試驗室基本操作規(guī)范、規(guī)程、管理辦法

1、實驗室基本操作規(guī)范、規(guī)程為保證化驗工作質(zhì)量，保證人身及設(shè)備安全，規(guī)范化驗操作步驟，特制定本規(guī)程。一操作安全（1） 化驗室用電爐、酒精燈等熱源設(shè)備，操作人員一定要注意嚴防火災發(fā)生。（2） 化驗室用高壓滅菌設(shè)備等，操作人員一定要嚴格按規(guī)程操作，防止蒸汽灼傷。（3） 操作人員配制和使用強腐蝕性藥品時，必須做好相應的防護，嚴防人身傷害的發(fā)生。二環(huán)境和衛(wèi)生（一）基本要求1進入化驗室前必須換上專用拖鞋。2化驗室內(nèi)不得有蚊蠅。3化驗室要保持清潔、有序；各房間要定期打掃，消毒；物品要定點放置且擺放整齊。4活體微生物要及時處理，廢棄的平板要先洗完再滅菌。5化驗室人員要注意個人衛(wèi)生，勤洗衣服，勤洗澡，勤剪指甲等。

2、（二）無菌室使用要求1無菌室使用前須先關(guān)閉紫外燈管，打開風機，半小時后即可進行無菌操作。操作前要先用75%酒精棉球消毒手部、腕部等，對放在工作臺上的物品也要用棉球擦拭，然后嚴格按無菌要求進行操作，要盡量縮短操作時間。2使用完畢后，要將臺面清理干凈，關(guān)閉風機，再次將臺面用酒精棉球擦拭干凈，然后打開紫光燈離開。3無菌室應每周清掃一次，用來蘇水對地面及門窗進行擦拭，如必要時采用甲醛薰蒸法。三基本操作（1） 器皿的洗滌與包扎1新器皿因含有游離堿，先用1溢酸處理一夜，再用清水洗，也可用水煮0.5-1小時后，取由再用水清洗干凈。2常用玻璃儀器如三角瓶、培養(yǎng)皿、試管、漏斗、燒杯等，先用毛刷沾洗衣粉或肥皂粉刷

3、洗，然后用自來水沖洗干凈，放入70-80烘箱中烘干或自然晾干，放入清潔柜內(nèi)備用。檢查器皿的內(nèi)壁，若水均勻分布成一薄層而不由現(xiàn)水珠，說明油污已除凈，即可烘干備用。3用來做油鏡觀察的玻片，可以先用濾紙先把油污輕輕地擦去，然后放入肥皂水或洗衣粉水中浸泡，然后用清水沖洗，晾干備用，用時浸泡在75魅度酒精中。4移液管的使用一般先用水沖洗，再插入洗液中，浸泡數(shù)十分鐘后取由，用自來水沖洗干凈即可。5接種瓶使用時先用水沖洗，然后用洗衣粉刷洗干凈，再用清水沖洗，然后晾干；接種瓶口和膠管口用棉塞塞住，然后蓋以紗布、牛皮紙進行包扎，放入蒸柜中進行滅菌。（2） 高壓蒸汽鍋的使用方法1往滅菌鍋內(nèi)加水至高水位處；2將待滅

4、的物品放在滅菌鍋內(nèi)，物品之間留有適當?shù)膯栂叮岳羝臅惩ǎ?將滅菌物品最上方蓋幾層報紙，擰緊上蓋；4將電源打開，加熱至夾層水沸騰，蓋上夾層放氣閥，將干燥閥扭向消毒方向，至放氣閥排大氣3分鐘，關(guān)閉；繼續(xù)升溫至0.1Mpa壓力時，使壓力保持恒定，并開始計時；530分鐘后關(guān)閉電源，讓鍋自然降壓，待壓力完全降至“零”后打開上蓋，取由滅菌的物品；6滅菌鍋長時間不用，要放盡鍋內(nèi)水，以免日久腐蝕。（三）培養(yǎng)基的配制1根據(jù)配方計算由實驗中各種藥品所需的量，然后分別稱取；2將藥品倒入杯內(nèi)，加入少量的水進行加熱溶解，加熱過程中要不斷攪拌，待完全溶解后，補足水分到所需的體積；3用滴管逐滴加入5%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)P

5、H,邊攪拌邊用精密PH試紙測具PH,直到符合要求為止。4按實驗要求將培養(yǎng)基進行分裝，裝入試管中的量不宜超過總高度的1/5,裝入三角瓶的量以總體積的一半為限；在分裝過程中，應注意勿使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，以免弄濕棉塞造成污染。5培養(yǎng)基分裝好以后，在試管口或瓶口加上一只棉塞，一方面阻止外界微生物進入培養(yǎng)基內(nèi)而引起的污染，另一方面保證有良好的通氣性能，使微生物能不斷的從外界獲得無菌空氣。6棉塞塞好以后，在外面包上一層牛皮紙，以防止滅菌時冷水的沾濕和滅菌后的灰塵侵入，貼上標簽，注明培養(yǎng)基的名稱及配制日期。7一般情況下，培養(yǎng)基配好后應立即滅菌，如不及時滅菌，應放入冰箱內(nèi)保存。8滅菌后，固體培養(yǎng)基如需制成

