微生物檢驗技術(shù)

1、1食品微生物學(xué)檢驗技術(shù)劉曉慶劉曉慶2微生物試驗方法微生物試驗方法 取樣 培養(yǎng)基制備 滅菌和消毒 無菌操作 培養(yǎng)、計數(shù) 飲料微生物檢測方法 國標(biāo)：菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌、大腸菌群、致病菌 企標(biāo)要求 常見問題處理3取樣取樣 準(zhǔn)備工作取樣工具：消毒，滅菌消毒，滅菌樣品存放容器：清潔、干燥清潔、干燥取樣標(biāo)簽 取樣注意問題采樣均勻避免污染標(biāo)記準(zhǔn)確、牢固及時保存若不及時檢測應(yīng)保存在4冰箱，最長不超過24h。4培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備 玻璃器皿的清洗 新購的玻璃器皿 將器皿放入鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時，以除去游離的堿性物質(zhì)，最后用流水沖凈。 常用舊玻璃器皿的洗滌 確實無病原菌或未被帶菌物污染的器皿，使用前后，可按常

2、規(guī)用洗滌劑進(jìn)行刷洗；帶菌玻璃器皿的洗滌 凡實驗室用過的菌種以及帶有活菌的各種玻璃器皿，必須經(jīng)過高溫滅菌或消毒后才能進(jìn)行刷洗。5培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備為滿足微生物生長和代謝的需要，培養(yǎng)基必須包含碳源、氮源、水、無機鹽、能源和生長因子碳源、氮源、水、無機鹽、能源和生長因子六大類營養(yǎng)物質(zhì)。購買：選擇質(zhì)量好的培養(yǎng)基，注意保質(zhì)期，記錄收貨期。貯存：30以下，避光避光保存于陰涼干燥陰涼干燥處，使用后，擰緊瓶蓋，避免吸潮、氧化或污染。保質(zhì)期：一般未開封的培養(yǎng)基可保質(zhì)年，已開封的可保質(zhì)半年。建議在瓶體注明開封日期在瓶體注明開封日期。對于個別極易變質(zhì)的品種，建議冷藏冷藏保存，可延長保質(zhì)期。6培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備培

3、養(yǎng)基分類根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來根據(jù)對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來區(qū)分：區(qū)分：天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 是利用各種動、植物或微生物的原料，成分難以確切知道。主要原料有：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)定性常受生產(chǎn)廠或批號等因素的影響。合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成?；瘜W(xué)成分精確、重復(fù)性強，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。半合成培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基 在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)

4、藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐和實驗室中使用最多。7培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基分類根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分：根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分：液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實際中用得十分廣泛。半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基 如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.2-1%之間

5、。這種培養(yǎng)基有時可用來觀察微生物的動力，有時用來保藏菌種。8培養(yǎng)基分類根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分：根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分：選擇培養(yǎng)基：選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)以殺死或抑制不需要的菌種生長的培養(yǎng)基。如鏈霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生長；而制霉菌素、灰黃霉素等能抑制真核微生物的生長；結(jié)晶紫能抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長等。增殖培養(yǎng)基：增殖培養(yǎng)基：常用于菌種篩選和選擇增菌中。在某種程度上在某種程度上講，增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基。講，增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基。培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備9 培養(yǎng)基分類根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分：根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分：鑒別培養(yǎng)基：鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化

6、學(xué)藥品，使難以區(qū)分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后呈現(xiàn)出明顯差別，因而有助于快速鑒別某種微生物。例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸道致病菌的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基。有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。例如食品檢驗中常用的麥康凱培養(yǎng)基是一例。它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌以外的細(xì)菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能幫助區(qū)別乳糖發(fā)酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門氏菌和志賀氏菌）。培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備10培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備 影響因素洗滌劑中含有表面活性劑，會影響微生物生長，注意沖洗干凈。一般不采用自來水配制培養(yǎng)基，因為自來水相對雜質(zhì)較多，有些含有較多的Ca2+、

