生物學(xué)基因轉(zhuǎn)錄實用教案

1、第1頁/共86頁第一頁，共86頁。The synthesis of RNA molecules using DNA strands as the templates so that the genetic information can be transferred from DNA to RNA.Transcription第2頁/共86頁第二頁，共86頁。轉(zhuǎn)錄(zhun l)泡 轉(zhuǎn)錄(zhun l)單位轉(zhuǎn)錄(zhun l)后加工 內(nèi)含子 外顯子 Transcription unitTranscription bubblePost-transcriptional modificationInt

2、ronExon第3頁/共86頁第三頁，共86頁。核酶 RNA剪接(jinji) 逆轉(zhuǎn)錄 斷裂基因套索RNARNA splicingReverse transcriptionRibozymeSplite geneLariat RNA第4頁/共86頁第四頁，共86頁。第5頁/共86頁第五頁，共86頁。l 負(fù)責(zé)核苷酸鏈延長的分子?l 鏈延伸的方向?l 模板閱讀原則?l RNA合成局部的結(jié)構(gòu)(jigu)特征? l 模板的結(jié)構(gòu)(jigu)需求?第6頁/共86頁第六頁，共86頁。RNA-pol核心核心(hxn)酶酶DNA RNA第7頁/共86頁第七頁，共86頁。u 核心核心(hxn)酶負(fù)責(zé)反應(yīng)催化酶負(fù)責(zé)反

3、應(yīng)催化u 原核原核亞基解離亞基解離u 真核真核CTD磷酸化磷酸化u 新的新的NTP加在加在3-OH上上u RNA鏈從鏈從5端向端向3端延伸端延伸u 與模板堿基配對，與模板堿基配對，U對對Au 模板被從模板被從3端向端向5端閱讀端閱讀u 模板局部開鏈小于模板局部開鏈小于20bpu 局部有局部有12bpRNA-DNA雜化雙鏈雜化雙鏈u 模板前方需拓?fù)洚悩?gòu)酶模板前方需拓?fù)洚悩?gòu)酶u 真核生物需要有核小體移位真核生物需要有核小體移位u 原核生物原核生物RNA同時合成蛋白同時合成蛋白第8頁/共86頁第八頁，共86頁。1. 亞基脫落，亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松

4、弛板結(jié)合松弛(sn ch)，沿著，沿著DNA模板前移模板前移 2. 在核心酶作用下，在核心酶作用下，NTP不斷不斷(bdun)聚合，聚合，RNA鏈不斷鏈不斷(bdun)延長延長(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi第9頁/共86頁第九頁，共86頁。第10頁/共86頁第十頁，共86頁。原核生物轉(zhuǎn)錄過程(guchng)中的羽毛狀現(xiàn)象5 3 DNA核糖體核糖體RNARNA聚合酶聚合酶轉(zhuǎn)錄(zhun l)與翻譯同時進(jìn)行第11頁/共86頁第十一頁，共86頁。Simultaneous transcriptions and translation第12頁/共86頁第十二頁，共86頁。1.

5、 真核生物轉(zhuǎn)錄延長真核生物轉(zhuǎn)錄延長(ynchng)過程與原核生物大過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象現(xiàn)象2. RNA-pol前移處處前移處處(chch)都遇上核小體。轉(zhuǎn)都遇上核小體。轉(zhuǎn)錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象錄延長過程中可以觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象第13頁/共86頁第十三頁，共86頁。第14頁/共86頁第十四頁，共86頁。轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄(zhun l)延延長長中中的的核核小小體體移移位位RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小體核小體轉(zhuǎn)錄方向第15頁/共86頁第十五頁，共86頁。第16頁/共86頁第十

6、六頁，共86頁。u依賴依賴Rho ()因子因子(ynz)的轉(zhuǎn)錄終止的轉(zhuǎn)錄終止u非依賴非依賴Rho因子因子(ynz)的轉(zhuǎn)錄終止的轉(zhuǎn)錄終止RNA聚合酶在聚合酶在DNA模板上停頓模板上停頓(tngdn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落分類分類第17頁/共86頁第十七頁，共86頁。DNA模板上靠近終止處，特殊的堿基序列轉(zhuǎn)錄模板上靠近終止處，特殊的堿基序列轉(zhuǎn)錄(zhun l)出出RNA后，后，RNA產(chǎn)物與產(chǎn)物與Rho因子結(jié)合，終因子結(jié)合，終止轉(zhuǎn)錄止轉(zhuǎn)錄(zhun l)ATP第18頁/共86頁第十八頁，共86頁。n 使使RNARNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓(

