第四章第一節(jié)植物細(xì)胞組織和器官超低溫保存

1、 第四章第四章 園藝植物種質(zhì)資源離體保存園藝植物種質(zhì)資源離體保存與與無性系變異篩選無性系變異篩選 第一節(jié)第一節(jié) 園藝植物種質(zhì)資源的離體保存園藝植物種質(zhì)資源的離體保存 種質(zhì)保存（種質(zhì)保存（germplasm conservation）是指利用天）是指利用天然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境保存種質(zhì)資源，使個(gè)體中所然或人工創(chuàng)造的適宜環(huán)境保存種質(zhì)資源，使個(gè)體中所含遺傳物質(zhì)保持其遺傳的完整性和較高的活力，含遺傳物質(zhì)保持其遺傳的完整性和較高的活力， 并能并能通過繁殖將其遺傳性傳遞下去。通過繁殖將其遺傳性傳遞下去。 種質(zhì)資源保存種質(zhì)資源保存 常規(guī)的種質(zhì)資源保存的方法常規(guī)的種質(zhì)資源保存的方法1965年年Henshaw和

2、和Morel首次提出首次提出germplasm conservation in vitro；1982年國際植物遺傳資源委員會(huì)專門成立了離體保存咨詢年國際植物遺傳資源委員會(huì)專門成立了離體保存咨詢委員會(huì)委員會(huì)(advise committee on in vitro storage)。 種質(zhì)資源離體保存種質(zhì)資源離體保存（germplasm conservation in vitro）：限制生長保存和超低溫保存）：限制生長保存和超低溫保存一、限制生長保存一、限制生長保存 限制生長保存限制生長保存（restricting conservation）是指改）是指改變培養(yǎng)物生長的外界環(huán)境條件，限制離體保存

3、材料變培養(yǎng)物生長的外界環(huán)境條件，限制離體保存材料的生長速度，使細(xì)胞生長降至最小限度，但不死亡，的生長速度，使細(xì)胞生長降至最小限度，但不死亡，從而達(dá)到延長繼代培養(yǎng)時(shí)間的目的。從而達(dá)到延長繼代培養(yǎng)時(shí)間的目的。 目前使用較多的限制細(xì)胞生長的措施有目前使用較多的限制細(xì)胞生長的措施有改變培養(yǎng)改變培養(yǎng)環(huán)境環(huán)境（如降低培養(yǎng)溫度、減少培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣含量、（如降低培養(yǎng)溫度、減少培養(yǎng)瓶內(nèi)氧氣含量、減少光照等）、減少光照等）、提高培養(yǎng)基滲透壓提高培養(yǎng)基滲透壓、加入生長抑制加入生長抑制劑劑、饑餓法饑餓法、失水干燥保存失水干燥保存等等。1.低溫保存低溫保存 低溫保存又稱微生長保存或最小生長法，是利用低溫保存又稱微生長保存

4、或最小生長法，是利用植物生命活動(dòng)隨著溫度的降低而減弱甚至幾乎完全植物生命活動(dòng)隨著溫度的降低而減弱甚至幾乎完全停止的原理，將外植體在低溫條件下，結(jié)合其他不停止的原理，將外植體在低溫條件下，結(jié)合其他不適合生長的環(huán)境條件，從而抑制或延緩離體培養(yǎng)物適合生長的環(huán)境條件，從而抑制或延緩離體培養(yǎng)物的生長和發(fā)育，延長壽命、達(dá)到種質(zhì)保存的目的。的生長和發(fā)育，延長壽命、達(dá)到種質(zhì)保存的目的。 低溫保存種質(zhì)常用溫度范圍有低溫保存種質(zhì)常用溫度范圍有3種：常溫（種：常溫（ 20 5 ）、常低溫（）、常低溫（015 ）、低溫（）、低溫（-800 ）。）。 低溫保存是種質(zhì)資源短期和中期保存常用的方法。低溫保存是種質(zhì)資源短期和

5、中期保存常用的方法。 主要適用再生植株、分生組織培養(yǎng)物的保存主要適用再生植株、分生組織培養(yǎng)物的保存2. 干燥保存干燥保存 將愈傷組織或體細(xì)胞胚等培養(yǎng)物，適當(dāng)干燥失水，移入適將愈傷組織或體細(xì)胞胚等培養(yǎng)物，適當(dāng)干燥失水，移入適宜的低溫下，可成功保存種質(zhì)。宜的低溫下，可成功保存種質(zhì)。（1）預(yù)處理：將蔗糖濃度增至）預(yù)處理：將蔗糖濃度增至0.15mol/L或更高，預(yù)處理或更高，預(yù)處理12-20d。（2）干燥：包括膠囊化處理（）干燥：包括膠囊化處理（encapasulation treatment）和脫水處理（和脫水處理（desiccation treatment）等方法。）等方法。（3）儲(chǔ)藏：通常選用）

