分子生物學(xué)第9章

1、第九章第九章聚聚 合合 酶酶 鏈鏈 反反 應(yīng)應(yīng) 第一節(jié)第一節(jié) PCR基本原理基本原理高溫變性高溫變性低溫復(fù)性低溫復(fù)性適溫延伸適溫延伸 高溫變性高溫變性：94左右，目的基因解鏈為單鏈，以作為擴(kuò)增的模板； 低溫復(fù)性低溫復(fù)性：5560，一對(duì)特異性引物分別與模板3端互補(bǔ)結(jié)合； 適溫延伸適溫延伸：72，延伸反應(yīng)； 每一循環(huán)使DNA分子擴(kuò)增一倍，n次循環(huán)后，理論上DNA分子可擴(kuò)增為2n。12345507295時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍聚合酶鏈反應(yīng)的原理聚合酶

2、鏈反應(yīng)的原理第二節(jié)第二節(jié) PCR特點(diǎn)特點(diǎn)特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)靈敏度高靈敏度高皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12) )量級(jí)擴(kuò)增到微克量級(jí)擴(kuò)增到微克( (ugug=10=10-6-6) )水平水平能從能從100100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3 3個(gè)個(gè)RFURFU，細(xì)菌為，細(xì)菌為3 3個(gè)細(xì)菌個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，一次性加好反應(yīng)液，1 14 4 小時(shí)完成擴(kuò)增小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提血液、體腔液

3、、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNADNA第三節(jié)第三節(jié)PCR體系組成和反應(yīng)條件優(yōu)化體系組成和反應(yīng)條件優(yōu)化 一、體系組成一、體系組成 DNADNA聚合酶聚合酶 引物（引物（PrimerPrimer） dNTPdNTP（原料）（原料） 目的目的DNADNA模板模板 緩沖液（緩沖液（BufferBuffer）(一一)DNA聚合酶聚合酶 (二二)引物引物 引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)原則: :1 1引物長(zhǎng)度引物長(zhǎng)度 15-30nt15-30nt2 2引物組成引物組成 G/CG/C含量以含量以40%-60%40%-60%為宜為宜3 3引物結(jié)構(gòu)引物結(jié)構(gòu) 堿基隨機(jī)分布、二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物二聚體，堿基隨機(jī)分布、

4、二級(jí)結(jié)構(gòu)、引物二聚體，33端不應(yīng)有三端不應(yīng)有三個(gè)連續(xù)的個(gè)連續(xù)的G/CG/C，55端可以修飾端可以修飾4 4引物特異性引物特異性 與其他序列的同源性一般與其他序列的同源性一般70%70%5 5引物濃度引物濃度 非特異性擴(kuò)增，引物二聚體非特異性擴(kuò)增，引物二聚體6 6引物質(zhì)量引物質(zhì)量 純化純化3引物設(shè)計(jì)常用軟件主要有：lPrimer Premier 5.0 lOligo 6lprimer 3lThe Primer GeneratorlNet Primer (三三)dNTP 1 1應(yīng)當(dāng)根據(jù)目的應(yīng)當(dāng)根據(jù)目的DNADNA的長(zhǎng)度和的長(zhǎng)度和組成確定組成確定dNTPdNTP的濃度的濃度 2 2四種四種dNTPd

5、NTP要要等摩爾濃度等摩爾濃度配配制制 3 3dNTPdNTP的的質(zhì)量質(zhì)量也與擴(kuò)增效率也與擴(kuò)增效率有密切關(guān)系有密切關(guān)系(四四)模板模板 DNADNA或或RNARNA（先逆轉(zhuǎn)錄合成（先逆轉(zhuǎn)錄合成cDNAcDNA） 來(lái)源來(lái)源: :根據(jù)根據(jù)科學(xué)研究或臨床檢驗(yàn)科學(xué)研究或臨床檢驗(yàn)的需要，可以是臨床標(biāo)本的需要，可以是臨床標(biāo)本 ( (血液、尿液、羊水、分泌物等血液、尿液、羊水、分泌物等) )、藥物標(biāo)本、藥物標(biāo)本 ( (動(dòng)植物細(xì)胞、動(dòng)植物細(xì)胞、組織等組織等) )、法醫(yī)標(biāo)本、法醫(yī)標(biāo)本 ( (犯罪現(xiàn)場(chǎng)的血漬、精斑、毛發(fā)等犯罪現(xiàn)場(chǎng)的血漬、精斑、毛發(fā)等) )、病原體標(biāo)本病原體標(biāo)本 ( (病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原