7、tngdn)(tngdn)n 使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA RNA n 產(chǎn)物釋放。產(chǎn)物釋放。DNADNA模板上靠近終止處，有些模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNARNA后，后，RNARNA產(chǎn)物產(chǎn)物(chnw)(chnw)形成形成特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄第19頁/共86頁第十九頁，共86頁。)終終止止第20頁/共86頁第二十頁，共86頁。第21頁/共86頁第二十一頁，共86頁。5 -AAUAAA-5 -AAUAAA-核酸酶核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAA GTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點轉(zhuǎn)錄終止的修飾

8、點5 5 3 3 3 3 加尾加尾AAAAAAA 3 mRNA 與轉(zhuǎn)錄(zhun l)后修飾密切相關(guān)Poly（A）位點）位點第22頁/共86頁第二十二頁，共86頁。轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄(zhun l)單位單位一個(y )轉(zhuǎn)錄單位就是從啟動子到終止子的一段序列，是一段以一條單鏈RNA分子為表達(dá)產(chǎn)物的DNA片段transcription unit第23頁/共86頁第二十三頁，共86頁。第24頁/共86頁第二十四頁，共86頁。原核細(xì)胞原核細(xì)胞RNA聚合酶（全酶）與啟動子相互作用聚合酶（全酶）與啟動子相互作用真核細(xì)胞真核細(xì)胞RNA聚合酶、反式作用因子聚合酶、反式作用因子(ynz)與順式元件相互作用與順式元件相互作

9、用 1.起始起始(q sh)第25頁/共86頁第二十五頁，共86頁。 2.延伸延伸(ynshn)核心核心(hxn)酶催化酶催化 RNARNA聚合酶催化聚合酶催化(cu (cu hu)hu)，需核小體解聚，需核小體解聚原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞第26頁/共86頁第二十六頁，共86頁。3. 終止終止(zhngzh)原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞依賴依賴(yli)因子因子不依賴不依賴因子因子RNA 3 端形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)端形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)第27頁/共86頁第二十七頁，共86頁。第28頁/共86頁第二十八頁，共86頁。u 原核細(xì)胞原核細(xì)胞u 真核細(xì)胞真核細(xì)胞第29頁/共86頁第二十九頁，共86頁。AU

10、GGG UAA開放(kifng)閱讀框AAAAAAA.An5非翻譯(fny)區(qū)3非翻譯(fny)區(qū)5帽結(jié)構(gòu)帽結(jié)構(gòu)m7Gpppp3多聚 (A) 尾真核生物真核生物mRNAmRNA的一般結(jié)構(gòu)的一般結(jié)構(gòu)第30頁/共86頁第三十頁，共86頁?；蚧?jyn)結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)mRNA 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)(jigu)真核生物的結(jié)構(gòu)真核生物的結(jié)構(gòu)(jigu)基因基因第31頁/共86頁第三十一頁，共86頁。真核生物的結(jié)構(gòu)基因由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)相互間隔但又連續(xù)鑲嵌而成，真核生物的結(jié)構(gòu)基因由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)相互間隔但又連續(xù)鑲嵌而成，為一個為一個(y )蛋白質(zhì)編碼，因此稱為斷裂基因蛋白質(zhì)編碼，因此稱為斷裂基因外顯子外顯

11、子內(nèi)含子內(nèi)含子在斷裂基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)在斷裂基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)(chxin)(chxin)，并表達(dá)為成熟，并表達(dá)為成熟mRNAmRNA的序列的序列在斷裂基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)在斷裂基因的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)(chxin)(chxin)，而在剪接過程中被去除的序列，而在剪接過程中被去除的序列第32頁/共86頁第三十二頁，共86頁。 AG no-coding region17coding regionL12345677 700 bpThe structural genes are composed of coding and non-coding regions that are al

12、ternatively separated. Split gene EABCDFG第33頁/共86頁第三十三頁，共86頁。1993年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎 Phillip Sharp Richard Roberts 周芷 第34頁/共86頁第三十四頁，共86頁。 Primary transcripts of mRNA are called as heteronuclear RNA (hnRNA). hnRNA are larger than matured mRNA by many folds. Modification includes Capping at the 5 - end Taili

13、ng at the 3 - endmRNA splicingRNA edition Modification of hnRNA 第35頁/共86頁第三十五頁，共86頁。55端加帽端加帽轉(zhuǎn)錄終止前已經(jīng)完成，加入轉(zhuǎn)錄終止前已經(jīng)完成，加入m7G5ppp，可穩(wěn)定可穩(wěn)定mRNA并幫助翻譯并幫助翻譯(fny)起始起始7甲基鳥嘌呤核苷三磷酸甲基鳥嘌呤核苷三磷酸(ln sun) （m7GTP）加帽酶加帽酶第36頁/共86頁第三十六頁，共86頁。33加尾加尾長度(chngd)100200個核苷酸加尾信號處切離加尾信號處切離,并加并加poly (A)，與穩(wěn)定，與穩(wěn)定(wndng)mRNA及翻譯效率有關(guān)及翻譯效率有