7、Mg2+離子，可與蛋白胨、肉浸汁中的磷酸鹽生成磷酸鈣、磷酸鎂，一旦高壓滅菌后，就會析出沉淀，從而影響到培養(yǎng)基的透明度，不利于微生物的培養(yǎng)與觀察。蒸餾水或純凈水中所含的雜質(zhì)較少，所制成的培養(yǎng)基透明度高，有利于觀察。11培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備 制備：準(zhǔn)確稱取各組分，一次完成，不要中斷；混合后，煮沸或者熱水溶化，充分溶解；分裝，裝量2/3容積 滅菌，高壓滅菌的溫度與時間隨培養(yǎng)基的種類不同而有所差別。含糖類物質(zhì)培養(yǎng)基（如乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基）則滅菌溫度不能過高，以免糖類物質(zhì)被破壞，影響培養(yǎng)微生物的觀察效果。 滅菌后用不完的培養(yǎng)基4以下存放 含瓊脂培養(yǎng)基：含瓊脂培養(yǎng)基：控制水浴溫度，水浴時間不宜超過4h；若

8、在4h內(nèi)不能及時使用，應(yīng)迅速冷卻，使其凝固，使用前再進(jìn)行復(fù)溶。但不可多次復(fù)溶，否則會影響培養(yǎng)基的pH值，并導(dǎo)致凝膠強度下降。加水時避免干粉掛壁粘底，加熱時避免燒糊。加水時避免干粉掛壁粘底，加熱時避免燒糊。除個別特殊品種含有不溶成分外，應(yīng)澄清，無絮狀物，無沉淀。除個別特殊品種含有不溶成分外，應(yīng)澄清，無絮狀物，無沉淀。12培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基制備 注意事項培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長;因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降pH0.2，而腸浸液pH卻會有顯著

9、的升高。培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)選擇適當(dāng)容器:液體分裝至試管1/4左右為宜；如固體則分裝量為管高的1/5；半固體培養(yǎng)基，則分裝至試管的1/2-1/3為宜；錐形瓶分裝培養(yǎng)基時，容量應(yīng)不超過容積的2/3為宜；9cm的培養(yǎng)皿一般可倒入15ml培養(yǎng)基。一般培養(yǎng)基可采用121高壓蒸汽滅菌20分鐘的方法。在各種培養(yǎng)基制備方法中，如無特殊規(guī)定，即可用此法滅菌。某些畏熱成分，如糖類、明膠培養(yǎng)基應(yīng)采用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取和加入經(jīng)冷卻約50C左右的培養(yǎng)基中。 含糖培養(yǎng)基：含糖培養(yǎng)基：115115滅菌滅菌10min10min或或113113滅菌滅菌15min15min 無糖培養(yǎng)基：無糖培

10、養(yǎng)基：121121滅菌滅菌20min20min13滅菌和消毒滅菌和消毒紫外線照射：用于空氣、物體表面消毒。紫外線的波長范圍是136400nm，波長200300nm的紫外線對微生物有致死效應(yīng)。紫外線最強殺菌作用的波長為265266nm，這是核酸的最大吸收波長。實驗室用的紫外線殺菌燈的波長為253.7nm。 注意：注意：穿透能力極差，不能穿透一張厚紙。故不能用于液體飲料的消毒。75%酒精：乙醇的殺菌力受濃度影響，并不是濃度越高殺菌力越好，75%的乙醇?xì)⒕ψ顝?，超過此濃度至無水乙醇的效果差，因為高濃度時可使菌體迅速脫水，表面蛋白凝固，形成了保護(hù)膜，阻止了乙醇分子進(jìn)入菌體，會影響殺菌作用。14滅菌和

11、消毒滅菌和消毒溫度 ：利用溫度進(jìn)行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，低溫通常起抑菌作用。灼燒滅菌法：灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品等的滅菌。干熱空氣滅菌法：干熱空氣滅菌法：實驗室常用方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘箱中，升溫至160-170，恒溫1-2h即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。15滅菌和消毒滅菌和消毒 濕熱滅菌法:在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好，這是因為一方面細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含水量高

12、，容易變性。另一方面高溫水蒸汽對蛋白質(zhì)有高度的穿透力，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。煮沸消毒法：煮沸消毒法：10023h,芽孢死亡。1001020min，營養(yǎng)體死亡。在清水中加入1%碳酸鈉或2%的石炭酸，效果更好。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。間歇滅菌法：間歇滅菌法：常壓蒸汽滅菌，1003060min，連續(xù)3次，間隔培養(yǎng)（2837）24h。適合于不宜高壓蒸汽滅菌的物品，可殺滅芽孢。此法不需加壓滅菌鍋，適于推廣，但操作麻煩，所需時間長。高壓蒸汽滅菌：高壓蒸汽滅菌：利用壓力的增加，達(dá)到溫度升高的目的。12120min，效果最好。用于液體培養(yǎng)基，無菌水等滅菌。體積大，傳熱性差的物品，滅菌時