6、儲(chǔ)藏：通常選用0以上低溫，或室溫儲(chǔ)藏。以上低溫，或室溫儲(chǔ)藏。3. 生長抑制保存生長抑制保存 采用生長抑制劑或生長延緩劑延緩培養(yǎng)物的生長，延長保采用生長抑制劑或生長延緩劑延緩培養(yǎng)物的生長，延長保存時(shí)間。存時(shí)間。 如采用如采用3mg/L的的ABA使草莓試管苗在使草莓試管苗在251的常溫下保存的常溫下保存12個(gè)月，存活率個(gè)月，存活率62.5%；延長；延長5個(gè)月保存時(shí)間。在個(gè)月保存時(shí)間。在62保存保存15個(gè)月，存活率個(gè)月，存活率100%。 常用生長延緩劑有常用生長延緩劑有ABA、多效唑（、多效唑（PP333）、矮壯素（）、矮壯素（CCC）和比久和比久(B9)和生長抑制劑三碘苯甲酸（和生長抑制劑三碘苯甲

7、酸（TIBA）、烯效唑（）、烯效唑（S-3307）和青鮮素（）和青鮮素（MH）等。）等。4. 高滲透壓保存高滲透壓保存 提高培養(yǎng)基滲透壓可以一直培養(yǎng)材料的生長。如在提高培養(yǎng)基滲透壓可以一直培養(yǎng)材料的生長。如在培養(yǎng)基中添加滲透化合物，如高濃度蔗糖、甘露醇、培養(yǎng)基中添加滲透化合物，如高濃度蔗糖、甘露醇、山梨醇等。山梨醇等。 蔗糖濃度由蔗糖濃度由3%提高到提高到10%左右，可明顯抑制培養(yǎng)左右，可明顯抑制培養(yǎng)物的生長。物的生長。二、超低溫保存二、超低溫保存 超低溫保存是指在超低溫保存是指在-80-80至至-196-196甚至更低溫度下進(jìn)行甚至更低溫度下進(jìn)行生物材料的保存。生物材料的保存。在超低溫環(huán)境下

8、，植物活細(xì)胞的代謝和在超低溫環(huán)境下，植物活細(xì)胞的代謝和生長幾乎完全停止，植物處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，但能保持生長幾乎完全停止，植物處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，但能保持正常的活性和形態(tài)發(fā)生能力，從而達(dá)到長期保存的目的，正常的活性和形態(tài)發(fā)生能力，從而達(dá)到長期保存的目的，在適宜的條件下可迅速繁殖，再生出新的植株，并保持原在適宜的條件下可迅速繁殖，再生出新的植株，并保持原來的遺傳特性。來的遺傳特性。 1. 保持細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性；保持細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性；2. 長期保存植物的種質(zhì)資源長期保存植物的種質(zhì)資源;3. 長期保存農(nóng)作物的優(yōu)良品種及其育種親本材料的種質(zhì)；長期保存農(nóng)作物的優(yōu)良品種及其育種親本材料的種質(zhì)；

9、4. 建立長期保存的莖尖分生組織種質(zhì)庫及無病毒的原種；建立長期保存的莖尖分生組織種質(zhì)庫及無病毒的原種；5 . 保存實(shí)驗(yàn)材料，防止再培養(yǎng)中遺傳變異。保存實(shí)驗(yàn)材料，防止再培養(yǎng)中遺傳變異。超低溫保存的作用及意義超低溫保存的作用及意義（一）超低溫保存的原理（一）超低溫保存的原理 在低于在低于-800C的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此采取適部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏兀纯墒股町?dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏?，即可使生命活?dòng)固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆絼?dòng)固定在某一階段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)?/p>

10、方法將凍存的生物材料恢復(fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生法將凍存的生物材料恢復(fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常?；磻?yīng)可恢復(fù)正常。 冷凍保存冷凍保存是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加在加有或不加冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（速率降至零下某一溫度（一般是低于一般是低于-800C的超低的超低溫條件溫條件），并在此溫度下對(duì)其長期保存的過程。），并在此溫度下對(duì)其長期保存的過程。 而而復(fù)蘇復(fù)蘇是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)是以一定的復(fù)溫速率將凍存的體外培養(yǎng)物或生物活性材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物或生物活性