14、關(guān)核酸酶核酸酶CFI、CFII poly(A)聚合酶聚合酶PAP3-OH引入引入100-200個個A真核基因真核基因(jyn)3端端AATAA及下及下游序列轉(zhuǎn)錄生游序列轉(zhuǎn)錄生成成RNA切除切除3尾尾1025堿基堿基第37頁/共86頁第三十七頁，共86頁。mRNAmRNA的剪接的剪接(jinji)(jinji)mRNA splicing剪接剪接(jinji)(jinji)對象對象剪接剪接(jinji)(jinji)場所場所小分子核糖核蛋白小分子核糖核蛋白snRNP, U1、U2、U4、U5、U6剪接序列剪接序列 剪接反應(yīng)剪接反應(yīng)剪接方式剪接方式第38頁/共86頁第三十八頁，共86頁。The ma

15、tured mRNAs are much shorter than the DNA templates. DNAmRNALariat RNA第39頁/共86頁第三十九頁，共86頁。mRNAmRNA的剪接的剪接(jinji)(jinji)Twice transesterification第40頁/共86頁第四十頁，共86頁。第41頁/共86頁第四十一頁，共86頁。 由U1 snRNA以堿基互補的方式識別mRNA前體5剪接點，由結(jié)合在3剪接點上游富嘧啶(m dn)區(qū)的U2AF（U2 auxiliary factor）識別3剪接點并引導(dǎo)U2 snRNP與分支點相結(jié)合，形成剪接前體（pre-splic

16、eosome）。 剪接(jinji)前體進(jìn)一步與U4、U5、U6 snRNP三聚體相結(jié)合，形成剪接(jinji)體。 真核生物(shngw)mRNA前體中內(nèi)含子剪接過程示意圖第42頁/共86頁第四十二頁，共86頁?！澳粗改粗?mzh)姑娘姑娘”之謎之謎microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism type I (MOPD I) 第43頁/共86頁第四十三頁，共86頁。Deep sequencingGene encoding U4atac snRNA is mutated in individuals with MOPD I第44頁/共86頁

17、第四十四頁，共86頁。 通過不同剪接方式選擇性使用外顯子，合成功能不同而結(jié)構(gòu)(jigu)只有微小差異的蛋白質(zhì)選擇性剪接選擇性剪接(jinji)Alternative splicing第45頁/共86頁第四十五頁，共86頁。第46頁/共86頁第四十六頁，共86頁。Cell 147, 132146, September 30, 2011第47頁/共86頁第四十七頁，共86頁。Model AS Switch in Controlling ESC Pluripotency and Differentiation第48頁/共86頁第四十八頁，共86頁。Taking place at the transc

18、ription levelOne gene responsible for more than one proteinsSignificance: gene sequences, after post-transcriptional modification, can be multiple purpose differentiation. mRNA編輯編輯(binj)第49頁/共86頁第四十九頁，共86頁。Different pathway of apo B Human apo B genehnRNA (14 500 base)liverapo B100（500 kD）intestineap

19、o B48（240 kD）CAA to UAAAt 6666第50頁/共86頁第五十頁，共86頁。成熟成熟(chngsh)mRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞質(zhì)真核生物真核生物(shngw)(shngw)成熟成熟mRNAmRNA的運輸?shù)倪\輸信使信使(xnsh)核糖核蛋白核糖核蛋白顆粒顆粒(mRNP)第51頁/共86頁第五十一頁，共86頁。切除切除5端端16個核苷酸個核苷酸切除切除3端核苷酸端核苷酸加加CCA堿基修飾為稀有堿基堿基修飾為稀有堿基剪接去除剪接去除(q ch)反密碼環(huán)處的內(nèi)含子反密碼環(huán)處的內(nèi)含子RNase PRNase D核苷酸轉(zhuǎn)移酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶第52頁/共86頁第五十二頁，共

20、86頁。第53頁/共86頁第五十三頁，共86頁。 1981 1981年年Cech TCech T在研究四膜蟲在研究四膜蟲(Tetrahymena thermophila) (Tetrahymena thermophila) rRNArRNA前體拼接過程中發(fā)現(xiàn)前體拼接過程中發(fā)現(xiàn)(fxin)(fxin)，此類的拼接無需蛋，此類的拼接無需蛋白質(zhì)的酶參與作用，它可自我催化完成。白質(zhì)的酶參與作用，它可自我催化完成。CechCech稱具有催化稱具有催化功能的功能的RNARNA為核酶（為核酶（ribozymeribozyme）。）。 1989 1989年年cech Tcech T和和Altman SAltm

