第八章 印跡技術(shù)

1、第一節(jié)核酸分子雜交第二節(jié)探針與標(biāo)記第三節(jié)固相支持物與印跡第四節(jié)常用核酸印跡雜交技術(shù)常用核酸印跡雜交技術(shù)第五節(jié)影響雜交的因素第六節(jié)蛋白質(zhì)印跡法第七節(jié)生物芯片z掌握基本概念（印跡雜交技術(shù) 、探針等）核酸分子雜交基本原理，核酸探針應(yīng)具有的條件，核酸探針的種類，DNA印跡雜交的主要步驟。z熟悉常用印跡雜交技術(shù)和芯片技術(shù)印跡雜交技術(shù)印跡雜交技術(shù) 印跡技術(shù)印跡技術(shù)(blotting)(blotting)是指將樣品（核是指將樣品（核酸或蛋白質(zhì)）電泳分離并轉(zhuǎn)移到固相酸或蛋白質(zhì)）電泳分離并轉(zhuǎn)移到固相載體上，然后在載體上利用特異性的載體上，然后在載體上利用特異性的反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。反應(yīng)來檢測樣品的一種方法

2、。 印跡技術(shù)(blotting) Southern blotting用于分析用于分析DNA Northern blotting用于分析用于分析RNA Western blotting用于分析蛋白質(zhì)用于分析蛋白質(zhì) Eastern blotting用于分析蛋白質(zhì)用于分析蛋白質(zhì) (雙向電泳蛋白質(zhì)雙向電泳蛋白質(zhì)印跡技術(shù)印跡技術(shù))核酸分子雜交基本原理核酸分子雜交基本原理 復(fù)性復(fù)性變性變性 核酸分子雜交是指來源不同、具有互補(bǔ)序核酸分子雜交是指來源不同、具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對原則形成雙鏈的過程。補(bǔ)配對原則形成雙鏈的過程。（固相和液相雜交）（固

3、相和液相雜交）探針探針(probe) 雜交的一方是待測核酸序列，另一方是已知核酸序雜交的一方是待測核酸序列，另一方是已知核酸序列，通常把已知的核酸序列稱作探針（列，通常把已知的核酸序列稱作探針（probe）。）。 探針探針(probe)(probe)，是指與待測的分子發(fā)生特異性相互，是指與待測的分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子。作用，并可被特殊的方法探知的分子。 除了核酸探針外，探針利用抗體除了核酸探針外，探針利用抗體- -抗原、生物素抗原、生物素- -抗生物素蛋白、生長因子抗生物素蛋白、生長因子- -受體的相互作用的原理受體的相互作用的原理與靶分子結(jié)合。與靶分子結(jié)合。 核酸

4、探針應(yīng)具有的條件：核酸探針應(yīng)具有的條件： 帶有標(biāo)記物；帶有標(biāo)記物； 單鏈；單鏈； 高度特異性；高度特異性； 檢測方法應(yīng)簡單，靈敏度；檢測方法應(yīng)簡單，靈敏度；核酸探針的種類核酸探針的種類 基因組基因組DNADNA探針探針 cDNAcDNA探針探針 RNARNA探針探針 寡核苷酸探針寡核苷酸探針 核酸探針標(biāo)記物核酸探針標(biāo)記物 分為放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針兩分為放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針兩大類大類 1 1、放射性同位素、放射性同位素應(yīng)用廣泛，以應(yīng)用廣泛，以3232P P應(yīng)用最普遍，放射自顯影。應(yīng)用最普遍，放射自顯影。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高；優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高；缺點(diǎn)：放射性污染，半衰期短、不穩(wěn)定等。

5、缺點(diǎn)：放射性污染，半衰期短、不穩(wěn)定等。 2 2、非放射性標(biāo)記物、非放射性標(biāo)記物生物素：生物素：一種小分子水溶性維生素，一種小分子水溶性維生素，連接在堿基上，連接在堿基上，和抗生物素蛋白（和抗生物素蛋白（avidinavidin）特異結(jié)合，）特異結(jié)合，抗生物素蛋白上連接有顯色物質(zhì)抗生物素蛋白上連接有顯色物質(zhì)( (酶、熒光素等酶、熒光素等) ) 。地高辛：地高辛：一種類固醇半抗原分子，一種類固醇半抗原分子，可利用其抗體進(jìn)行免疫檢測，可利用其抗體進(jìn)行免疫檢測，原理類似于生物素的檢測。原理類似于生物素的檢測。 常將標(biāo)記物連接到某種脫氧核糖核苷三磷常將標(biāo)記物連接到某種脫氧核糖核苷三磷酸酸(dNTP(dN