11、材料恢復(fù)到常溫的過程。不論是微生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。 水在低于零度的條件下會(huì)結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸水在低于零度的條件下會(huì)結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分細(xì)胞內(nèi)外的水分都都會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破會(huì)結(jié)冰，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷冰晶損傷。 如果將細(xì)胞懸浮

12、在溶液中，隨著溫度的降低，如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會(huì)首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶細(xì)胞外部的水分會(huì)首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到質(zhì)的溶液中且時(shí)間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會(huì)受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時(shí)，大量水分會(huì)因損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時(shí)，大量水分會(huì)因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶質(zhì)損傷或稱溶液損

13、傷。溶液損傷。 當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷溶質(zhì)損傷和和冰晶損傷冰晶損傷。因?yàn)槔湟驗(yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低凍保護(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。 在復(fù)蘇時(shí)，一般以很快

14、的速度升溫，在復(fù)蘇時(shí)，一般以很快的速度升溫，1-2分分鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大鐘內(nèi)即恢復(fù)到常溫，細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過的冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時(shí)間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生長的時(shí)間，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍，凍存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。存的細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常的結(jié)構(gòu)和功能。冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的冷凍保護(hù)效果還與冷凍速率、冷凍速率、冷凍溫度和復(fù)溫速率冷凍溫度和復(fù)溫速率有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)有關(guān)。而且不同的冷凍保護(hù)劑其冷凍保護(hù)效果也不一樣。劑其冷凍保護(hù)

15、效果也不一樣。 1. 主要儀器設(shè)備主要儀器設(shè)備 (1) 用于組織和細(xì)胞培養(yǎng)的全套設(shè)備；用于組織和細(xì)胞培養(yǎng)的全套設(shè)備； (2) 普通冰箱；普通冰箱； (3)-70 - -80的超低溫冰箱；的超低溫冰箱； (4) 程序降溫儀；程序降溫儀； （二）超低溫保存的基本設(shè)備和程序（二）超低溫保存的基本設(shè)備和程序(5) 玻璃或塑料試管（玻璃或塑料試管（5ml 或或10 m1），封蓋嚴(yán)密，），封蓋嚴(yán)密，不進(jìn)液氮；不進(jìn)液氮；(6) 液氮液氮;(7) 光學(xué)顯微鏡和紫外熒光顯微鏡；光學(xué)顯微鏡和紫外熒光顯微鏡； (8) 分光光度計(jì)。分光光度計(jì)。 2 . 基本程序基本程序 (1) 材料的準(zhǔn)備與選擇。材料的準(zhǔn)備與選擇。

16、(2) 預(yù)處理。預(yù)處理。 (3) 將材料裝入試管，并隨即插入冰浴中。將材料裝入試管，并隨即插入冰浴中。 (4) 加入加入0預(yù)冷的冰保護(hù)劑，在預(yù)冷的冰保護(hù)劑，在0(冰浴中冰浴中)放置放置30一一45分鐘。分鐘。 (5) 降溫冰凍。降溫冰凍。(6) 保存后的化凍：一般在保存后的化凍：一般在3740 溫水浴中快溫水浴中快速化凍。速化凍。(7) 活力測(cè)定活力測(cè)定, 通常采用通常采用TTC法法(氯化三苯四氮唑氯化三苯四氮唑還原法還原法)。如果是單細(xì)胞或原生質(zhì)體，可采用活。如果是單細(xì)胞或原生質(zhì)體，可采用活性熒光素染色法，顯示活細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)存活率。性熒光素染色法，顯示活細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)存活率。(8) 再培養(yǎng)，觀察組

17、織細(xì)胞恢復(fù)生長的速度、存再培養(yǎng)，觀察組織細(xì)胞恢復(fù)生長的速度、存活率、植株的再生能力?；盥省⒅仓甑脑偕芰?。(9) 遺傳性狀的分析：如植株的形態(tài)特征、生長遺傳性狀的分析：如植株的形態(tài)特征、生長發(fā)育狀況、染色體、同工酶及抗逆性等。發(fā)育狀況、染色體、同工酶及抗逆性等。1材料的特性；材料的特性； 植物的種子、莖尖、花粉、胚狀體、愈傷組織、懸浮植物的種子、莖尖、花粉、胚狀體、愈傷組織、懸浮細(xì)胞、原生質(zhì)體等均可用于超低溫保存。細(xì)胞、原生質(zhì)體等均可用于超低溫保存。但基因型、抗但基因型、抗凍性、器官組織和細(xì)胞年齡、生理狀態(tài)影響凍性、器官組織和細(xì)胞年齡、生理狀態(tài)影響存活率。存活率。 具有豐富稠密、未液泡化的細(xì)胞

