CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)常見問題與解析

1、WORD格式1 、問：請問有人養(yǎng)過 CHO細(xì)胞嗎？文獻(xiàn)報道說用 DMEM培養(yǎng)基來養(yǎng)，但我不太清楚具體是高糖還是低 糖？參考見解： CHO細(xì)胞用高糖 DMEM養(yǎng)就可以了，比較好養(yǎng)， 10%血清，小牛和胎牛都可以，長得比較慢， 跟你所用的血清有一定的關(guān)系，大概需要兩天傳一次代。在塑料板上比玻璃板上好養(yǎng)，感覺如果在玻璃板 上養(yǎng)而且不包被的話，好像細(xì)胞不易伸展開來。2 、問：要轉(zhuǎn)染鉀通道 pcDNA3.1 入細(xì)胞，是選 cho 細(xì)胞呢還是 hek293 細(xì)胞？ cho 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高嗎？ 參考見解：表達(dá)一個蛋白的時候，首先要確認(rèn)你的蛋白確實(shí)表達(dá)了，因為有很多原因可以導(dǎo)致蛋白表達(dá)出 問題（質(zhì)粒序列有錯誤

2、，質(zhì)粒純度低，表達(dá)的蛋白不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染效率太低等）。所以在做任何功能性實(shí)驗 之前，必須要先確認(rèn)蛋白的表達(dá)，通常的實(shí)驗有：（ 1）采用免疫熒光法。由于需要熒光二抗，比較貴。但直觀，可以確定轉(zhuǎn)染效率，采用好的顯微鏡時，可 以大致知道表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的位置。（ 2） WESTERN-BLO。T可以確認(rèn)表達(dá)的蛋白分子量，以及表達(dá)的量。但不直觀。有可DNA（ 3）構(gòu)建一個 N或 C端帶熒光蛋白的質(zhì)粒。這樣比較費(fèi)時間，同時攜帶的熒光蛋（通常使用GFP）能干擾蛋白的正常功能。但好處是轉(zhuǎn)染后可以很方便的觀察轉(zhuǎn)染效率，蛋白在細(xì)胞中的位置等。當(dāng)然以上方法都無法知道質(zhì)粒有無發(fā)生突變，所以如果你的蛋白有表達(dá)但沒有功能，

3、首先要做一個 測序確認(rèn)你的序列沒有問題。事實(shí)上質(zhì)粒發(fā)生突變的機(jī)會比大多數(shù)人想象的要多得多！3、問：由于我要用 CHO細(xì)胞生產(chǎn)基因工程抗體，用什么培養(yǎng)基能夠很好的使之良好的生長參考見解：培養(yǎng) CHO細(xì)胞最好用 F12，并且由于 F12 中加入了一些微量元素與無機(jī)離子，因此可以在血 清很少的情況下應(yīng)用，是無血清培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，特別適合進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)和克隆化培養(yǎng)。我們 的前輩曾用 F12 在無血清的條件下成功的克隆出 CHO細(xì)胞。無血清培養(yǎng) CHO細(xì)胞有兩種方法：一種是直接向試劑公司購買只適用于培養(yǎng)CHO細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基（好像 HyClone 就有）；第二種方法實(shí)際上是有血清培養(yǎng)，只不過血

4、清濃度很低罷了，可以近似的認(rèn)為無血 清。在第二種方法里，又可以分出兩條途徑：你可以分步進(jìn)行，也可以一步到位。分步法是，CHO細(xì)胞先在含 10血清的常規(guī)培養(yǎng)基里培養(yǎng)，再到含5血清的培養(yǎng)基里培養(yǎng)，再到含 2.5 血清的培養(yǎng)基里培養(yǎng)，依此類推，培養(yǎng)基里的血清不斷下降，直到一個能讓CHO細(xì)胞良好生長的最低血清濃度。一步到位法就是省去中間的步驟，直接由起點(diǎn)的血清濃度到終點(diǎn)濃度。4、問：我要做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，表達(dá)融合蛋白并將蛋白質(zhì)純化來檢測其功能。僅僅把目的基因插入pcDNA3.1，沒有插入其他的基因或者 tag ?，F(xiàn)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染 CHO細(xì)胞。就相關(guān)問題想問問：有的文獻(xiàn)上沒有署名 K1 或是 DHFR,普通所寫的