13、間應(yīng)適當(dāng)延長。適用于一般培養(yǎng)基、玻璃器皿、無菌水、金屬用具。16滅菌和消毒滅菌和消毒 要滅菌后的器皿仍保持無菌狀態(tài)，需在滅菌前進(jìn)行包扎。 培養(yǎng)皿：培養(yǎng)皿：洗凈的培養(yǎng)皿烘干后每10套（或根據(jù)需要而定）疊在一起，用牢固的紙卷成一筒，或裝入特制的鐵桶中，然后進(jìn)行滅菌。吸管：吸管：每根獨立包好后，再放進(jìn)去高壓鍋滅菌；如果是放在不銹鋼的筒子里面的話，可以不用獨立包，但是取的時候一定要注意不要污染其他的移液管； 試管和三角瓶：試管和三角瓶：試管和三角瓶都需要做合適的棉塞，棉塞可起過濾作用，避免空氣中的微生物進(jìn)入容器。制作棉塞時，要求棉花緊貼玻璃壁，沒有皺紋和縫隙，松緊適宜。過緊易擠破管口和不易塞入；過松易

14、掉落和污染。棉塞的長度不小于管口直徑的2倍，約2/3塞進(jìn)管口。 玻璃器皿：玻璃器皿：包好后擺入電熱烘箱進(jìn)行干滅時，相互間要留有一定的空隙，以便空氣流通。滅好后待烘箱內(nèi)溫度自然降溫到60以下后，再開門取出玻璃器皿，避免由于溫度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。 17滅菌和消毒滅菌和消毒高壓蒸汽滅菌操作流程高壓蒸汽滅菌操作流程關(guān)好排水閥門，放入純凈水或蒸餾水至標(biāo)度。關(guān)好排水閥門，放入純凈水或蒸餾水至標(biāo)度。注意水量一定要加足，否則容易造成事故。將須要滅菌的器材、培養(yǎng)基等裝入滅菌鍋中，加蓋密封。將須要滅菌的器材、培養(yǎng)基等裝入滅菌鍋中，加蓋密封。同時旋緊相對的兩個螺旋，以達(dá)到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達(dá)不到徹

15、底滅菌的目的。 通電加溫，打開排氣活門，排盡鍋內(nèi)的空氣。通電加溫，打開排氣活門，排盡鍋內(nèi)的空氣。通常當(dāng)壓力表指針升至5 5磅或磅或0.05MPa0.05MPa時，打開排氣活門放氣時，打開排氣活門放氣，待壓力表指針降至零點一小段時間后，再關(guān)閉活門。即活門沖出的全部是蒸汽時則表示徹底。恒溫滅菌恒溫滅菌: 0.1MPa : 0.1MPa 或或1515磅壓力保持磅壓力保持20203030分鐘。分鐘。降溫：自然降溫或打開活門排汽降溫。注意勿使排氣過快，一般從排氣到降溫：自然降溫或打開活門排汽降溫。注意勿使排氣過快，一般從排氣到打開鍋蓋以打開鍋蓋以1010分鐘左右為好。分鐘左右為好。當(dāng)鍋內(nèi)蒸汽完全排盡時即

16、壓力表指針降到零時，要立即打開鍋蓋。當(dāng)鍋內(nèi)蒸汽完全排盡時即壓力表指針降到零時，要立即打開鍋蓋。取出滅菌物品：當(dāng)鍋內(nèi)溫度下降到取出滅菌物品：當(dāng)鍋內(nèi)溫度下降到6060左右時取器材或培養(yǎng)基。左右時取器材或培養(yǎng)基。長時間不用時，應(yīng)將高壓滅菌器內(nèi)的剩余水排出。長時間不用時，應(yīng)將高壓滅菌器內(nèi)的剩余水排出。驗證滅菌效果驗證滅菌效果。把滅菌培養(yǎng)基放入。把滅菌培養(yǎng)基放入2525溫箱中，培養(yǎng)溫箱中，培養(yǎng)4848小時觀察滅菌效果。小時觀察滅菌效果。 48小時后不見雜菌生出，便證明培養(yǎng)基已達(dá)到滅菌目的，可以使用。18高壓蒸汽滅菌注意事項高壓蒸汽滅菌注意事項 滅菌時要排凈高壓鍋中的空氣?？諝獠慌艃簦瑝毫_(dá)到預(yù)定值時，溫