6、TP) )上，然后可通過切口平移法、隨上，然后可通過切口平移法、隨機(jī)引物法、機(jī)引物法、PCRPCR標(biāo)記法、末端標(biāo)記法等方法標(biāo)記法、末端標(biāo)記法等方法標(biāo)記探針標(biāo)記探針 核酸探針的制備核酸探針的制備 切口平移法切口平移法反應(yīng)成分：反應(yīng)成分：Dnase I，E coli pol I, dATP,dGTP, dTTP, 32P-dCTP,待標(biāo)記的待標(biāo)記的DNA片段片段標(biāo)記結(jié)果：標(biāo)記結(jié)果：兩條鏈都均勻標(biāo)記兩條鏈都均勻標(biāo)記。5353雙鏈雙鏈DNA53535353帶切口的帶切口的雙鏈雙鏈DNADnase IMg2+E coli pol I-32P-dNTP變性變性32P部分標(biāo)記的部分標(biāo)記的單鏈單鏈DNA片段片

7、段切口原始位置切口原始位置切口最終位置切口最終位置32P標(biāo)記的標(biāo)記的DNADNA切口平移標(biāo)記法切口平移標(biāo)記法隨機(jī)寡核苷酸引物（隨機(jī)寡核苷酸引物（random primer)random primer)： 含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段含有各種可能排列順序的寡核苷酸片段的混合物，可以與任意核苷酸序列雜交，的混合物，可以與任意核苷酸序列雜交，起到聚合酶反應(yīng)引物的作用起到聚合酶反應(yīng)引物的作用 E.coliE.coli DNA DNA聚合酶聚合酶I I的的KlenowKlenow大片段（僅具大片段（僅具有有5-35-3多聚酶的活性，而無外切酶的活性）多聚酶的活性，而無外切酶的活性）隨機(jī)引物法隨機(jī)引

8、物法（randompriming )5353雙鏈雙鏈DNA35 單鏈單鏈DNA變性變性隨機(jī)引物隨機(jī)引物35Klenow片段片段-32P-dNTP35變性變性32P標(biāo)記的單鏈標(biāo)記的單鏈DNA探針探針DNA的隨機(jī)引物標(biāo)記法的隨機(jī)引物標(biāo)記法PCRPCR標(biāo)記法標(biāo)記法 在在PCR反應(yīng)底物中，將一種反應(yīng)底物中，將一種dNTP換成標(biāo)記物標(biāo)換成標(biāo)記物標(biāo)記的記的dNTP，這樣標(biāo)記的，這樣標(biāo)記的dNTP就可在就可在PCR反應(yīng)的反應(yīng)的同時摻入到新合成的同時摻入到新合成的DNA鏈上鏈上。 末端標(biāo)記法末端標(biāo)記法 DNA末端末端標(biāo)記法只是將末端末端標(biāo)記法只是將DNA片段的一片段的一端（端（5端或端或3端）進(jìn)行部分標(biāo)記。由

9、于標(biāo)記端）進(jìn)行部分標(biāo)記。由于標(biāo)記活性不高，標(biāo)記物摻入率低，一般極少用活性不高，標(biāo)記物摻入率低，一般極少用做核酸分子雜交探針標(biāo)記。做核酸分子雜交探針標(biāo)記。末端標(biāo)記法末端標(biāo)記法探針的純化探針的純化 目的：除去游離的標(biāo)記dNTP 方法：乙醇沉淀、凝膠過濾核酸印跡雜交技術(shù)原理和流程核酸印跡雜交技術(shù)原理和流程（a）（b）（c）（d）（e）基因組基因組DNADNA限制片段限制片段硝酸纖維素濾膜硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的同探針同源雜交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片DNA印跡雜交的主要步驟印跡雜交的主要步驟 待測待測DNA樣品的制備、酶切樣品的制備、酶切 待測待測DNA 樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠

