少。n極性鍵合相可作正相或反相色譜使用n氨基鍵合相： 硅膠-氨丙硅烷基Si(CH2)3NH2 氰基鍵合相： 硅膠-氰

20、乙硅烷基Si(CH2)2CN 鍵合相色譜pH控制在2-8液相色譜的色譜柱色譜柱的連接 Stop_depth長度不合適造成柱前死體積 錐箍錐度不合適造成滲漏 色譜柱的連接 色譜柱使用與保存所有色譜柱使用緩沖液后必須用柱體積20-30倍的水沖洗色譜柱 色譜柱 柱體積 沖洗體積150 4.6mm 2.5ml 50ml200 4.6mm 3.3ml 65ml250 4.6mm 4.2ml 80ml保存色譜柱時用100%甲醇或乙腈，柱兩端必須用接頭密封。停用數(shù)天后最使用時，應(yīng)先用低流速甲醇沖洗1h左右，然后再換上流動相，否則直接用流動相，柱效會下降，峰形不好。 新柱使用前應(yīng)用甲醇或乙腈沖洗（0.5ml/

21、min）。色譜柱失效癥狀色譜柱壓增高峰變寬，拖尾，裂峰塔板數(shù)下降，選擇性下降，分離度降低保留值減小或增大色譜柱失效的原因n進(jìn)口濾片堵塞n吸附了樣品雜質(zhì)n柱填充不良，使用久，n機(jī)械及熱沖擊造成空洞n固定相遭化學(xué)侵蝕原因 壓力 拖尾 塔板數(shù) 選擇性 保留值堵塞 # # #空洞 # #吸附樣品 #化學(xué)沖擊 # # # #n柱凹陷出現(xiàn)裂峰現(xiàn)象，填料與色譜柱頂端不齊平，可用相同填料填平凹陷處。n壓力影響應(yīng)避免突然的壓力波動與任何的機(jī)械與熱力沖擊，如色譜柱掉在實驗臺上或驟然改變柱溫等。進(jìn)樣過程中轉(zhuǎn)動進(jìn)樣閥太慢引起壓力波動，會使色譜峰產(chǎn)生裂隙。柱壓升高原因柱壓升高原因強(qiáng)保留樣品組分強(qiáng)吸附組分易聚集在柱進(jìn)口填

22、料上，嚴(yán)重縮短色譜柱壽命。尤其是生物樣品提取物、含油成分等。當(dāng)嚴(yán)重拖尾峰出現(xiàn)時往往是強(qiáng)保留污染物在柱口處聚集的信號。n解決辦法n使用保護(hù)柱可延長分析柱壽命。n每天實驗后應(yīng)用強(qiáng)溶劑（例甲醇-水等，至少20-30倍柱體積的量）沖洗色譜柱。n并定期進(jìn)行保養(yǎng)，以低流速的強(qiáng)溶劑較長時間沖洗色譜柱。樣品純度差有微小的顆粒堵塞管路?？捎脼V膜過濾樣品后再進(jìn)樣。樣品濃度高連續(xù)進(jìn)樣，造成過載。如果樣品吸收度不是太低，使樣品濃度在1mg/ml以下較適宜。 流動相中緩沖液濃度過高，有機(jī)相比例大在色譜過程中堵塞管路，析出的鹽結(jié)晶還磨損泵、進(jìn)樣閥密封圈造成漏液。緩沖液濃度一般控制在20mmol以下較適宜，測定完畢后必須及

23、時用水充分沖洗。注意！注意！ 一旦柱壓升高，應(yīng)停止測定，用水一旦柱壓升高，應(yīng)停止測定，用水沖洗數(shù)小時或更長時間，待壓力下降后沖洗數(shù)小時或更長時間，待壓力下降后再測定，如果不清楚堵在哪一段，則應(yīng)再測定，如果不清楚堵在哪一段，則應(yīng)逐級檢查，換泵頭上濾芯，保護(hù)柱等。逐級檢查，換泵頭上濾芯，保護(hù)柱等。柱效低的原因柱效低的原因頻繁更換流動相組成加速柱效降低。最好一根色譜柱使用的流動相成分和pH值相近，如始終在酸性條件下或堿性條件下工作。 色譜柱的選擇不合適或使用時間久更換色譜柱（廠家，型號）進(jìn)樣操作不當(dāng)轉(zhuǎn)動進(jìn)樣閥時應(yīng)一次轉(zhuǎn)到位，不能過慢或停頓，否則易造成裂峰。 樣品溶劑與流動相成分不匹配樣品溶劑與流動相

24、成分不匹配，造成前沿峰或倒峰。如樣品用純甲醇作溶劑，而流動相中甲醇比例很低，這樣易出現(xiàn)前沿峰，改變樣品溶劑成分或比例，使醇-水比例接近于流動相。前沿峰倒峰結(jié)果不能重現(xiàn)結(jié)果不能重現(xiàn) 表現(xiàn)為同一樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣所得峰面積相差大，引起這種情況時，可從以下幾方面來查找原因：n泵、進(jìn)樣閥、管路漏液造成峰面積變化。n檢測器靈敏度改變?nèi)绻粯悠穬纱芜M(jìn)樣峰面積相差10倍或更大倍數(shù)，則最可能的原因是檢測器的靈敏度被無意中改變，軟件的靈敏度改變不會影響峰面積的積分?jǐn)?shù)值。色譜軟件積分方式是否一致尤其是對于色譜峰較復(fù)雜的，積分時基線稍有變化將造成峰面積大的變化，如果兩峰不是基線分離，則峰切割方式對峰面積有很大影響，

