肝酶的分離提取

1、開題報(bào)告：肝酶的分離提取與純化鑒定內(nèi)容從生物樣品中分離純化生物大分子的技術(shù)路線和實(shí)施方案肝酶的分離提取純化和鑒定一、生物大分子的分離純化方案生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要活活性成分性成分的各種的各種分子量達(dá)到上萬(wàn)或更多分子量達(dá)到上萬(wàn)或更多的的有機(jī)分子，有機(jī)分子，結(jié)構(gòu)具有一定的規(guī)律性，大結(jié)構(gòu)具有一定的規(guī)律性，大多是由基本結(jié)構(gòu)單位按一定順序和方式多是由基本結(jié)構(gòu)單位按一定順序和方式連接而形成的多聚體。常見的生物大分連接而形成的多聚體。常見的生物大分子包括子包括蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)( (包括酶包括酶) )、核酸核酸、多聚糖多聚糖等。實(shí)際上生物大分子的等。實(shí)際上生物大分子的特點(diǎn)

2、特點(diǎn)在于其表在于其表現(xiàn)出的現(xiàn)出的各種生物活性各種生物活性和在生物和在生物新陳代謝新陳代謝中的作用。中的作用。前期準(zhǔn)備（一） 明確目的和要求（二） 了解的生物大分子的物理化學(xué)性質(zhì)溶解性、穩(wěn)定性、親和力、緩沖液、pH1、分離生物大分子的一般步驟材料的預(yù)處理材料的粗提取材料的精細(xì)分離鑒定材料的預(yù)處理組織細(xì)胞破碎1、機(jī)械破碎法高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研磨器2、物理破碎法：如超聲波處理、反復(fù)凍融法 3、酶學(xué)破碎方法酶解法、自溶法（利用細(xì)胞自身的水解酶是細(xì)胞破碎）4、化學(xué)破碎方法：通過(guò)化學(xué)試劑的作用使細(xì)胞膜的透過(guò)性改變。生物大分子的精細(xì)分離生物大分子的精細(xì)分離性質(zhì)性質(zhì)具體方法具體方法分子大小和形態(tài)分子大小

3、和形態(tài)差速離心、超濾法、分子篩、差速離心、超濾法、分子篩、透析透析溶解度溶解度鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀等沉淀等電荷差異電荷差異電泳、等電點(diǎn)聚焦、離子交換電泳、等電點(diǎn)聚焦、離子交換層析、吸附層析、凝膠過(guò)濾法層析、吸附層析、凝膠過(guò)濾法生物功能專一性生物功能專一性親核層析親核層析生物大分子含量的測(cè)定和純化鑒定測(cè)定多糖總量菲林試劑法，蒽酮法，旋光法等。測(cè)定蛋白質(zhì)和酶總量凱氏定氮法，F(xiàn)olin-酚法，雙縮脲法，紫外吸收法等。測(cè)定核酸總量定磷法、紫外吸收法。 二苯胺法測(cè)DNA，地衣酚法測(cè)RNA。二、設(shè)計(jì)一個(gè)從動(dòng)物肝組織中分離、提取、純化和鑒定一種酶（該酶由三個(gè)不同的亞基組成

4、，為結(jié)合酶，pI=6.2）的技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)思路材料預(yù)處理處理肝臟酶的初步分離鹽析、等電點(diǎn)沉淀酶的精細(xì)分離因只知道該酶的等電點(diǎn)，采用離子交換柱層析鑒定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳材料的選擇因動(dòng)物肝臟中的酶往往結(jié)合較多的脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)，所以取饑餓24小時(shí)的動(dòng)物肝臟為實(shí)驗(yàn)材料。細(xì)胞破碎 細(xì)胞破碎可選用三種方法：機(jī)械破碎法，物理破碎法，化學(xué)破碎法。本次使用機(jī)械破碎法中的勻漿法。使用勻漿法時(shí)應(yīng)先將大塊的組織或者細(xì)胞團(tuán)用組織搗碎機(jī)或研磨器械搗碎分散。加入蛋白酶抑制劑：加入蛋白酶抑制劑的目的是防止蛋白酶的水解作用。常用的蛋白酶抑制劑有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二異丙基氟磷酸；金屬蛋白酶抑制劑有EDTA和EGT