18、質(zhì)，細(xì)胞壁薄，體積具有豐富稠密、未液泡化的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞壁薄，體積小，分裂相細(xì)胞比例高，細(xì)胞內(nèi)自由水含量低的細(xì)胞適小，分裂相細(xì)胞比例高，細(xì)胞內(nèi)自由水含量低的細(xì)胞適宜超低溫保存。宜超低溫保存。 2預(yù)處理預(yù)處理 目的：目的：A. 增加細(xì)胞分裂和同步化；增加細(xì)胞分裂和同步化； B. 減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量；減少細(xì)胞內(nèi)自由水的含量； C. 增強(qiáng)細(xì)胞的抗寒性。增強(qiáng)細(xì)胞的抗寒性。（三）影響超低溫保存效果的主要因素（三）影響超低溫保存效果的主要因素 預(yù)處理方法：預(yù)處理方法： (1)繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng): 細(xì)胞、組織繼代培養(yǎng)中細(xì)胞分細(xì)胞、組織繼代培養(yǎng)中細(xì)胞分裂分化同步化的調(diào)控，增加指數(shù)生長期細(xì)胞。裂分化同步化的調(diào)控

19、，增加指數(shù)生長期細(xì)胞。 (2)預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng): 增加培養(yǎng)基中的糖濃度，提高滲透增加培養(yǎng)基中的糖濃度，提高滲透壓；或在預(yù)培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)抗寒力的物質(zhì)或壓；或在預(yù)培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)抗寒力的物質(zhì)或冰凍保護(hù)劑，如脫落酸冰凍保護(hù)劑，如脫落酸(ABA)，山梨糖醇、脯，山梨糖醇、脯氨酸及二甲基亞砜氨酸及二甲基亞砜(DMSO)等。等。 (3)低溫鍛煉：如香石竹莖尖經(jīng)低溫鍛煉：如香石竹莖尖經(jīng)4低溫預(yù)處理低溫預(yù)處理14天，不僅提高了存活率而且分化率從天，不僅提高了存活率而且分化率從30增加到增加到60。 3冰凍保護(hù)劑冰凍保護(hù)劑 迄今，已經(jīng)報(bào)道了多種類型的冰凍保護(hù)劑。迄今，已經(jīng)報(bào)道了多種類型的冰凍保護(hù)劑。分為滲透性和非

20、滲透性冰凍保護(hù)劑。前者如二甲分為滲透性和非滲透性冰凍保護(hù)劑。前者如二甲基亞砜基亞砜(DMSO)、甘油、乙二醇、乙酰胺等，后、甘油、乙二醇、乙酰胺等，后者有蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇者有蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡、聚乙烯吡咯烷酮（咯烷酮（PVP)等。等。 但作為冰凍保護(hù)劑的物質(zhì)應(yīng)該具備以下特性：但作為冰凍保護(hù)劑的物質(zhì)應(yīng)該具備以下特性： （1）易溶于水；）易溶于水；（2）在適當(dāng)濃度下對(duì)細(xì)胞無毒；）在適當(dāng)濃度下對(duì)細(xì)胞無毒；（3）化凍后容易從組織細(xì)胞中去除?；瘍龊笕菀讖慕M織細(xì)胞中去除。 冷凍保護(hù)劑的作用：冷凍保護(hù)劑的作用：(1) 降低冰點(diǎn)，促進(jìn)過冷卻和降低冰點(diǎn)，促進(jìn)過冷卻和“玻璃態(tài)化玻璃態(tài)