6、斜面，應在未凝固前將試管口方擱置在一根長的玻棒或木條上即可。擱置的斜面要適當。(四)轉(zhuǎn)接操作1斜面接種(1)接種前在已滅菌的接種試管上貼上標簽，注明菌名，接種日期，標簽紙要貼在斜面的上方，距離試管口約2-3cm的位置，便于在接種時相核對。(2)點燃酒精燈，左手食指、中指和無名指分別夾上菌種和斜面(斜面向上)，使斜面近水平。先用右手將棉塞旋松，再拿接種環(huán)在火焰上燒紅，把有可能進入試管的其余部分也過火滅菌，用右手的無名指、小手指和手掌邊先后拔生菌種管和待接試管的棉塞，讓試管口緩緩過火，將灼燒過的接種環(huán)伸入菌種管，先使環(huán)接菌種管的培養(yǎng)基部分，使環(huán)冷卻，侍冷卻后輕輕沾取少量菌苔，然后將接種環(huán)移生菌和管

7、，在火焰旁將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管，從斜面培養(yǎng)基的底部向上做“z”形來回密集劃線。接好種的試管口再次過火，蓋緊棉塞，將接種環(huán)燒紅滅菌。(3)將接好種的斜面放在28c恒溫箱中培養(yǎng)。2試管斜面轉(zhuǎn)茄子瓶(1)先將試管和茄子瓶用75%酒精棉球消毒；(2)點燃酒精燈，以左手拿茄子瓶和試管(試管放在茄子瓶中部，試管口與茄子瓶對齊，姆指在上按住試管，其余四指托住茄子瓶)，將接種環(huán)通過火焰灼燒，以右手小指和手掌邊緣夾住茄子瓶，小指和無名指同時夾住試管棉塞，迅速在拔火焰旁去，然后將接種環(huán)緩緩伸入試管中，靠近試管壁或邊緣瓊脂冷卻一下，待接種環(huán)冷卻后，挑起菌苔，在火焰旁迅速伸入茄子瓶中由底向上做“z

8、”形劃線，盡量將茄子瓶斜面劃滿，退由接種環(huán)，將瓶口及棉塞再次過火并塞緊，最后將接種環(huán)燒紅滅菌。(3)一支試管一般接3-5個茄子瓶。3試管(茄子瓶)斜面轉(zhuǎn)搖瓶(1)將試管(茄子瓶)用75%酒精棉球擦拭干凈；(2)點燃酒精燈，一人先將接種環(huán)或金屬刮棒燒紅滅菌，然后用左手拿試管(茄子瓶)靠近火焰，右手拔去棉塞,置于無菌區(qū)；另外一人在火焰旁拔去裝無菌水或滅菌液體培養(yǎng)基的三角瓶棉塞，向試管(茄子瓶)內(nèi)倒入少許液體，塞上棉塞，將接種環(huán)在火焰旁伸入試管(茄子瓶)內(nèi)，用水冷卻一下，然后將斜面上的菌苔刮下，制成菌懸液，抽由接種環(huán)，用火焰滅菌。在無菌區(qū)拔去待轉(zhuǎn)接的三角瓶的棉塞，將菌懸液倒入三角瓶中，塞上棉塞，最后

9、置于搖床上培養(yǎng)。(3)一支試管一般轉(zhuǎn)一個三角瓶，一個茄子瓶一般可以轉(zhuǎn)接數(shù)個三角瓶。4搖瓶轉(zhuǎn)搖瓶(兩人操作)(1)將搖瓶用75%酒精棉球拭。（2）點燃酒精燈，先將菌液搖瓶搖晃幾下，注意不要蕩濕棉塞，然后一人左手傾斜拿起搖瓶，右手在火焰旁拔去棉塞，將瓶口過一下火焰。另一個人右手傾斜拿待轉(zhuǎn)接的搖瓶，左手在火焰旁拔去棉塞，迅速將菌液倒入待轉(zhuǎn)接的三角瓶中，瓶口盡量少沾菌液，瓶口和棉塞先過一下火焰，然后旋緊棉塞。（3）根據(jù)情況，一個搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)個搖瓶。5搖瓶菌液倒入接種瓶（兩人操作）（1）點燃酒精燈，一人左（右）手拿接種瓶，瓶身稍傾斜，另外一只手拿酒精燈，燈放在接種瓶口斜下方，將接種瓶口用火焰保護起來，拔去接