5、A（乙二醇四乙酸）材料的處理除核酸：一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀劑的選擇需要大量的試驗(yàn)來(lái)選定，已知的有1%2%的鏈霉素硫酸鹽、PEG、溶菌酶等。離心：由于該酶的位置未知。故應(yīng)用超速離心分離技術(shù)分離胞液中的酶體和微粒體，細(xì)胞核和線粒體。對(duì)三種成分分開研究，使得提取物中雜質(zhì)減少。 超速離心分離技術(shù)的原理：細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重、大小和形態(tài)都不相同，在同一離心場(chǎng)中沉降速度不同?？筛鶕?jù)這一原理，用差速離心法和密度梯度離心法將亞細(xì)胞組分分離。酶的初步分離提取常用的酶分離方法有沉淀法、層析法、電泳法、離心法、過(guò)濾和膜分離法、萃取法等。因本實(shí)驗(yàn)中對(duì)此種酶的了解有限

6、，但是已知所需酶的pI=6.2，故適宜采用等電點(diǎn)沉淀法進(jìn)行分離。等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法 等電點(diǎn)沉淀法：利用蛋白質(zhì)可兩性解離的性質(zhì)，兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶以沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的方法。在溶液的pH值等于溶液中某兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，該兩性電解質(zhì)分子的凈電荷為零，分子間的靜電斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下來(lái)。因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)介質(zhì)的pH，把目的酶和雜蛋白分開。但由于蛋白質(zhì)在pI點(diǎn)附近一定范圍的pH內(nèi)都可發(fā)生沉淀，只是沉淀的程度很不一樣，而且相當(dāng)多的蛋白質(zhì)的pI點(diǎn)很靠近，所以該法的回收率和純化倍數(shù)都不理想，一般只用于酶的粗分離階段。鹽析鹽析中性鹽類能

7、破壞溶液中蛋白分子表面電荷和水化膜，從而使蛋白質(zhì)從溶液中凝聚沉淀析出。且沉淀不同的蛋白質(zhì)所需鹽類的濃度不同?？筛鶕?jù)所要分離的蛋白質(zhì)，選擇不同飽和度的硫酸銨溶液進(jìn)行鹽析。透析 用鹽析法分離而得的蛋白質(zhì)中含有大量的中性鹽，會(huì)妨礙蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化，因此必須去除。透析法利用蛋白質(zhì)和鹽離子分子大小不同，鹽離子 小能透過(guò)透析袋而蛋白質(zhì)分子不能，由此可除去鹽離子。如何保持酶的活性是整個(gè)實(shí)驗(yàn)需要考慮的重要問(wèn)題。為此，我組同學(xué)認(rèn)為實(shí)驗(yàn)中應(yīng)考慮以下幾點(diǎn)問(wèn)題。1.由于丙酮等有機(jī)溶劑會(huì)降低肝組織的活性，所以，最初取得的肝組織應(yīng)保存在4C,含20%甘油的pH=7.0的EDTA中（Colnen1968)2.由于重金屬元素

8、會(huì)大大降低酶的活性，故實(shí)驗(yàn)中應(yīng)采用玻璃儀器蒸餾的蒸餾水配置溶液(Cospeich Peter1951)步驟1.取動(dòng)物肝組織 選取新鮮的，饑餓24小時(shí)的動(dòng)物的肝臟，生理鹽水沖洗2.對(duì)肝組織進(jìn)行預(yù)處理（梯度離心獲得含有酶的細(xì)胞液） 在冰塊中用小剪剪碎肝臟，移入插在冰塊中洗凈的勻漿器中進(jìn)行勻漿 分次加入0.25mol/L冰冷蔗糖10ml，勻漿液經(jīng)32層紗布（或雙層尼龍織物）過(guò)濾，得勻漿液 離心管中加入5ml 0.34M蔗糖，將5ml勻漿輕輕覆在 其上，1600r/min離心10min，得上清液（1） 沉淀加10ml 0.25M蔗糖混勻，3500r/min離心10min， 得上清液（2） 將上清液（1

9、）（2）混合取1ml,6600r/min離心 10min，得上清液，即為酶體和微粒體 3.初步分離提取1）配制高濃度的硫酸銨溶液，測(cè)溶液PH值并用稀硫酸或氨水調(diào)PH到6.2 2）將酶溶液與硫酸銨溶液混合，靜置一段時(shí)間 3）離心，去上清，留沉淀 4）加緩沖溶液溶解，將溶液放入透析袋中透析，得含酶的溶液酶的精細(xì)分離本實(shí)驗(yàn)采用離子交換層析法純化目的酶DEAE-纖維素為二乙氨乙基纖維素，是陰離子交換劑。其原理基于離子交換層析：離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留

