基因工程藥物EPO

1、最成功的基因工程藥物最成功的基因工程藥物 EPO 主要內(nèi)容主要內(nèi)容什么是什么是EPO? 主要用途主要用途 如何生產(chǎn)如何生產(chǎn)國內(nèi)外現(xiàn)狀國內(nèi)外現(xiàn)狀什么是什么是EPO? EPO是促紅細(xì)胞生成素（是促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin）的英文簡稱。）的英文簡稱。 人體中的人體中的EPO（促紅細(xì)胞生成素）是由腎臟和肝臟分泌的一種（促紅細(xì)胞生成素）是由腎臟和肝臟分泌的一種激素物質(zhì)，能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成。服用紅細(xì)胞生成素可以使患腎病激素物質(zhì)，能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成。服用紅細(xì)胞生成素可以使患腎病貧血的病人增加貧血的病人增加血流比溶度血流比溶度（即增加血液中紅細(xì)胞百分比）。這種（即增加血液中紅細(xì)胞百分比）。這

2、種藥物近年進(jìn)入商業(yè)市場(chǎng)。人體缺氧時(shí)，此種激素生成增加，并導(dǎo)致藥物近年進(jìn)入商業(yè)市場(chǎng)。人體缺氧時(shí)，此種激素生成增加，并導(dǎo)致紅細(xì)胞增生。紅細(xì)胞增生。 EPO興奮劑正是根據(jù)促紅細(xì)胞生成素的原理人工合成，它能興奮劑正是根據(jù)促紅細(xì)胞生成素的原理人工合成，它能促進(jìn)肌肉中氧氣生成，從而使肌肉更有勁、工作時(shí)間更長。促進(jìn)肌肉中氧氣生成，從而使肌肉更有勁、工作時(shí)間更長。 增加紅血球的數(shù)目，用于增加紅血球的數(shù)目，用于貧血、組織斷離、貧血、組織斷離、早產(chǎn)兒，用在癌學(xué)和血液學(xué)方面早產(chǎn)兒，用在癌學(xué)和血液學(xué)方面。用于治療慢。用于治療慢性腎衰患者的貧血癥。治療最初性腎衰患者的貧血癥。治療最初13周觀察到周觀察到血細(xì)胞比容增加，

3、且與劑量成比例，在血細(xì)胞比容增加，且與劑量成比例，在46周周中血細(xì)胞比容水平在不同研究中可達(dá)中血細(xì)胞比容水平在不同研究中可達(dá)30%40%之間不等，患者的生活質(zhì)量提高，包括體之間不等，患者的生活質(zhì)量提高，包括體力耐受、情緒、起居方式和性功能的提高。對(duì)力耐受、情緒、起居方式和性功能的提高。對(duì)慢性腎衰不需要透析的貧血患者的研究表明，慢性腎衰不需要透析的貧血患者的研究表明，使用本品也是有利的。使用本品也是有利的。醫(yī)療用途醫(yī)療用途 增加訓(xùn)練耐力和訓(xùn)練負(fù)荷，屬于國際奧委會(huì)規(guī)定的增加訓(xùn)練耐力和訓(xùn)練負(fù)荷，屬于國際奧委會(huì)規(guī)定的違禁藥物違禁藥物。在在2008年北京奧運(yùn)會(huì)中第一例的興奮劑檢查呈陽性的西班牙自行車年北

4、京奧運(yùn)會(huì)中第一例的興奮劑檢查呈陽性的西班牙自行車選手瑪麗亞選手瑪麗亞莫里諾，就是被發(fā)現(xiàn)使用使用促紅細(xì)胞生成素莫里諾，就是被發(fā)現(xiàn)使用使用促紅細(xì)胞生成素(EPO)，國際奧委會(huì)于國際奧委會(huì)于2008年年8月月11日宣布取消其參賽資格。日宣布取消其參賽資格。體育用途體育用途EPO發(fā)展歷程發(fā)展歷程 如何生產(chǎn)？如何生產(chǎn)？方法一：方法一：用基因重組法用基因重組法生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)紅細(xì)胞生成素(EP O) 19851985年科學(xué)家應(yīng)用基因年科學(xué)家應(yīng)用基因重組技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室獲得重組重組技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室獲得重組人人EPOEPO（rhEPOrhEPO）。）。 以小以小 鼠鼠L L一一92 9 92 9 細(xì)細(xì) 胞為宿