6、體、立克病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體等次體等) )、考古標(biāo)本、考古標(biāo)本( (骨骸、毛發(fā)等骨骸、毛發(fā)等) ) 無(wú)論何種來(lái)源的標(biāo)本，都應(yīng)該進(jìn)行無(wú)論何種來(lái)源的標(biāo)本，都應(yīng)該進(jìn)行預(yù)處理預(yù)處理(五五)緩沖溶液緩沖溶液維持維持DNADNA聚合酶的活性和穩(wěn)定性聚合酶的活性和穩(wěn)定性1 1、pH=7pH=72 22 2、50mmol/L 50mmol/L KClKCl可以促進(jìn)引物退火，但濃度過(guò)高會(huì)抑制酶可以促進(jìn)引物退火，但濃度過(guò)高會(huì)抑制酶25mmol/L 25mmol/L (NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4，SOSO4 4對(duì)金屬離子有一定的結(jié)合力。對(duì)金屬離子有一定的結(jié)合力。3 3、小牛血清

7、白蛋白或明膠小牛血清白蛋白或明膠可以維持酶活性，能保證可以維持酶活性，能保證PCRPCR的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性4 4、甲酰胺或二甲基亞砜甲酰胺或二甲基亞砜有利于松解發(fā)夾結(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有利于松解發(fā)夾結(jié)構(gòu)等二級(jí)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)引物退火引物退火5 5、Mg2+:Mg2+:影響酶活性及變性解鏈、引物退火、擴(kuò)增效率、擴(kuò)增特影響酶活性及變性解鏈、引物退火、擴(kuò)增效率、擴(kuò)增特異性等異性等二、條件優(yōu)化二、條件優(yōu)化 ( (一一) )反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間1 1變性溫度和時(shí)間變性溫度和時(shí)間 95953030秒或秒或97 97 1515秒秒2 2退火溫度和時(shí)間退火溫度和時(shí)間 退火溫度應(yīng)當(dāng)?shù)陀谝锿嘶饻囟葢?yīng)當(dāng)?shù)?/p>

8、于引物TmTm值值3-5 3-5 ，通常為，通常為50-50-65 65 ，20-4020-40秒鐘秒鐘3 3延伸溫度和時(shí)間延伸溫度和時(shí)間 TaqDNATaqDNA聚合酶的最適溫度為聚合酶的最適溫度為75-80 75-80 ，72 72 ，1min1min ( (二二) )循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定循環(huán)次數(shù)決定PCRPCR擴(kuò)增效率擴(kuò)增效率一般控制在一般控制在30-4030-40次次酶活性下降、酶活性下降、dNTPdNTP濃度下降等，會(huì)使反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期濃度下降等，會(huì)使反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期三、產(chǎn)物分析三、產(chǎn)物分析 ( (一一) )電泳分析電泳分析 ( (二二) )酶切分析酶切分析既能對(duì)既能對(duì)PCRPC

9、R產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，又能對(duì)靶基因進(jìn)行分型產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，又能對(duì)靶基因進(jìn)行分型 ( (三三) )雜交分析雜交分析檢測(cè)檢測(cè)PCRPCR產(chǎn)物特異性，是否存在變異產(chǎn)物特異性，是否存在變異 ( (四四) )序列分析序列分析檢測(cè)檢測(cè)PCRPCR產(chǎn)物特異性最可靠的方法產(chǎn)物特異性最可靠的方法第四節(jié)第四節(jié) 常用常用 PCR技術(shù)技術(shù) 一、逆轉(zhuǎn)錄一、逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR) 一步法一步法: :逆轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄和PCRPCR在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行 兩步法兩步法: :逆轉(zhuǎn)錄和逆轉(zhuǎn)錄和PCRPCR在兩個(gè)反應(yīng)體系中分開進(jìn)行在兩個(gè)反應(yīng)體系中分開進(jìn)行 引物很關(guān)鍵。引物很關(guān)鍵。 oligo(dToligo(d

10、T) )引物引物 特異性引物特異性引物 隨機(jī)引物隨機(jī)引物 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR可以與可以與DNADNA印跡法聯(lián)合，分析擴(kuò)增產(chǎn)物，從而分印跡法聯(lián)合，分析擴(kuò)增產(chǎn)物，從而分析樣品中的析樣品中的RNARNA含量，研究基因表達(dá)含量，研究基因表達(dá) 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCRPCR靈敏度較低，屬于靈敏度較低，屬于半定量分析半定量分析 二、實(shí)時(shí)定量二、實(shí)時(shí)定量PCR (Q-PCR)對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)來(lái)跟蹤對(duì)熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)來(lái)跟蹤PCRPCR進(jìn)程，標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析起始模板進(jìn)程，標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析起始模板水平水平1 1實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCRPCR探針探針 特異性熒光探針特異性熒光探針：熒光報(bào)告：熒光報(bào)告/ /淬滅基