5、CHO細(xì)胞是指那種？野生型 CHO細(xì)胞又是指的哪種？這三種細(xì)胞是不是因為 CHO-K1和 CHO/DHFR有- 擴(kuò)增基因 GS和 DHFR,可以更為有效的擴(kuò)增進(jìn)而表 達(dá)，比野生型 CHO在轉(zhuǎn)染中更起作用？如果就我的實(shí)驗要求， CHO-K1或者 CHO/DHFR更- 加適合，那么轉(zhuǎn)染 CHO-K1是不是可以直接轉(zhuǎn)染？而轉(zhuǎn)染 CHO-DHFR需- 要和攜帶 DHFR-的標(biāo)記質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染？參考見解：做穩(wěn)定表達(dá)是需要把目的基因克隆到一定的載體上的，這個載體同時可以過表達(dá)一個抗性基因， 如果載體整和到基因組上，這個抗性已經(jīng)能夠克服篩選壓力，而這個時候你的目的蛋白也得到了有效的表 達(dá)。（ 1 ）野生型 CH

6、O就是（2）CHO DHFR-是指缺陷型細(xì)胞，作為篩選標(biāo)記（3）你用 pc 3.1 的話, 可以直接轉(zhuǎn)染 CHO-K1,加 G418篩選即可 .5 、問：最近作試驗需要用到 CHO細(xì)胞，老師從廣西帶回兩瓶，本來用的是DMEM培養(yǎng)液，由于我沒有接觸過細(xì)胞這方面的知識，上網(wǎng)查了下培養(yǎng)液，說 1640 就可以，就倉促用了 1640，兩天過去了貼壁很 不好，估計是要完了，求救。參考見解 1：（ 1）帶回來的細(xì)胞瓶匯合度大概多少？一般送人的細(xì)胞匯合度大概80 90，且瓶里加滿培養(yǎng)液，再包裝。細(xì)胞生長旺盛，便于處理。加滿培養(yǎng)液的目的是防止運(yùn)輸過程中倒置，細(xì)胞接觸不到培養(yǎng)液而死亡或 活力下降。培養(yǎng)時應(yīng)該分瓶

7、培養(yǎng)。我想你應(yīng)該分瓶了吧，我們一般 1:3 分瓶。不分瓶培養(yǎng)可想而知了。（ 2）如果上述沒錯的話，準(zhǔn)備好正確的完全培養(yǎng)液，將生長不好的細(xì)胞瓶中的細(xì)胞消化收集，合并一下， 鋪底大概 30。正常培養(yǎng)。（ 3）關(guān)鍵掌握住起始細(xì)胞的密度和嚴(yán)格的操作。因為這細(xì)胞已很常見。方法正確不存在長不好的問題。除 非你的老師帶回來的細(xì)胞存在問題。參考見解 2：37 度預(yù)熱胰酶，吸除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液， PBS（無鈣鎂）洗滌細(xì)胞 1次后，加入少量胰酶， 覆蓋細(xì)胞即可。輕輕搖動（前后左右）。鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，一旦出現(xiàn)細(xì)胞回縮形態(tài)變圓即停止消化（防 止過渡消化）。加入完全培養(yǎng)液（必須含胎牛血清）終止消化反應(yīng)。灣頭吸管順序吹

8、打細(xì)胞，小心避免產(chǎn) 生氣泡（對細(xì)胞有害）。鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞分散即可后續(xù)操作。如果是新手，保留上清以防不測，別倒 掉。6、問：最近要養(yǎng) CHO細(xì)胞, 要作些準(zhǔn)備 , 但不知道其培養(yǎng)也是什么 , 謝謝參考見解：這是一篇已發(fā)表的 CHO細(xì)胞培養(yǎng)的方法 .CHO細(xì)胞培養(yǎng)： CHO細(xì)胞株置于 RPMI1640培養(yǎng)基中，內(nèi)含 10%滅活小牛血清，青霉素 100IU/mL，鏈霉素 100IU/mL，置于 37， 5%CO2的培養(yǎng)箱（德國 Heraeus）中培養(yǎng)。每隔 48h 換培液，當(dāng)單層培養(yǎng)細(xì)胞匯合以后，用 0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶中的CHO細(xì)胞按 1105/mL傳代移入培養(yǎng)板中，待進(jìn)