10、電泳樣品的電泳分離：瓊脂糖凝膠電泳 凝膠中凝膠中DNA的變性：堿變性的變性：堿變性 印跡（轉(zhuǎn)膜）：印跡（轉(zhuǎn)膜）： 硝酸纖維素硝酸纖維素(NC)膜、尼龍膜膜、尼龍膜 毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法毛細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法 預(yù)雜交（封閉）預(yù)雜交（封閉） 探針的制備探針的制備 固相膜上雜交（控制溫度）固相膜上雜交（控制溫度） 洗膜：除去游離的探針洗膜：除去游離的探針 雜交信號的檢測雜交信號的檢測印跡雜交過程 樣品制備 電泳分離 印跡 預(yù)雜交 雜交 洗膜 分析固相支持物固相支持物 電泳用的凝膠不能直接做支持物 將核酸分子結(jié)合于表面 有較好的機(jī)械強(qiáng)度 常用硝酸纖維膜和尼龍膜上行毛細(xì)

11、管轉(zhuǎn)移上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移凝膠凝膠濾紙濾紙玻璃板玻璃板重物（重物（500g）支持物支持物轉(zhuǎn)移緩沖液轉(zhuǎn)移緩沖液濾紙濾紙NC膜或尼龍膜膜或尼龍膜吸水紙吸水紙（1）毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法）毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法幾種轉(zhuǎn)膜方法：幾種轉(zhuǎn)膜方法：（2）電轉(zhuǎn)移）電轉(zhuǎn)移一般用尼龍膜作電轉(zhuǎn)移的載體（一般用尼龍膜作電轉(zhuǎn)移的載體（NCNC膜不行）膜不行）單鏈單鏈DNADNA和和RNARNA可進(jìn)行轉(zhuǎn)移，雙鏈可進(jìn)行轉(zhuǎn)移，雙鏈DNADNA先在原位進(jìn)行堿先在原位進(jìn)行堿變性，隨后中和，再轉(zhuǎn)移變性，隨后中和，再轉(zhuǎn)移特點(diǎn)：轉(zhuǎn)移快，特點(diǎn)：轉(zhuǎn)移快，2-32-3小時即可；小時即可；（3）真空轉(zhuǎn)移）真空轉(zhuǎn)移使用真空轉(zhuǎn)移裝置，較毛細(xì)管轉(zhuǎn)移更為有效，快捷。使用

12、真空轉(zhuǎn)移裝置，較毛細(xì)管轉(zhuǎn)移更為有效，快捷。電轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法預(yù)雜交 固相膜可結(jié)合DNA，包括探針。 封閉固相膜上多余的結(jié)合位點(diǎn)。 常用非特異性的DNA或蛋白質(zhì)。影響雜交的因素影響雜交的因素 雜交溫度， 離子強(qiáng)度 DNA和探針濃度 雜交促進(jìn)劑，聚乙二醇 雜交時間常用核酸雜交分類常用核酸雜交分類Southern印跡印跡 檢測經(jīng)凝膠電泳分開的檢測經(jīng)凝膠電泳分開的DNA分子分子, 需轉(zhuǎn)印到膜上需轉(zhuǎn)印到膜上 Northern印跡印跡 檢測經(jīng)凝膠電泳分開的檢測經(jīng)凝膠電泳分開的RNA分子分子, 需轉(zhuǎn)移到膜上需轉(zhuǎn)移到膜上 斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交 檢測未經(jīng)分離的檢測未經(jīng)分離的,固定在膜上的固定在膜上的 DNA或或RN

13、A分子分子 菌落雜交和噬斑雜交菌落雜交和噬斑雜交 檢測固定在膜上的檢測固定在膜上的,經(jīng)裂解后從細(xì)菌和經(jīng)裂解后從細(xì)菌和 噬菌體中釋放的噬菌體中釋放的DNA分子分子原位雜交原位雜交 檢測細(xì)胞或組織中的檢測細(xì)胞或組織中的DNA或或RNA分子分子 雜交方法雜交方法 適用范圍適用范圍一、一、DNA印跡法（印跡法（Southern bloting ） 將電泳分離的待測將電泳分離的待測DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物上，然后用標(biāo)記的合到一定的固相支持物上，然后用標(biāo)記的DNA探針檢測待測探針檢測待測DNA的一種方法。的一種方法。用途：檢測目的用途：檢測目的DNA的存在，基因突變的存在，基因突