17、度仍為100。 為了避免培養(yǎng)基營養(yǎng)成分受到破壞，在滅菌的過程中應(yīng)嚴(yán)格把握滅菌的溫度與時間，不能隨意地提高滅菌的溫度或延長滅菌時間。 由于高壓滅菌會導(dǎo)致培養(yǎng)基的體積和濃度有所變化，在配制培養(yǎng)基時，每100mL培養(yǎng)基可適量增加5mL左右的蒸餾水。 預(yù)防培養(yǎng)基在加熱溶解、滅菌煮沸等過程中導(dǎo)致水分揮發(fā)、損失而使培養(yǎng)基的濃度過大或體積減少。19無菌操作無菌操作 GLP（良好實驗室規(guī)范） 工作區(qū)域緩沖間不是儲藏室；無菌操作室、超凈臺禁止存放堆積雜物；緩沖間和無菌室的門錯開開啟，減少外界空氣侵入；紫外燈消毒臺面、地面，不能同時開啟鼓風(fēng)；門窗關(guān)閉，避免揚塵；用75%乙醇消毒臺面；使用霉菌的操作臺最好是專用，防

18、止污染的操作。超凈工作臺要滿足的條件：每周一次做空氣沉降菌實驗，應(yīng)滿足細(xì)菌2個/平皿/30min，霉菌、酵母菌：0個/平皿/30min。20無菌操作無菌操作 人員進(jìn)入無菌室換專用的實驗服、帽、鞋，戴好口罩熱水皂液洗手；75%乙醇消毒手和手臂 操作靠近火焰上半球操作所有器具接觸培養(yǎng)物的部分必須無菌注意避免微生物污染21培培養(yǎng)養(yǎng) 倒置培養(yǎng) 適當(dāng)?shù)臏囟?細(xì)菌：36 霉菌、酵母：28 大腸菌群：36注意：培養(yǎng)箱的溫度校正 保持一定的濕度 培養(yǎng)箱中置一杯水 定時查看，并做記錄22計計數(shù)數(shù) 計數(shù)場所潔凈，明亮保持培養(yǎng)皿的底部清潔 可借助放大鏡觀察 有霉菌生長的平皿不可打開皿蓋 每塊平皿上最佳數(shù)量為3030

19、0若無菌生長，則記錄為300，則可估讀數(shù)23飲料微生物檢測方法飲料微生物檢測方法 膜過濾法 標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法 棉拭法 顯微直接計數(shù)法 食品衛(wèi)生微生物檢驗國標(biāo) 嗜酸耐熱菌檢測 致病菌檢測 企標(biāo)要求24膜過濾法膜過濾法 使用范圍：可以過濾的樣品樣品含菌量相對較少，一般300cfu/ml 優(yōu)點：可富集微生物，更靈敏。 過濾設(shè)備消毒滅菌：121，15min 一次性無菌濾膜（直徑47mm）0.45m：細(xì)菌總數(shù)和大腸桿菌0.8m： 霉菌和酵母25膜過濾法膜過濾法 抽濾系統(tǒng)真空泵緩沖瓶集液瓶三聯(lián)（六聯(lián)）抽濾器 抽濾液體抽完后，空抽時間不超過30秒可用20ml水沖洗，不可用洗瓶沖。 培養(yǎng)在吸收墊上培養(yǎng)在瓊脂平板