21、化”的形成；的形成；(2) 提高溶液的粘滯性，阻止冰晶的生長，提高溶液的粘滯性，阻止冰晶的生長，(3) DMSO可使膜物質(zhì)分子重新分布，增加細(xì)胞膜的透性，可使膜物質(zhì)分子重新分布，增加細(xì)胞膜的透性，在溫度降低時(shí)，加速細(xì)胞內(nèi)的水流到細(xì)胞外結(jié)冰，防止細(xì)在溫度降低時(shí)，加速細(xì)胞內(nèi)的水流到細(xì)胞外結(jié)冰，防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的傷害；胞內(nèi)結(jié)冰的傷害；(4) 穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的大分子結(jié)構(gòu)，特別是膜結(jié)構(gòu)，阻止低溫傷穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的大分子結(jié)構(gòu)，特別是膜結(jié)構(gòu)，阻止低溫傷害，非透性保護(hù)劑的主要作用在質(zhì)膜上。害，非透性保護(hù)劑的主要作用在質(zhì)膜上。 4降溫冰凍方法降溫冰凍方法 (1) 快速冰凍法：將材料從快速冰凍法：將材料從0，或者其他預(yù)處理

22、，或者其他預(yù)處理溫度溫度 (如木本植物的冬芽在如木本植物的冬芽在-3 -10預(yù)處理預(yù)處理20天天)直接投入液氮。其降溫速度在每分鐘直接投入液氮。其降溫速度在每分鐘l000以上。以上。適合高度脫水的材料，如種子、花粉、冬芽等。適合高度脫水的材料，如種子、花粉、冬芽等。 植物體內(nèi)的水分在降溫冰凍過程中，植物體內(nèi)的水分在降溫冰凍過程中，從從-10到到-140是冰晶形成和增長的危險(xiǎn)溫度區(qū)，是冰晶形成和增長的危險(xiǎn)溫度區(qū)，在在- 140以以下，冰晶不再增生。因此，快速冰凍法成功的關(guān)鍵下，冰晶不再增生。因此，快速冰凍法成功的關(guān)鍵在于，利用超速冷凍，使細(xì)胞內(nèi)的水分迅速通過冰在于，利用超速冷凍，使細(xì)胞內(nèi)的水分迅

23、速通過冰晶生長的危險(xiǎn)溫度區(qū)，即細(xì)胞內(nèi)的水分還未來得及晶生長的危險(xiǎn)溫度區(qū)，即細(xì)胞內(nèi)的水分還未來得及形成冰晶中心，就降到了形成冰晶中心，就降到了-196的安全溫度，從而的安全溫度，從而避免了細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的危險(xiǎn)。避免了細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的危險(xiǎn)。 (2)慢速冰凍法：通常成熟的植物細(xì)胞都具有大的慢速冰凍法：通常成熟的植物細(xì)胞都具有大的液泡，含有大量水分。對(duì)大多數(shù)植物材料說來，不液泡，含有大量水分。對(duì)大多數(shù)植物材料說來，不適宜采用快速冰凍法，而需要在冰凍保護(hù)劑存在的適宜采用快速冰凍法，而需要在冰凍保護(hù)劑存在的條件下，采用慢速冰凍法。條件下，采用慢速冰凍法。以每分鐘以每分鐘0. 1-10的降的降溫速度溫速度(一般一般

24、12分較好分較好)。降到。降到-70左右左右，隨隨即浸入液氮，或者以此種速度連續(xù)降到即浸入液氮，或者以此種速度連續(xù)降到-196。在。在這種降溫速度下，可以使細(xì)胞內(nèi)的水分有充足的時(shí)這種降溫速度下，可以使細(xì)胞內(nèi)的水分有充足的時(shí)間不斷流到細(xì)胞外結(jié)冰，從而使細(xì)胞內(nèi)的水分減少間不斷流到細(xì)胞外結(jié)冰，從而使細(xì)胞內(nèi)的水分減少到最低限度，達(dá)到良好的脫水效應(yīng)，避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)到最低限度，達(dá)到良好的脫水效應(yīng)，避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。冰。該方法適用于成熟含有大液泡和含水量高的細(xì)該方法適用于成熟含有大液泡和含水量高的細(xì)胞。胞。 (3)兩步冰凍法：這種方法是慢凍法和快凍法兩步冰凍法：這種方法是慢凍法和快凍法的結(jié)合，或者說，是一種改良