14、變DNA凝凝膠電泳膠電泳變性變性使使DNA單鏈轉(zhuǎn)單鏈轉(zhuǎn)移到硝酸纖維移到硝酸纖維素膜（素膜（NC）毛細(xì)管作用毛細(xì)管作用電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移真空吸引真空吸引與探針進(jìn)與探針進(jìn)行雜交行雜交放射自放射自顯影顯影顯出雜顯出雜交區(qū)帶交區(qū)帶Southern blottingSouthern印跡雜交法印跡雜交法M1 210SSC 轉(zhuǎn)移緩沖液轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙濾紙凝膠凝膠Whatman濾紙濾紙紙巾紙巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g1 2與探針同源雜交的與探針同源雜交的基因基因DNA片段片段基因組基因組DNADNA酶切片段酶切片段內(nèi)切酶內(nèi)切酶NC或尼龍膜或尼龍膜NC膜或尼龍膜膜或尼龍膜放放射射自自顯顯影

15、影照照片片操作：與操作：與DNA印跡相似印跡相似 RNA經(jīng)變性后再電泳，經(jīng)變性后再電泳， 凝膠中加甲醛保持凝膠中加甲醛保持RNA單鏈。單鏈。用途：檢測用途：檢測mRNA、檢測基因表達(dá)情況、檢測基因表達(dá)情況二、二、RNA印跡法（印跡法（Northern bloting）RNA凝凝膠電泳膠電泳使使DNA單鏈轉(zhuǎn)單鏈轉(zhuǎn)移到硝酸纖維移到硝酸纖維素膜（素膜（NC）毛細(xì)管作用毛細(xì)管作用電轉(zhuǎn)移電轉(zhuǎn)移真空吸引真空吸引與探針進(jìn)與探針進(jìn)行雜交行雜交放射自放射自顯影顯影顯出雜顯出雜交區(qū)帶交區(qū)帶Northern Blot-1，4糖基轉(zhuǎn)移酶在損傷坐骨神經(jīng)中的表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶在損傷坐骨神經(jīng)中的表達(dá)(三、斑點(diǎn)印跡三、斑點(diǎn)印跡操

16、作：不做電泳分離，將操作：不做電泳分離，將DNA、RNA樣品樣品變性后點(diǎn)在干的變性后點(diǎn)在干的NC上，與探針雜交。上，與探針雜交。用途：檢測用途：檢測DNA樣品同源性、細(xì)胞內(nèi)特樣品同源性、細(xì)胞內(nèi)特 定基因拷貝數(shù)；定基因拷貝數(shù)；mRNA的相對含的相對含 量。量。四、菌落雜交法和噬菌斑雜交法四、菌落雜交法和噬菌斑雜交法操作：操作：NC膜拓印培養(yǎng)的菌落膜拓印培養(yǎng)的菌落原位裂解菌落，釋放原位裂解菌落，釋放DNA預(yù)雜交預(yù)雜交雜交雜交結(jié)果分析結(jié)果分析從原培養(yǎng)皿篩選含目的從原培養(yǎng)皿篩選含目的DNA的陽性菌落的陽性菌落用途：篩選含有特異用途：篩選含有特異DNA序列的陽性菌落序列的陽性菌落 或噬菌斑或噬菌斑菌菌落

17、落雜雜交交概念：在細(xì)胞或組織切片中進(jìn)行核酸雜交并概念：在細(xì)胞或組織切片中進(jìn)行核酸雜交并 對其實(shí)行檢測的方法，稱為核酸原位對其實(shí)行檢測的方法，稱為核酸原位 雜交（雜交（nucleic acid hybridization in situ)用途：研究核酸序列在染色體中的精確定位；用途：研究核酸序列在染色體中的精確定位； 研究細(xì)胞特定基因表達(dá)水平；確定組織研究細(xì)胞特定基因表達(dá)水平；確定組織 有無病原體感染等。有無病原體感染等。五、核酸原位雜交（組織原位雜交）五、核酸原位雜交（組織原位雜交）原位雜交原位雜交蛋白質(zhì)印跡法蛋白質(zhì)印跡法 Western Western 印跡法（印跡法（Western blo