20、上 計數(shù)直接顯微計數(shù)培養(yǎng)后計數(shù)26標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法 適用范圍：難過濾的樣品，濾過體積2ml，如含果肉的果汁和果汁飲料 空白對照每一系列的測試至少需1個對照 培養(yǎng)基準(zhǔn)備在沸水中融化，置472 水浴中 步驟在無菌培養(yǎng)皿中加1ml樣品在培養(yǎng)皿中倒入15-20ml培養(yǎng)基，注意：瓶口不要觸及皿蓋小心混勻樣品和培養(yǎng)基水平放置凝固后，倒置培養(yǎng)計數(shù)27顯微直接計數(shù)法顯微直接計數(shù)法 無需培養(yǎng)，最快的分析方法用于糖的微生物評估 計數(shù)結(jié)果偏高不分死活細(xì)胞，均被計數(shù)食品顆粒與細(xì)胞不易區(qū)分 步驟確定膜過濾面積和視野面積樣品溶液準(zhǔn)備過濾樣品染色鏡檢計數(shù)28棉棉拭拭法法無法使用平板接觸法的表面柔軟、不平整、不規(guī)

21、則的表面材料無菌棉簽無菌水不平整步驟選擇采樣點，并作記錄在試管上作相應(yīng)的記錄取出無菌棉簽，在無菌水中浸濕在待檢表面擦拭，并注意擦拭孔縫擦拭完畢放回?zé)o菌管中，蓋好塞子采用膜過濾法或平板法分析，在一小時內(nèi)完成。29快速微生物檢測法快速微生物檢測法 ATP分析系統(tǒng)ATP生物熒光檢測計數(shù)法 直接熒光膜技術(shù)30關(guān)于飲料的檢驗關(guān)于飲料的檢驗 GB/T4789.21-2003 冷凍飲品、飲料檢驗采樣：果蔬汁飲料、碳酸飲料、茶飲料和固體飲料：應(yīng)采取原瓶、袋和盒裝樣品。樣品采取后應(yīng)立即送檢，如不能立即檢驗，應(yīng)置冰箱保存。處理：對于瓶裝飲料，用點燃的酒精棉球燒灼瓶口滅菌，用石碳酸紗布蓋好；塑料瓶口可用75%酒精棉

22、球擦拭滅菌，用滅菌開瓶器將蓋啟開；含有二氧化碳的飲料可倒入另一滅菌容器內(nèi)，口勿蓋緊，覆蓋一滅菌紗布，輕輕振蕩，待氣體全部逸出后，進(jìn)行檢驗。檢測：菌落總數(shù)、大腸菌群、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母計數(shù)，均按照GB/T 4789 執(zhí)行；乳酸菌檢驗按照GB/T16347執(zhí)行。31食品衛(wèi)生微生物檢驗國標(biāo)食品衛(wèi)生微生物檢驗國標(biāo)GB 4789-2010 菌落總數(shù)測定 霉菌和酵母菌計數(shù) 大腸菌群計數(shù)32菌落總數(shù)測定菌落總數(shù)測定GB 4789.2-2010磷酸鹽緩沖液或生理鹽水吸管尖端不要觸及瓶口或試管口外部，也不得觸及管內(nèi)稀釋液。吸管插入檢樣液內(nèi)取樣稀釋時，插入深度要達(dá)2.5cm以上,調(diào)整時

23、應(yīng)使管尖與容器內(nèi)壁緊貼。進(jìn)行稀釋時，應(yīng)使吸管內(nèi)的液體沿管壁小心流加入，以免增加檢液。每遞增稀釋一次，即換用一支1ml滅菌吸管。混勻時可先順時針旋轉(zhuǎn)，再逆時針旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)中應(yīng)防止混合物濺到平皿壁和皿蓋上。檢樣過程中應(yīng)用稀釋液做空白對照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿和吸管是否被污染。檢樣過程中應(yīng)在工作臺內(nèi)打開一塊空白PCA（其暴露時間應(yīng)與檢樣時間相當(dāng)），以了解樣品在檢驗操作過程中有無受到來自環(huán)境的污染。檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿，所用時間不宜超過20min。 如果把不能立即計數(shù)，要將平板放入04冰箱中，但不能超過24 h。33菌落總數(shù)計數(shù)方法菌落總數(shù)計數(shù)方法若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜

24、計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值。若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)。若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則對稀釋度最低的平均菌落數(shù)進(jìn)行計數(shù)。若所有稀釋度平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。34菌落總數(shù)計數(shù)方法菌落總數(shù)計數(shù)方法若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30-300CFU之間，則以最接近30或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。當(dāng)有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍之內(nèi)時，計算公式為：N樣品中菌落數(shù)；C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；N1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；N2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個