10、在柱子上，然后通過(guò)提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來(lái)。反之陽(yáng)離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過(guò)逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來(lái)。由于靜電荷作用，在等電點(diǎn)時(shí)，兩性離子不顯電性 在pHpL的條件下帶負(fù)電荷DEAE-纖維素為陰離子交換劑，在PH=6.3時(shí)帶有正電荷。能吸引pL6.3的蛋白不與DEAE-纖維素結(jié)合，因而留在溶液中，棄掉流出液。 再將乙酸銨緩沖液的pH值調(diào)到pH=6.1,此時(shí)pH=6.1的DEAE-纖維素可吸引pL6.1的蛋白，將pL6.1的蛋白留在溶液中，即得pI約為6.2的蛋白質(zhì)。 每收

11、集一管液體，取一滴滴至玻璃板上加20磺基水楊酸試劑檢驗(yàn)有無(wú)蛋白質(zhì)流出，如有則成白色渾濁，將每個(gè)蛋白質(zhì)組分峰所涉及的試管中蛋白質(zhì)的溶液合并，則該峰為純化的目的酶pH=6.2實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1. DEAE-纖維素處理為纖維素處理為PH值為值為6.32. 裝柱與平衡（乙酸銨溶液）裝柱與平衡（乙酸銨溶液） 3. 樣品上樣、乙酸銨溶液洗脫收集，以樣品上樣、乙酸銨溶液洗脫收集，以20%三三氯乙酸或磺基水楊酸溶液檢測(cè)蛋白質(zhì)含量為氯乙酸或磺基水楊酸溶液檢測(cè)蛋白質(zhì)含量為縱坐標(biāo)，收集管號(hào)為橫坐標(biāo)，繪制洗脫峰曲縱坐標(biāo)，收集管號(hào)為橫坐標(biāo)，繪制洗脫峰曲線，收線，收 集最后一個(gè)集最后一個(gè)峰的蛋白溶液峰的蛋白溶液4. 處理

12、處理DEAE-纖維素溶液為纖維素溶液為PH=6.15. 裝柱與平衡（乙酸銨溶液）裝柱與平衡（乙酸銨溶液）6. 樣品上樣、用乙酸銨緩沖液洗脫收集，以蛋樣品上樣、用乙酸銨緩沖液洗脫收集，以蛋白質(zhì)含量為縱坐白質(zhì)含量為縱坐 標(biāo)，收集管號(hào)為橫坐標(biāo)，繪標(biāo)，收集管號(hào)為橫坐標(biāo)，繪制洗脫峰曲線，收制洗脫峰曲線，收集第一個(gè)集第一個(gè)峰的酶溶液峰的酶溶液 即為即為PI=6.2左右的蛋白質(zhì)左右的蛋白質(zhì)7. 將兩次收集蛋白質(zhì)混合即為所得酶液將兩次收集蛋白質(zhì)混合即為所得酶液活性鑒定純度鑒定 1、 結(jié)合酶由酶蛋白和輔助因子兩部分組成。輔助因子按其與酶蛋白結(jié)合的緊密程度與作用特點(diǎn)不同可分為輔酶與輔基。輔酶與酶蛋白的結(jié)合疏松，可

13、以用透析或超濾的方法除去。輔基則與酶蛋白結(jié)合緊密，不能通過(guò)透析或超濾將其除去。 酶的輔助因子多為復(fù)合有機(jī)或金屬有機(jī)化合物，或金屬離子。 2、 SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵，并按一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長(zhǎng)的函數(shù)。 分離膠的孔徑有一定大小，不同分子量的蛋白質(zhì)通過(guò)時(shí)受到的阻滯不同。這種分子篩效應(yīng)將不同大小的蛋白質(zhì)相互分開。1、若該酶含有輔基，則直接加入底物，通過(guò) 觀察底物濃度變化或產(chǎn)物生成速率來(lái)判斷 酶活性；2、若該酶含有輔酶，則加入其輔助因子后再 加入底物，然后觀察比較。 Ps：該步必須在純度鑒定前進(jìn)行在進(jìn)在進(jìn)行完前面的每一個(gè)步驟后最好都進(jìn)行一次活行完前面的每一個(gè)步驟后最好都進(jìn)行一次活性檢驗(yàn)，這樣可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)