5、主胞為宿主 , , 使使 用病毒用病毒S vS v一一40 40 中組中組 入了入了E P O E P O 基基 因因 的的載載 體體 時(shí)時(shí),80 % ,80 % 的的 轉(zhuǎn)化細(xì)胞能轉(zhuǎn)化細(xì)胞能產(chǎn)生產(chǎn)生EPO , EPO , 多代多代 培養(yǎng)后培養(yǎng)后 產(chǎn)生產(chǎn)生 能力仍穩(wěn)能力仍穩(wěn) 定定 目前國內(nèi)外均采用目前國內(nèi)外均采用CHOCHO細(xì)胞細(xì)胞( (中國倉鼠卵巢細(xì)胞中國倉鼠卵巢細(xì)胞) )表達(dá)生表達(dá)生產(chǎn)產(chǎn) Epo , Epo ,但是細(xì)胞但是細(xì)胞表達(dá)的成本比較昂貴表達(dá)的成本比較昂貴, , 而用而用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)生產(chǎn) Epo Epo , ,可能是一條十分理想的途徑。我們將構(gòu)建的可能是一條十分理想的途徑。

6、我們將構(gòu)建的 pGEM-7zf(+) -LG-Epo pGEM-7zf(+) -LG-Epo 表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因小鼠, ,經(jīng)經(jīng)PCR PCR 擴(kuò)增擴(kuò)增, , 斑點(diǎn)雜交和斑點(diǎn)雜交和 Southern Southern 雜交檢測(cè)證實(shí)雜交檢測(cè)證實(shí), ,有有4 4只轉(zhuǎn)基因陽性小只轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。其中鼠。其中3 3只母鼠在哺乳期只母鼠在哺乳期 , ,采集乳汁采集乳汁 , ,用用Epo-ELISA Epo-ELISA 檢測(cè)檢測(cè)為陽性。又從部分為陽性。又從部分G1G1代母鼠中篩出代母鼠中篩出 6 6 只獲得遺傳的小鼠只獲得遺傳的小鼠 , ,經(jīng)經(jīng) Dot-ELISA Dot-ELISA 檢測(cè)檢測(cè)

7、 , ,其中兩只母鼠乳汁中其中兩只母鼠乳汁中Epo Epo 含量為含量為0.5g/mL0.5g/mL。實(shí)驗(yàn)證實(shí)。實(shí)驗(yàn)證實(shí),867bp,867bp的山羊的山羊-LG -LG 啟動(dòng)子可以指導(dǎo)啟動(dòng)子可以指導(dǎo)外源基因在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中表達(dá)外源基因在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中表達(dá) 。方法二：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)方法二：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn) Epo 采用噬菌體表面表達(dá)和重組抗體技術(shù)，從已建立的鼠抗采用噬菌體表面表達(dá)和重組抗體技術(shù)，從已建立的鼠抗rhEPO rhEPO 雜交瘤細(xì)胞株雜交瘤細(xì)胞株D3D3中克隆出抗中克隆出抗rhEPOrhEPO單鏈抗體單鏈抗體ScFvScFv基因片段，基因片段，經(jīng)噬菌體表面呈現(xiàn)，與固經(jīng)噬菌體表面呈現(xiàn)

8、，與固 相抗原相抗原rhEPOrhEPO結(jié)合，結(jié)合，“吸附吸附洗脫洗脫富富集集”，酶聯(lián)免疫吸附法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)(ELISA)檢測(cè)，酶切鑒定檢測(cè)，酶切鑒定 及及PCRPCR擴(kuò)增鑒定，擴(kuò)增鑒定，將陽性克隆重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化非抑制型將陽性克隆重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化非抑制型E.coli HB2151,E.coli HB2151,誘導(dǎo)表達(dá)抗誘導(dǎo)表達(dá)抗rhEPO rhEPO 單鏈抗體，單鏈抗體，Western blotWestern blot和和Dot-blotDot-blot雜交檢測(cè)其抗原特異雜交檢測(cè)其抗原特異性。最后對(duì)陽性克隆進(jìn)行序列測(cè)性。最后對(duì)陽性克隆進(jìn)行序列測(cè) 定，進(jìn)行序列分析。結(jié)果挑定，進(jìn)行序列