25、數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。35霉菌和酵母菌計數(shù)霉菌和酵母菌計數(shù)GB 4789.15-2010稀釋液為稀釋液為無菌水無菌水36霉菌和酵母菌的計數(shù)霉菌和酵母菌的計數(shù) 選取菌落數(shù)在10-150CFU的平板進(jìn)行計數(shù)。計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計算。 若所有平板上菌落數(shù)均大于150CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)。 若所有平板上菌落數(shù)均小于10CFU，則對稀釋度最低的平板計數(shù)。 若所有稀釋度平板均無生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。若為原液，則以小于1計數(shù)。 報告時以CFU/g或CFU/mL為單位分別報告霉菌和酵母菌數(shù)。37注意：注意： 霉菌次生菌對檢驗結(jié)果的影響霉菌次生

26、菌對檢驗結(jié)果的影響 霉菌是絲狀真菌的俗稱，意即“發(fā)霉的真菌”，霉菌有著極強的繁殖能力，霉菌主要依靠產(chǎn)生形形色色的無性或有性孢子進(jìn)行繁殖。孢子有點像植物的種子，不過數(shù)量特別多，特別小。 霉菌孢子多聚積成團(tuán)。在吸取各稀釋度的樣液時，需要充分振搖或用吸管反復(fù)吹打，使孢子團(tuán)分散開，并均勻混懸。 霉菌在適宜條件下生長迅速，先成熟的孢子落在培養(yǎng)皿上又可萌發(fā)長成新菌落，因此在培養(yǎng)的過程中觀察，不要反復(fù)翻轉(zhuǎn)平板，以免有次生菌形成而影響菌落計數(shù)的準(zhǔn)確性。38大腸菌群計數(shù)大腸菌群計數(shù)GB 4789.3-2010 大腸菌群指一群37、24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源

27、于人畜糞便，以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量。 大腸菌群不是細(xì)菌學(xué)上分類命名，而是根據(jù)衛(wèi)生學(xué)方面的需要設(shè)定的一類與糞便污染有關(guān)的一組細(xì)菌。 大腸菌群中以埃希氏菌屬為主，稱為典型大腸桿菌，是革蘭陰性無芽孢桿菌，能在選擇性培養(yǎng)基上產(chǎn)生典型菌落。39大腸菌群大腸菌群MPN法法GB 4789.3-201040MPN法注意事項法注意事項 初發(fā)酵和證實試驗：初發(fā)酵和證實試驗所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。初發(fā)酵陽性管，并不確定就是大腸菌群陽性，經(jīng)證實試驗后可能成為陰性。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。 產(chǎn)氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵試驗中，有

28、時小倒管內(nèi)會有極微小的氣泡，有時可以看到經(jīng)初發(fā)酵培養(yǎng)后沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。可輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生。在實際工作中，有時遇到初發(fā)酵時產(chǎn)酸，但導(dǎo)管內(nèi)無氣泡產(chǎn)生，復(fù)發(fā)酵卻證實為大腸菌群陽性。有時導(dǎo)管內(nèi)無氣體，但在液面及管壁卻可看到小氣泡。導(dǎo)管管口的完整情況與導(dǎo)管外有無沉渣存在均可影響產(chǎn)氣反應(yīng)的觀察，管口不完整性有利于氣體進(jìn)入導(dǎo)管，管口周圍有沉渣能阻礙或延緩氣體進(jìn)入。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用其他稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。41滅菌后小導(dǎo)管內(nèi)留有氣泡的原因分析及其解決辦法滅菌后小導(dǎo)管內(nèi)留有氣泡的原因分析及其解決辦法 *原因一：過早打開滅菌