10、種瓶棉塞，另外一個人在酒精燈火焰旁拔去搖瓶棉塞，搖瓶口過一下火焰，然后將菌液倒入接種瓶內(nèi)，倒的時候盡量讓接種瓶口少沾菌液。（2）菌液倒好后，在火焰旁拿由滅菌的接種瓶瓶蓋，用火焰燒一下，迅速蓋在接種瓶上。四發(fā)醉液的取樣操作（1） 發(fā)醉液取樣瓶采用100ml三角瓶，棉，外包一層皮紙，0.1Mpa壓力滅菌30min后使用。（2） 取樣時按無菌操作要求，由發(fā)醉工人配合。五檢驗操作（一）草炭及成品含水量的測定稱取草炭成品30-40克（精確到0.01克）3份，放入到燒杯內(nèi)，置105干燥箱內(nèi)烘干4小時，冷卻后稱重，根據(jù)烘干前后重量差計算含水量，取3個樣品的平均值。計算公式：烘干前重量一烘干HO%=后重量一乂

11、100%烘干前重量（二）PH的測定1液體菌液用PH計或精密試紙直接測定。2成品及草炭需隨機稱取樣品8克，將樣品置于干凈燒杯內(nèi)，按1:2加入無離子水，浸泡振蕩均勻。預熱PH計,用標準溶液（PH6.86）校正儀器后，測定樣品懸液PH,邊測邊攪拌，儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄，每個樣品重復三次?；蛉〔糠秩芤河脼V紙過濾，直接用精密試紙進行測定。（3） 草炭細度的測定稱取草炭100克，放入杯內(nèi)，置105干燥箱內(nèi)烘干一小時，過孔徑0.18mm標準篩，稱重篩下部分的重量，具與樣品的重量之比，即為篩余物的含量。（四）革蘭氏染色1加一滴蒸錨水于載玻片上，再用接種環(huán)取少量菌苔與玻片上的水滴混合均勻，形成薄的菌膜。2涂片在空

12、氣中干燥，然后手持玻片一端，有菌膜的一面朝上，玻片在微火上通過幾次（用手指觸涂片反面，以不燙手為宜）。3冷卻后，將玻片置于玻片擱架上，加草酸鏤結(jié)晶紫染色液（加量以蓋滿菌膜為度），染色1-2分鐘，傾去染色液，用自來水沖洗，然后滴加路哥氏碘液，染12分鐘，水洗，再滴加95%乙醇溶液脫色2030秒，立即水洗，以終止脫色，再滴加番紅2-3分鐘，水洗，最后用吸水紙輕輕吸干。（五）血球計數(shù)板直接計數(shù)法1在正式計數(shù)前，先用顯微鏡檢查計數(shù)板的計數(shù)室，看其是否沾有雜質(zhì)或干涸著的菌體，若有污漬則需作清洗。先用95%酒精棉球輕輕擦洗計數(shù)室的計數(shù)室，再用蒸錨水沖洗計數(shù)板，并用濾紙吸干其上的水分，最后用擦鏡紙擦干凈，然

13、后進行鏡檢，直至計數(shù)室無污漬時才可用于計數(shù)，否則仍需重復能上操作。2將待測菌液振蕩混勻，取蓋玻片安放在放在計數(shù)室上面，然后用接種環(huán)挑一環(huán)均勻的菌懸液，使它沿著蓋玻片和計數(shù)板間的縫隙滲入計數(shù)室，連續(xù)二至三次，直至充滿計數(shù)室平臺為止，用濾紙吸干周圍的水份，靜置45分鐘。3將加好菌懸液的計數(shù)板置于顯微鏡載物臺的中央，先在低倍鏡下尋找計數(shù)室上的大方格，尋找時顯微鏡的光圈要適當縮小，使視野偏暗，然后順著大方格線移動計數(shù)板，使計數(shù)室位于視野中間，轉(zhuǎn)至高倍鏡，適當調(diào)節(jié)光亮度，使菌體和計數(shù)室線條均清晰為止，然后將計數(shù)室一角的中格移至視野中。4通常以計五個中格的菌數(shù)來代表計數(shù)室的含菌量，將所要計數(shù)的中格中的菌計總數(shù)，為了避免重復和遺漏，將分布在方格線上的菌一律以接觸方格底線和右側(cè)線上的菌計入格內(nèi)。菌數(shù)1ml=50000x五個中格的總菌數(shù)x稀釋倍數(shù)5計數(shù)完畢后，計數(shù)板先用95%酒精輕輕擦洗，再用蒸錨水淋洗，然后用濾紙吸干，最后用擦鏡紙擦干凈，放入盒內(nèi)。（六）活菌計數(shù)法1倒平板：將所檢測菌的固體培基倒入6個無菌培養(yǎng)皿內(nèi)編號為10-5、106-每個稀釋度三套。2稀釋：取10克樣品放入帶玻珠的100ml無菌水中，振蕩20min,靜置20min,編號為101。用5ml滅菌吸管吸5ml菌懸液放入45ml無菌水中混勻振蕩，編號為1