9、入對數(shù)生長期后（約24h ）加藥。這是細(xì)胞的供給源 :CHO細(xì)胞由中科院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。7、問：這兩個月， CHO細(xì)胞在反應(yīng)器上總是在前兩天很難密度長上去，同期轉(zhuǎn)瓶生長正常，基本排除細(xì) 胞及培養(yǎng)基的問題，換罐做也出現(xiàn)同種現(xiàn)象，可排除反應(yīng)器問題。與曾經(jīng)在此罐上正常生長的一批相比， 只是接入培養(yǎng)液體積由 1.5 升該為 0.8 升，其他條件均相同，反應(yīng)器控制系統(tǒng)無異常。不知問題到底出在 什么地方，懇請各位不吝賜教！不勝感激！參考見解：根據(jù)我自己的經(jīng)驗，如果你的種子細(xì)胞和培養(yǎng)基都確保沒問題的話，試試一下幾點(diǎn)：（ 1 ）接種時留一些細(xì)胞懸液，種回到方瓶或轉(zhuǎn)瓶中，用與大罐相同的培養(yǎng)基

10、同時培養(yǎng)，觀察48 小時內(nèi)的生長情況，如果方瓶長勢良好而罐子有問題，那就是操作的問題了（ 2）不知道你的罐子 800mL能否確保攪拌、通氣等參數(shù)的控制效率，只看儀表顯示是不夠的，有時液位 太低可能探測到的不是真實(shí)值，你可以在接種前用水試試，把各種條件設(shè)的極端一些，容易發(fā)現(xiàn)問題（ 3）有可能的話再做一次 1.5L 培養(yǎng)，看能否重現(xiàn) 6 月的結(jié)果，因為你說所有條件都一樣可能是不準(zhǔn)確的， 有疏漏的地方8、問：我培養(yǎng)的 cho 細(xì)胞, 在塑料基質(zhì)的方瓶中貼壁和生長情況很好, 形態(tài)也很正常 ,但是接入轉(zhuǎn)瓶后貼壁情況很差 , 不伸展或伸展需要的時間很長 . 請問這主要是什么原因 ?參考見解：我覺得可能的原

11、因有如下幾點(diǎn)：（ 1）細(xì)胞本身貼壁生長的能力較弱，一般細(xì)胞在塑料器皿上的貼附能力強(qiáng)于玻璃器皿，這樣的話，就選擇 塑料器皿好了。其實(shí)塑料培養(yǎng)瓶等也是可以重復(fù)使用的，清洗干凈，泡酸，沖洗干凈，涼干之后，射線照射消毒或者就是紫外消毒也行，我們實(shí)驗室就這樣重復(fù)用培養(yǎng)板，沒有什么問題。當(dāng)然，太舊的還是扔了好了。（ 2）培養(yǎng)液 PH不好也會影響貼壁，配的時候加好緩沖試劑，不嫌麻煩的話調(diào)定PH在 7.2 左右。使用時間較長的培養(yǎng)液由于在空氣中暴露時間長， ph 會有變化（ 3）消化時候處理不合適，比如胰酶消化過久，有EDTA的話，去除不干凈也影響貼壁的。消化完了之后要吸干凈消化液，用培養(yǎng)液漂洗細(xì)胞，或者吹下

12、來之后離心，換加新鮮培養(yǎng)液（ 4 ）血清也可能影響貼壁，我觀察過，細(xì)胞在胎牛血清中貼壁明顯快于新生牛血清，尤其是Hyclone 的血清，不過很貴試試吧，有耐心點(diǎn)，等等它總會鋪展開的9、問：最近我養(yǎng) CHO細(xì)胞，是從別人那里得來得。給我得時候細(xì)胞有一半是圓形一半是梭行的。但是養(yǎng) 著養(yǎng)著就大部分成圓形，而且有的像荷包蛋一樣，而那些還是梭形的細(xì)胞里面出現(xiàn)了空泡一樣的東西，還 有漸漸像融化了一樣。是什么原因，我一直很頭疼，不知道該怎么辦，下面的實(shí)驗無法進(jìn)行，苦惱??！ 參考見解：聽您的描述估計很可能是支原體污染。建議馬上丟棄該細(xì)胞，因為支原體污染很難去除，為避免影響您實(shí)驗室其他的細(xì)胞操作一定不要猶豫。您 可以重新索取或購買狀態(tài)好的 CHO細(xì)胞。10、問：由于接種密度稍低一些， CHO細(xì)胞在 2L 轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng) 5 天左右很難消化下來