9、分析。結(jié)果挑選出了噬菌體表面表達(dá)抗選出了噬菌體表面表達(dá)抗rhEPOrhEPO單鏈抗體的陽性克隆，單鏈抗體的陽性克隆， 可溶性表可溶性表達(dá)的單鏈抗體主要分布于細(xì)菌培養(yǎng)上清中，并且保留了親本單抗達(dá)的單鏈抗體主要分布于細(xì)菌培養(yǎng)上清中，并且保留了親本單抗對(duì)對(duì)rhEPOrhEPO的的 抗原特異性和免疫活性。表達(dá)產(chǎn)物分子量約為抗原特異性和免疫活性。表達(dá)產(chǎn)物分子量約為32kD32kD左左右。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功地獲得了右。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功地獲得了 抗抗rhEPOrhEPO抗體的可變區(qū)抗體的可變區(qū)VHVH、VLVL基基因，并表達(dá)出單鏈抗體因，并表達(dá)出單鏈抗體ScFvScFv片段。片段。方法三：采用噬菌體表面表達(dá)和重組

10、抗體技術(shù)方法三：采用噬菌體表面表達(dá)和重組抗體技術(shù) 1989年安進(jìn)（年安進(jìn)（Amgen）公司的第一個(gè)基因重組藥物）公司的第一個(gè)基因重組藥物Epogen獲得獲得FDA的批準(zhǔn)，的批準(zhǔn)，適應(yīng)癥為慢性腎功能衰竭導(dǎo)致的貧血、惡性腫瘤或化療導(dǎo)致的貧血、失血后貧血適應(yīng)癥為慢性腎功能衰竭導(dǎo)致的貧血、惡性腫瘤或化療導(dǎo)致的貧血、失血后貧血等，其市場(chǎng)表現(xiàn)不俗，等，其市場(chǎng)表現(xiàn)不俗，1999年銷售值達(dá)到年銷售值達(dá)到17.6億美元，億美元，2000年年19.6億美元，億美元，2002年年22.6億美元，億美元，2003年年24.4億美元，成為名副其實(shí)的億美元，成為名副其實(shí)的“重磅炸彈重磅炸彈”基因藥物?；蛩幬?。國外市場(chǎng)國

11、外市場(chǎng) 用于治療惡性貧血癥的用于治療惡性貧血癥的第二代促紅細(xì)胞生成素新產(chǎn)品第二代促紅細(xì)胞生成素新產(chǎn)品Arnesp2001年得到年得到FDA的的批準(zhǔn)，批準(zhǔn)，Arnesp2002年初正式上市。年初正式上市。Arnesp是一種是一種“高糖基化高糖基化”促紅素產(chǎn)品，其促促紅素產(chǎn)品，其促進(jìn)紅細(xì)胞生成的能力大大優(yōu)于第一代進(jìn)紅細(xì)胞生成的能力大大優(yōu)于第一代EPO（促紅細(xì)胞生成素）產(chǎn)品。第一年上市即（促紅細(xì)胞生成素）產(chǎn)品。第一年上市即大獲全勝，贏得開們紅，大獲全勝，贏得開們紅，Aranesp2002年全年銷售額為年全年銷售額為4.2億美元，億美元，2003年全年銷售年全年銷售額為額為15.4億美元。估計(jì)在今后億美元。估計(jì)在今后3年內(nèi)，年內(nèi)，Arnesp將創(chuàng)造將創(chuàng)造10億億15億美元的市場(chǎng)銷售額并億美元的市場(chǎng)銷售額并奪取現(xiàn)有奪取現(xiàn)有EPO生產(chǎn)商的部分市場(chǎng)，其市場(chǎng)前景不可估量。生產(chǎn)商的部分市場(chǎng)，其市場(chǎng)前景不可估量。 2001年，年，EPO（包括（包括Arnesp）的全球銷售額達(dá)）的全球銷售額達(dá)21.1億美元，億美元，2002年達(dá)年達(dá)26.8億美億美元，元，2003年全世界年全世界EPO的年銷售額超過的年銷售額超過50億美元。創(chuàng)下生物工程藥品單個(gè)品種