21、an S共同獲諾貝爾化學(xué)獎，共同獲諾貝爾化學(xué)獎，Altman SAltman S的貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)的貢獻(xiàn)是發(fā)現(xiàn)(fxin)Rnase P(fxin)Rnase P中的中的M1RNAM1RNA單獨單獨也具有催化功能也具有催化功能 。核酶的發(fā)現(xiàn)。核酶的發(fā)現(xiàn)(fxin)(fxin)改變了酶的化改變了酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。第54頁/共86頁第五十四頁，共86頁。The M1 RNAin ribonucleaseP is catalyticThe intron inthe pre-rRNA ofTetrahemena is self-spliced第55頁/共86頁第五十五

22、頁，共86頁。錘頭核酶的結(jié)構(gòu)(jigu)Hammer-head第56頁/共86頁第五十六頁，共86頁。設(shè)計錘頭核酶定向(dn xin)切割靶RNA第57頁/共86頁第五十七頁，共86頁。 Be a supplement to the central dogma Redefine the enzymology Provide a new insights for the origin of life Be useful in designing the artificial ribozymes as the therapeutical agents Significance of ribozym

23、e第58頁/共86頁第五十八頁，共86頁。生命生命(shngmng)起源的探索起源的探索-DNA world or RNA world ？逆轉(zhuǎn)錄 核酶第59頁/共86頁第五十九頁，共86頁。哪一種先出現(xiàn)(chxin)，蛋白質(zhì)還是DNA？RNA，RNA，RNARNA，RNA，RNA，RNARNA，RNA，RNARNA， RNA，RNARNA 世界(shji)DNA蛋白質(zhì)第60頁/共86頁第六十頁，共86頁。第61頁/共86頁第六十一頁，共86頁。第62頁/共86頁第六十二頁，共86頁。$染色質(zhì)和核小體結(jié)構(gòu)對轉(zhuǎn)錄有深刻的影響$真核細(xì)胞RNA聚合酶高度分工$轉(zhuǎn)錄還需要許多(xdu)被稱為轉(zhuǎn)錄因子的蛋

24、白質(zhì)的 參與$啟動子以外的序列參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄$轉(zhuǎn)錄與翻譯不存在偶聯(lián)關(guān)系$轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物多為單順反子，而原核基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多為多順反子第63頁/共86頁第六十三頁，共86頁。第64頁/共86頁第六十四頁，共86頁。逆轉(zhuǎn)錄病毒(bngd)細(xì)胞內(nèi)的逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象:RNA 模板模板(mbn)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈雜化雙鏈RNA酶酶單鏈單鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶雙鏈雙鏈DNA第65頁/共86頁第六十五頁，共86頁。艾滋病毒完整(wnzhng)的生活史第66頁/共86頁第六十六頁，共86頁。Prof. David Ho治療(zhlio)艾滋病的“雞尾酒”療法第67頁/共86頁第六十七頁，共86

25、頁。小 結(jié)轉(zhuǎn)錄的過程包括(boku)幾個主要步驟hnRNA的轉(zhuǎn)錄(zhun l)后修飾有哪些第68頁/共86頁第六十八頁，共86頁。 replicationtranscriptiontemplatedouble strandssingle strandsubstratedNTPNTPprimer yesno enzymeDNA polymeraseRNA polymeraseproductdsDNAssRNApatternA-TSemidiscontinu- A-UContinu- base pairprocessingnoyes第69頁/共86頁第六十九頁，共86頁。第70頁/共86頁第七十

26、頁，共86頁。第71頁/共86頁第七十一頁，共86頁。5335RNA合成合成(hchng)中的中的 DNA模板模板有意義有意義(yy)鏈、鏈、Waston 鏈、負(fù)鏈鏈、負(fù)鏈反意義鏈，反意義鏈，Crick 鏈、正鏈鏈、正鏈 第72頁/共86頁第七十二頁，共86頁。 第73頁/共86頁第七十三頁，共86頁。 RNA-pol I 核仁核仁(h rn) 45S-rRNARNA-pol II 核質(zhì)核質(zhì) hnRNA、miRNARNA-pol III 核質(zhì)核質(zhì) 5S-rRNA、tRNA、snRNA種類種類 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)內(nèi)定位內(nèi)定位 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物物Mt RNA-pol 線粒體線粒體 線粒體線粒體RNAs 第74頁/共86