29、鍋分析：分析：當(dāng)滅菌鍋壓力表示數(shù)為0，而溫度還高于室溫時，不要打開滅菌鍋。因為打開鍋蓋瞬間，鍋內(nèi)大量熱量散出，溫度突然降低，試管內(nèi)溫度也隨著降低，導(dǎo)致管內(nèi)氣減小，沸點降低，部分水會汽化留在小導(dǎo)管內(nèi)。解決辦法：解決辦法：等滅菌鍋內(nèi)氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時再打開滅菌鍋。 *原因二：試管塞塞得太緊（使用硅膠塞的時候）分析：分析：試管塞塞得太緊在滅菌時會導(dǎo)致試管內(nèi)與滅菌鍋內(nèi)壓力不一致。在滅菌鍋升溫升壓時，鍋內(nèi)壓力會大于管內(nèi)壓力；滅菌鍋降溫降壓時，鍋內(nèi)壓力小于管內(nèi)壓力。鍋內(nèi)壓力會大于管內(nèi)壓力時，試管內(nèi)壓力不夠，不能將小導(dǎo)管內(nèi)氣體排盡，就留有氣泡；鍋內(nèi)壓力小于管內(nèi)壓力時，可能會使試管塞和培養(yǎng)

30、基崩出，培養(yǎng)基報廢。解決辦法：解決辦法：改用透氣性好的棉花塞，或使用質(zhì)量好些的橡皮塞，切勿塞太緊。42滅菌后小導(dǎo)管內(nèi)留有氣泡的原因分析及其解決辦法滅菌后小導(dǎo)管內(nèi)留有氣泡的原因分析及其解決辦法 原因三：小導(dǎo)管口太小 分析：分析：小導(dǎo)管在加壓后一方面水要進(jìn)去，另外里面的空氣要出來，如果口太小的話，空氣不容易出去，水也不容易進(jìn)來，就會導(dǎo)致氣泡留在里面了。 解決辦法：解決辦法：改用內(nèi)空較大的導(dǎo)管，盡量使用V型管，不要使用錐型管。 原因四：培養(yǎng)基質(zhì)量引起分析：分析：由培養(yǎng)基質(zhì)量引起的氣體不能排盡或培養(yǎng)基含有高溫高壓分解產(chǎn)氣的成分。滅菌時用水做培養(yǎng)基組的對照試驗，若培養(yǎng)基組有氣泡，而對照組沒有氣泡，可確定

31、是有此原因引起。解決辦法：解決辦法：改用其它培養(yǎng)基。 原因五：滅菌鍋工作壓力不夠，使氣體不能排盡分析：分析：滅菌鍋最大壓力不夠不能使管內(nèi)液體強行把氣體擠出，最后還留有小氣泡，還會使溫度上升緩慢，或達(dá)不到滅菌溫度。此原因的可能性較小，我們可以在排除原因一、二、三、四的情況下，用不加試管塞、大口導(dǎo)管做試驗，若還仍不能達(dá)到效果，就要檢查滅菌鍋了。解決辦法：解決辦法：修理滅菌鍋。 43大腸菌群大腸菌群平板計數(shù)法平板計數(shù)法GB 4789.3-201044平板計數(shù)法注意問題平板計數(shù)法注意問題 全稱：結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂，煮沸滅菌，臨用前制備。 覆蓋培養(yǎng)基的作用：防止菌落蔓延生長 計數(shù)范圍：15-150 證

32、實試驗：從VRBA上挑取10個不同類型典型和可疑菌落接入BGLB肉湯中，培養(yǎng)2448h，觀察產(chǎn)氣情況，凡產(chǎn)氣管者即報大腸菌群陽性。 結(jié)果報告：如10-4稀釋液1mL，在VRBA上長出100個典型和可疑菌落，挑取的10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則大腸菌群數(shù)為1006/10104=6.0105CFU/g（mL）45注意：大腸菌群的注意：大腸菌群的假陰性現(xiàn)象假陰性現(xiàn)象 在接種發(fā)酵管時注意，要沿管壁緩慢加入，防止培養(yǎng)基中倒置的小管里沖入氣泡，造成產(chǎn)氣的假象。 從平板上菌落特征不典型時應(yīng)多挑幾個可疑菌落進(jìn)行染色，以避免出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。 大腸埃希氏菌典型菌落是呈紫紅色、圓形、邊緣整齊、表面光