25、有時候采用峰高較峰面積誤差小。垂直切割基線切割n樣品溶液的穩(wěn)定性n 有些樣品在流動相條件下不穩(wěn)定，放置后會產(chǎn)生雜質(zhì)峰，應(yīng)注意。n例如有一樣品在流動相溶液中不穩(wěn)定，配制后于不同時間進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)在主峰后會產(chǎn)生一雜質(zhì)峰，該雜峰隨時間而迅速增大。n將流動相中緩沖液換成水后，樣品測定液放置15h后仍穩(wěn)定。HPLC HPLC 法在藥物分析中的應(yīng)用法在藥物分析中的應(yīng)用鑒別采用標(biāo)準(zhǔn)品對照法檢查中國藥典規(guī)定了5種測定方法含量測定中國藥典規(guī)定了2種定量方法在進(jìn)行HPLC測定時，中國藥典規(guī)定要進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗系統(tǒng)適用性試驗柱效 n=5.54(tR/Wh/2)2分離度 R=拖尾因子 T=重復(fù)性 取對照品或樣品溶液，連

26、續(xù)進(jìn)樣5次，測得峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD應(yīng)小于2.0%2(tR2-tR1)W1+W2W0.05h2d1(R 1.5)(T=0.951.05)其中分離度和重復(fù)性是更具實際意義的參數(shù)(ChP.2005)n定量分析方法定量分析方法n內(nèi)標(biāo)法 內(nèi)標(biāo)物要求：n樣品中不含有的組分。n保留時間與待測物相近，但分離度R1.5。（理化性質(zhì)相近）n有足夠的純度。 外標(biāo)法-標(biāo)準(zhǔn)對照法 C樣=A樣/ A標(biāo) C標(biāo)溶劑及樣品的準(zhǔn)備 過濾溶劑的目的濕防止固體顆粒損傷儀器或柱頭；未經(jīng)過濾的溶劑或者溶劑瓶中生長微生物，都會降低溶劑入口過濾頭的壽命，并影響泵的性能，一般要求兩天過濾一次。 注意：過濾水相或有機(jī)相應(yīng)該選用不同的濾膜聚四

27、氟乙烯幾乎可以過濾所有的溶劑、酸和堿尼龍66可以和大多數(shù)的有機(jī)物、水相容，但是建議不要用于強(qiáng)酸、二氯甲烷和DMF纖維素濾膜用于水相83溶劑脫氣的方法氦氣脫氣真空脫氣回流加熱脫氣超身脫氣（最為常用）避免使用的溶劑鹵化物堿金屬溶液及相應(yīng)的酸溶液高濃度的無機(jī)酸如硝酸、硫酸能形成自由基的試劑及其混合物四氯化碳和異丙醇或THF混合液含強(qiáng)絡(luò)合劑的溶液 84為了確保分析結(jié)果的再現(xiàn)性，對于反相柱應(yīng)使用510倍柱體積的流動相平衡色譜柱。注意：新裝到系統(tǒng)的色譜柱需要進(jìn)行初始化。先斷開柱子和檢測器間的管路，用流動相將色譜柱中的原有流動相或氣泡移出色譜柱，然后再將色譜柱和檢測器間的管路接好。85過濾所有的溶劑和樣品使

28、用保護(hù)柱儀器使用完畢，要沖洗整個系統(tǒng)，移走系統(tǒng)中緩沖液柱子不使用時，兩端密封注意柱子使用的pH范圍不要高壓沖洗柱子，不要高溫下過長時間的使用硅膠鍵合相86可能的原因檢測池臟檢測器燈能量下降由泵引起的脈沖檢測器上的溫度效應(yīng)檢測池中有氣泡通過87可能原因梯度洗脫引起流動相臟柱子沒平衡系統(tǒng)中污染物溢出RID檢測器溫度不穩(wěn)定88鬼峰沒有進(jìn)樣就有色譜峰出現(xiàn)原因流動相臟，尤其是水相89常見色譜故障雙峰n柱頭塌陷或柱床運(yùn)動n泵頭過濾芯部分堵塞n組分共流出可能原因柱子進(jìn)口過濾芯被污染Purge閥過濾芯被污染色譜柱被污染連接管路堵塞進(jìn)樣器旋轉(zhuǎn)密封閥被堵塞進(jìn)樣針或者針座被堵塞可用分段法來檢查哪一段發(fā)生堵塞90溶劑進(jìn)口過濾芯被堵連接管路泄漏或其他備件泄漏溶劑或流速的改變主動閥失靈四元比例閥失靈單向出口閥失靈柱子失效（固定相流失）91可能原因溶劑進(jìn)口過濾芯堵塞溶劑未脫氣泵的密封圈老化出口單向閥失效主動閥失效最常見的原因失泵內(nèi)有七寶92吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過濾器進(jìn)樣器檢測器吸濾頭定期清洗，更換溶劑時單向閥定期清洗，壓力波動大時泵自動清洗在線過濾器壓力大時清洗材料：不銹鋼燒結(jié)，孔徑10um故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成措施：用5稀硝酸，超聲波清洗， 再用蒸餾水清洗