18、tingWestern bloting）分析）分析蛋白質(zhì)的化學(xué)基礎(chǔ)是其免疫原性，又稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)基礎(chǔ)是其免疫原性，又稱為免疫印跡法或酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法免疫印跡法或酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法 用途：用途： 鑒定一個蛋白質(zhì)樣品中的目的蛋白，檢鑒定一個蛋白質(zhì)樣品中的目的蛋白，檢測一目的蛋白在不同組織細(xì)胞的相對含量。測一目的蛋白在不同組織細(xì)胞的相對含量。 典型的印跡過程包括三個步驟典型的印跡過程包括三個步驟 蛋白質(zhì)的電泳分離；蛋白質(zhì)的電泳分離； 將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固體膜上，用非特異性，非反應(yīng)活性分子封閉固上，用非特異性，非反應(yīng)活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)

19、域；體膜上未吸附蛋白質(zhì)區(qū)域； 免疫學(xué)檢測。免疫學(xué)檢測。 免疫印免疫印跡跡（Western blotting)將待測蛋白質(zhì)將待測蛋白質(zhì)（抗原）變性（抗原）變性電泳電泳轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到NC膜上膜上加入加入抗體抗體加入標(biāo)記加入標(biāo)記的二體的二體顯示顯示區(qū)帶區(qū)帶檢測檢測封閉封閉檢測分析生物芯片技術(shù)（生物芯片技術(shù)（biochips）傳統(tǒng)核酸印跡雜交的缺點(diǎn)： 傳統(tǒng)核酸印跡雜交：Southern Blotting 和Northern Blotting等 技術(shù)復(fù)雜、自動化程度低、檢測目的分子數(shù)量少、低通量(low through-put)等生物芯片（生物芯片（biochips）指通過微加工和微電子技術(shù)在固體芯片表面

20、構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對生命機(jī)體的組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸、糖類以及其它生物組分進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。 生物芯片的特點(diǎn)：生物芯片的特點(diǎn)：高通量高通量（一張芯片同時可分析千上萬的分子） 微型化微型化（可裝入口袋） 自動化自動化（技術(shù)自動化；結(jié)果分析自動化） 低成本低成本（相對于同時進(jìn)行大量分子研究而言） 生物芯片的分類：生物芯片的分類：生物芯片DNA芯片（基因芯片）蛋白質(zhì)芯片組織芯片細(xì)胞芯片微陣列芯片芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-chip）正處于研究階段芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。芯片實(shí)驗(yàn)室是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)?；蛐酒℅ene chip） 又稱為DNA

21、微陣列（DNA Microarray）或DNA芯片（DNA chip）。 將大量的基因探針分子固定于支持物上，然后與經(jīng)過標(biāo)記的樣品DNA進(jìn)行雜交，探針能夠在基因混合物中識別出特定基因，最后通過檢測雜交信號的強(qiáng)度及分布來對特定基因進(jìn)行分析?；蛐酒猛净蛐酒猛颈磉_(dá)譜芯片（最常用） 指紋圖譜芯片 毒理芯片 診斷芯片 測序芯片 Affymetrix基因芯片的實(shí)驗(yàn)流程 2. 基因芯片技術(shù)流程基因芯片技術(shù)流程顯微光蝕刻/壓電打印/分子印章原位合成法探針設(shè)計(jì)與制備支持物預(yù)處理探針打印探針固化DNA芯片微量點(diǎn)樣法核酸提純 擴(kuò)增與標(biāo)記 標(biāo)記核酸純化樣品準(zhǔn)備雜交與漂洗掃描與分析 基因芯片制備基因芯片制備 就

22、是根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?，將設(shè)計(jì)好的檢測探針，通過一定的方法固定到固相支持物上。 主要有兩種：原位合成法和直接點(diǎn)樣法原位合成法和直接點(diǎn)樣法的比較 樣品制備樣品制備 與一般的核酸提取比較類似，只不過為了降低污染和提高檢測靈敏度增加了純化、擴(kuò)增（PCR）和標(biāo)記。 生物素 常用標(biāo)記物： 熒光素待測樣品（用Cy3-dUTP 標(biāo)記） 對照樣品（Cy5-dUTP） 待測樣品用待測樣品用Cy3，發(fā)射，發(fā)射562nm紅色紅色熒光熒光對照樣品用對照樣品用Cy5，發(fā)射，發(fā)射664nm綠色綠色熒光熒光 以表達(dá)譜芯片為例：以表達(dá)譜芯片為例：I. 提取樣本組織細(xì)胞中的提取樣本組織細(xì)胞中的mRNA（樣本要新鮮并有代表性）（樣本要新鮮并有代表性）II. 對提取出的對提取出的mRN