25、的慢凍法。的結(jié)合，或者說，是一種改良的慢凍法。 第一第一步是用慢速降溫法從步是用慢速降溫法從0降到一定的預(yù)凍溫度，降到一定的預(yù)凍溫度，并停留一段時(shí)間，使細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性脫并停留一段時(shí)間，使細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性脫水；水； 第二步，投入液氮中迅速冰凍。第二步，投入液氮中迅速冰凍。 (4)逐級(jí)冰凍法：此方法是制備不同等級(jí)溫度的逐級(jí)冰凍法：此方法是制備不同等級(jí)溫度的冰浴，如冰浴，如-10，-15，-23，-35，或，或-40等。保存材料經(jīng)冰凍保護(hù)劑在等。保存材料經(jīng)冰凍保護(hù)劑在0預(yù)處理后，逐預(yù)處理后，逐步通過這些溫度，樣品在每級(jí)溫度上停留一定時(shí)步通過這些溫度，樣品在每級(jí)溫度上停留一定時(shí)間間(46分鐘

26、分鐘)，然后浸入液氮。，然后浸入液氮。 5. 冷凍保存：冷凍保存：超低溫保存的冷源有干冰（超低溫保存的冷源有干冰（-79）、超低溫冰箱（、超低溫冰箱（-80-150 ），液氮蒸汽相（），液氮蒸汽相（-140 ）和液氮（）和液氮（-196 ）等，以液氮最為常用。）等，以液氮最為常用。 6解凍方法解凍方法 實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)，實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)，植物的凍害常發(fā)生在冰涼和化植物的凍害常發(fā)生在冰涼和化凍兩個(gè)過程凍兩個(gè)過程。因此要使植物種質(zhì)的超低溫保存獲因此要使植物種質(zhì)的超低溫保存獲得成功，不僅要求有一個(gè)合適的降溫冰凍程序，得成功，不僅要求有一個(gè)合適的降溫冰凍程序，而且還要求采取合適的解凍方法，以避免在解凍而且還要

27、求采取合適的解凍方法，以避免在解凍過程中產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的次生結(jié)冰，并應(yīng)防止在解凍過程中產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的次生結(jié)冰，并應(yīng)防止在解凍吸水過程中水的滲透沖擊對(duì)細(xì)胞膜體系的破壞。吸水過程中水的滲透沖擊對(duì)細(xì)胞膜體系的破壞。 通常采用快速解凍方法，即將液氮保存后的材通常采用快速解凍方法，即將液氮保存后的材料在料在37-40的溫水浴中化凍。因?yàn)槌蜏乇鶅龅臏厮≈谢瘍觥Ｒ驗(yàn)槌蜏乇鶅霾牧匣瘍鰰r(shí)，再次結(jié)冰的危險(xiǎn)溫度區(qū)域大約是材料化凍時(shí)，再次結(jié)冰的危險(xiǎn)溫度區(qū)域大約是-50至至-10。從理論上說，借助迅速的化凍速。從理論上說，借助迅速的化凍速度通過此溫度區(qū)，從而避免細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰。度通過此溫度區(qū)，從而避免細(xì)胞內(nèi)次生結(jié)冰。

28、慢速解凍是將液氮中保存的材料先置于慢速解凍是將液氮中保存的材料先置于0 低低溫下解凍，再逐級(jí)升至室溫下進(jìn)行解凍慢速解凍溫下解凍，再逐級(jí)升至室溫下進(jìn)行解凍慢速解凍可以使水分緩慢深入細(xì)胞，避免因強(qiáng)烈滲透而造可以使水分緩慢深入細(xì)胞，避免因強(qiáng)烈滲透而造成水分對(duì)細(xì)胞膜的破壞，適合含水量較少的材料，成水分對(duì)細(xì)胞膜的破壞，適合含水量較少的材料，如木本植物的冬芽。如木本植物的冬芽。7再培養(yǎng)：再培養(yǎng)： 指已解凍的材料重新置于培養(yǎng)基上使其恢復(fù)生指已解凍的材料重新置于培養(yǎng)基上使其恢復(fù)生長的過程。再培養(yǎng)是檢驗(yàn)冷凍保存效果或確定保長的過程。再培養(yǎng)是檢驗(yàn)冷凍保存效果或確定保存方法是否適合的最根本方法。存方法是否適合的最根