33、滑、濕潤、常具有金屬光澤， 菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)， 菌落直徑為0.5mm或更大。46嗜酸耐熱菌檢測嗜酸耐熱菌檢測 在pH值較低時，嗜酸耐熱菌可以形成具有耐熱性的芽胞，果汁生產(chǎn)中常用的巴氏殺菌難以將其殺滅。 芽胞以休眠的形式存活果汁中，當(dāng)果汁復(fù)水后，適宜的條件會使芽胞萌發(fā)，生長，從而導(dǎo)致果汁產(chǎn)品香氣損失、口感變差、濁度升高、形成沉淀。 值得注意的是，嗜酸耐熱菌存在并不一定使產(chǎn)品變質(zhì)，未變質(zhì)的果汁中也能檢測到該菌，變質(zhì)只在適當(dāng)條件下發(fā)生，一般會引起果汁香味損失及輕微渾濁。 47嗜酸耐熱菌檢測嗜酸耐熱菌檢測培養(yǎng)基：酵母粉或酵母浸膏1.25g，蛋白胨2.50g，瓊脂粉6.50g，葡萄糖0.5g，

34、吐溫80 0.5mL，500mL去離子水，121滅菌20min；10%蘋果酸溶液，0.45m濾膜過濾后，121滅菌5min，用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值；當(dāng)培養(yǎng)基冷卻到50時，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值到3.70.1。傾倒培養(yǎng)基，每瓶15-20mL；將樣品（濃縮汁10mL，果汁產(chǎn)品100mL）放在801水浴鍋中保溫，當(dāng)樣品溫度達(dá)到80時，開始計時，10min，以殺滅樣品中其它不耐熱菌。冷卻后，將樣品加入到90mL無菌生理鹽水中，混勻后用0.45m濾膜過濾，將濾膜貼在提前倒好的培養(yǎng)基上；43-45倒置培養(yǎng)4天以CFU/10mL或CFU/100mL形式報告。48致病菌檢測致病菌檢測 沙門氏菌 GB/T 4789

35、.5-2003 金黃色葡萄球菌 GB 4789.10-2010 志賀氏菌 GB 4789.3-2010 49企標(biāo)要求企標(biāo)要求成品控制手冊（HY/B3.PB0013-2009）表表1水微生物指標(biāo)及檢驗要求水微生物指標(biāo)及檢驗要求產(chǎn)品產(chǎn)品項目項目指標(biāo)指標(biāo)檢驗頻次檢驗頻次原水、原水、RORO水水菌落總數(shù)，cfu/mL100每周1次霉菌酵母，cfu/mL5每周1次大腸菌群，MPN/100mL3每周1次瓶（桶）瓶（桶）裝純凈水裝純凈水菌落總數(shù)，cfu/mL20每小時1次霉菌酵母，cfu/mL不得檢出每小時1次大腸菌群，MPN/100mL3每班1次50企標(biāo)要求企標(biāo)要求成品控制手冊（HY/B3.PB0013-

36、2009） 表表2飲料類成品微生物指標(biāo)及檢驗要求飲料類成品微生物指標(biāo)及檢驗要求產(chǎn)品產(chǎn)品項目項目指標(biāo)指標(biāo)檢驗頻次檢驗頻次檢驗方法檢驗方法料液料液* *菌落總數(shù)，cfu/mL50001次/周期GB 4789.2-2010霉菌酵母，cfu/mL301次/周期GB 4789.15-2010飲料類飲料類 成品成品菌落總數(shù)，cfu/mL51次/小時GB 4789.2-2010霉菌酵母，cfu/mL11次/小時GB 4789.15-2010大腸菌群，MPN/100mL31次/班GB 4789.3-2010注：料液取每周期最后一罐料液進(jìn)行檢測51企標(biāo)要求企標(biāo)要求成品控制手冊（HY/B3.PB0013-2009） 表表3環(huán)境衛(wèi)生控制指標(biāo)環(huán)境衛(wèi)生控制指標(biāo)控制項目控制項目 控制點控制點檢測項目檢測項目指標(biāo)指標(biāo)檢驗頻次檢驗頻次衛(wèi)生控制衛(wèi)生控制人員衛(wèi)生大腸桿菌陰性1次/周車間環(huán)境菌落總數(shù)，cfu/平皿501次/周霉酵總數(shù)，cfu/平皿301次/周正壓房菌落總數(shù)，cfu/平皿31次/周霉酵總數(shù)，cfu/平皿31次/周飲料類成飲料類成品品無菌蓋菌落總數(shù)01次/周期霉酵總數(shù)01次/周期無菌瓶菌落