29、本方法。 黑暗條件下有黑暗條件下有利于超低溫保存培養(yǎng)物的恢復(fù)生長。利于超低溫保存培養(yǎng)物的恢復(fù)生長。1. 顯示細(xì)跑活力的顯示細(xì)跑活力的TTC法法(氯化三苯四氮唑還原法氯化三苯四氮唑還原法) ，反映脫氫酶活力。反映脫氫酶活力。2顯示細(xì)胞存活率的二醋酸酯熒光素顯示細(xì)胞存活率的二醋酸酯熒光素(FDA)染色法，染色法，反映酯酶的脫脂化作用，或采用中性紅染色法。反映酯酶的脫脂化作用，或采用中性紅染色法。3. 再培養(yǎng)再培養(yǎng) 新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。存在停滯期。新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。存在停滯期。（四）超低溫保存后細(xì)胞活力、存活率及遺傳（四）超低溫保存后細(xì)胞活力、存活率及遺傳特性的觀測(cè)特性的觀測(cè)4. 遺傳性狀的分析：遺傳

30、性狀的分析： 1)細(xì)胞全能性的保持：形態(tài)發(fā)生能力的表達(dá)情況。細(xì)胞全能性的保持：形態(tài)發(fā)生能力的表達(dá)情況。2)后代的形態(tài)特征及生長發(fā)育狀況。后代的形態(tài)特征及生長發(fā)育狀況。3)后代染色體的分析。后代染色體的分析。4)同工酶譜的分析。同工酶譜的分析。5)特殊產(chǎn)物的分析。特殊產(chǎn)物的分析。6)抗逆性的分析?？鼓嫘缘姆治?。芽及莖尖分生組織的超低溫保存芽及莖尖分生組織的超低溫保存1、莖尖超低溫保存植物種類：、莖尖超低溫保存植物種類：2. 莖尖分生組織的超低溫保存程序（基于保護(hù)性脫水）：莖尖分生組織的超低溫保存程序（基于保護(hù)性脫水）： （1）種子消毒滅菌種子消毒滅菌，種子經(jīng)，種子經(jīng)70酒精迅速漂洗，酒精迅速漂洗

31、，10漂白漂白粉溶液消毒粉溶液消毒20分鐘，無菌水洗滌分鐘，無菌水洗滌4次次 (2)在在無菌條件下播種無菌條件下播種于具潤濕濾紙的滅菌培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿于具潤濕濾紙的滅菌培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿內(nèi)。置于內(nèi)。置于2528培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。 (3)萌發(fā)萌發(fā)生長生長45天后，在無菌條件下切取莖尖的分生組織，天后，在無菌條件下切取莖尖的分生組織，0.3一一0.5mm長長，第，第1對(duì)葉原基。在實(shí)體解副鏡下進(jìn)行操作。對(duì)葉原基。在實(shí)體解副鏡下進(jìn)行操作。 (4)將切取的將切取的莖尖分生組織接種于固體莖尖分生組織接種于固體B5培養(yǎng)基上，內(nèi)含培養(yǎng)基上，內(nèi)含0.5pmolL BA及及5%DMSO，光照，光照16

32、小時(shí)，溫度小時(shí)，溫度2015預(yù)培養(yǎng)預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)。小時(shí)。 (5)預(yù)培養(yǎng)后，將培養(yǎng)瓶浸入預(yù)培養(yǎng)后，將培養(yǎng)瓶浸入冰浴中冰浴中2小時(shí)小時(shí)。 (6)將莖尖分生組織將莖尖分生組織轉(zhuǎn)移到在冰浴中預(yù)冷的具有轉(zhuǎn)移到在冰浴中預(yù)冷的具有1m1液體液體B5培養(yǎng)基的離心管培養(yǎng)基的離心管中。中。 (7)逐步逐步加入等體積的預(yù)冷的加入等體積的預(yù)冷的10DMSO，在，在30分鐘內(nèi)加分鐘內(nèi)加完，使完，使DMSO的最終濃度為的最終濃度為5%，然后再放置然后再放置10一一30分分鐘鐘 (8)密封離心管口，密封離心管口，以每分鐘降低以每分鐘降低0.6的速度慢速降溫的速度慢速降溫到到40，然后浸入液氮中，然后浸入液氮中(196)。

33、(9)在液氮中貯存在液氮中貯存定時(shí)期后，定時(shí)期后，取出材料在取出材料在27水浴中水浴中迅速化凍迅速化凍?；瘍龊罅⒓磳⒃嚬苻D(zhuǎn)移到冰浴中?；瘍龊罅⒓磳⒃嚬苻D(zhuǎn)移到冰浴中 (10)用等體積用等體積B5培養(yǎng)基培養(yǎng)基在在30分鐘內(nèi)，分分鐘內(nèi)，分6次逐步加入試次逐步加入試管中。管中。 (11)吸去混合液，并用吸去混合液，并用B 5培養(yǎng)基洗滌培養(yǎng)基洗滌4次。然后將次。然后將莖尖莖尖分生組織轉(zhuǎn)移到固體分生組織轉(zhuǎn)移到固體B5分化培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基上。上。3周后可分化成苗。周后可分化成苗。植株的再生率達(dá)植株的再生率達(dá)70以上，已有的試驗(yàn)表明，貯存以上，已有的試驗(yàn)表明，貯存2年多年多仍能存活。仍能存活。 Sakai(1

34、990)和和Yamada(1991)建立了一種莖尖建立了一種莖尖分生組織的超低溫保存簡便方法，即分生組織的超低溫保存簡便方法，即玻璃化超低玻璃化超低溫保存溫保存，該技術(shù)的關(guān)鍵是，該技術(shù)的關(guān)鍵是，在冰凍前，采用高濃在冰凍前，采用高濃度的冰凍保護(hù)劑使保存材料脫水，以致不需要慢度的冰凍保護(hù)劑使保存材料脫水，以致不需要慢速程序降溫，從室溫直接浸入液氯，速程序降溫，從室溫直接浸入液氯，即可獲得很即可獲得很高的存活率。高的存活率。 玻璃化超低溫玻璃化超低溫保存的優(yōu)點(diǎn)：保存的優(yōu)點(diǎn)：（1）不需要昂貴）不需要昂貴的程序降溫儀；（的程序降溫儀；（2）避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成；）避免細(xì)胞內(nèi)外冰晶的形成；（3）適合各種

35、外植體。）適合各種外植體。 基于玻璃化處理結(jié)合快速降溫的超低溫保存方法：基于玻璃化處理結(jié)合快速降溫的超低溫保存方法：（1）玻璃化法：）玻璃化法：是指冰凍保護(hù)劑對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理是指冰凍保護(hù)劑對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理后，再用高濃度的玻璃化保護(hù)劑進(jìn)行脫水處理，然后后，再用高濃度的玻璃化保護(hù)劑進(jìn)行脫水處理，然后快速投入液氮保存。快速投入液氮保存?；境绦颍夯境绦颍翰牧线x擇材料選擇-預(yù)處理預(yù)處理-裝載裝載-玻璃化保護(hù)劑脫水處理玻璃化保護(hù)劑脫水處理-液氮保存液氮保存-解凍和洗滌解凍和洗滌-活性檢測(cè)和恢復(fù)培養(yǎng)。活性檢測(cè)和恢復(fù)培養(yǎng)。（2）包埋）包埋-脫水法：脫水法：將包含樣品的海藻酸鈉溶液滴入將包含樣品的海藻酸鈉溶

36、液滴入高鈣溶液，固化成球狀顆粒，同時(shí)輔以高濃度蔗糖預(yù)高鈣溶液，固化成球狀顆粒，同時(shí)輔以高濃度蔗糖預(yù)處理樣品，使樣品獲得高抗凍力和抗脫水力。處理樣品，使樣品獲得高抗凍力和抗脫水力?；境绦颍夯境绦颍翰牧线x擇材料選擇-海藻酸鈉包埋樣品海藻酸鈉包埋樣品-高濃度蔗糖預(yù)培養(yǎng)高濃度蔗糖預(yù)培養(yǎng)-無菌培養(yǎng)或硅膠中進(jìn)行干燥脫水無菌培養(yǎng)或硅膠中進(jìn)行干燥脫水-立即投入液氮立即投入液氮-快速化凍快速化凍-活性檢測(cè)?；钚詸z測(cè)。（3）包埋）包埋-玻璃化法：玻璃化法：綜合了璃化法和包埋脫水法的優(yōu)綜合了璃化法和包埋脫水法的優(yōu)點(diǎn)而建立的方法。區(qū)別是在脫水處理時(shí)用玻璃化溶液代替干點(diǎn)而建立的方法。區(qū)別是在脫水處理時(shí)用玻璃化溶液代替干燥過程，然后使包埋珠和玻璃化溶液一同進(jìn)入玻璃化。易于燥過程，然后使包埋珠和玻璃化溶液一同進(jìn)入玻璃化。易于操作，脫水時(shí)間短，能同時(shí)處理大量材料，存活率高。是莖操作，脫水時(shí)間短，能同時(shí)處理大量材料，存活率高。是莖尖分生組織保存的理想方法。尖分生組織保存的理想方法。 基本程序：基本程序：材料選擇材料選擇-預(yù)處理預(yù)處理