11、團(tuán)淬滅基團(tuán) EBEB或或SGSG作為熒光探針作為熒光探針2 2實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCRPCR應(yīng)用應(yīng)用與逆轉(zhuǎn)錄聯(lián)合可以定量分析與逆轉(zhuǎn)錄聯(lián)合可以定量分析mRNAmRNA以研究基因表達(dá)以研究基因表達(dá)基礎(chǔ)研究與臨床診斷基礎(chǔ)研究與臨床診斷 3 3實(shí)時(shí)定量實(shí)時(shí)定量PCRPCR特點(diǎn)特點(diǎn) PCRPCR高效性高效性、核酸分子雜交、核酸分子雜交特異性特異性、熒光技術(shù)、熒光技術(shù)高靈敏度高靈敏度和和可計(jì)量性可計(jì)量性、TaqDNATaqDNA聚合酶的聚合酶的外切酶活性外切酶活性封閉條件，沒有污染，自動(dòng)化程度高，多重反應(yīng)封閉條件，沒有污染，自動(dòng)化程度高，多重反應(yīng)定量原理定量原理確定初始模板的濃度 初始 DNA量越多, 熒光

12、達(dá)到某一值（域值）時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)越少（Ct值） Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)初始模板量對(duì)數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210循環(huán)閾值（循環(huán)閾值（CtCt）與初始模板含量）與初始模板含量 初始模板量越多，C(t)值越小 C(t)與初始模板濃度的對(duì)數(shù)值成線性關(guān)系熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)PCR與普通與普通PCR的比較的比較 靈敏度高 靈敏的熒光檢測(cè)較電泳檢測(cè)靈敏度高 特異性高 使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合，提高了PCR反應(yīng)的特異性 定量準(zhǔn)確

13、全程監(jiān)控，準(zhǔn)確的算法進(jìn)行定量 無(wú)需跑膠，自動(dòng)化程度高4通道實(shí)時(shí)熒光定量通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀儀熒光定量PCR儀是一種帶有激發(fā)光源和熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的PCR儀，通常配有電腦系統(tǒng)及相應(yīng)的分析軟件。熒光定量熒光定量 PCR儀儀三、修飾引物三、修飾引物PCR 對(duì)特定對(duì)特定DNADNA序列進(jìn)行序列進(jìn)行定向克隆定向克隆 、定點(diǎn)誘變、定點(diǎn)誘變 、體外轉(zhuǎn)錄、體外轉(zhuǎn)錄等等研究時(shí)，需要其末端帶有研究時(shí)，需要其末端帶有限制位點(diǎn)、突變序列、啟動(dòng)子限制位點(diǎn)、突變序列、啟動(dòng)子等等DNADNA元件，為此可以在元件，為此可以在PCRPCR引物的引物的55端加接端加接這些元件進(jìn)行這些元件進(jìn)行擴(kuò)增，這就是修飾引物擴(kuò)增，這就是修

14、飾引物PCRPCR 例如例如: :在引物在引物5 5，端加接限制位點(diǎn)，就可以用限制酶切割擴(kuò)，端加接限制位點(diǎn)，就可以用限制酶切割擴(kuò)增產(chǎn)物，形成黏端，從而與有互補(bǔ)黏端的載體增產(chǎn)物，形成黏端，從而與有互補(bǔ)黏端的載體DNADNA重組，重組，這就是克隆這就是克隆PCRPCR 克隆克隆PCRPCR克隆效率較高，并且如果給兩個(gè)引物加接不同的克隆效率較高，并且如果給兩個(gè)引物加接不同的限制位點(diǎn)，可以進(jìn)行定向克隆限制位點(diǎn)，可以進(jìn)行定向克隆四、等位基因特異性四、等位基因特異性PCR 等位基因特異性等位基因特異性PCR(AS-PCR)PCR(AS-PCR)用于檢測(cè)用于檢測(cè)點(diǎn)突變點(diǎn)突變 原理原理: :同時(shí)設(shè)計(jì)一個(gè)同時(shí)設(shè)

15、計(jì)一個(gè)正常引物對(duì)正常引物對(duì)和一個(gè)和一個(gè)突變引物突變引物對(duì)對(duì) 下游引物完全一樣下游引物完全一樣，上游引物上游引物33末端的堿基不末端的堿基不同同 兩個(gè)兩個(gè)PCRPCR體系體系，各加入一個(gè)引物對(duì)，各加入一個(gè)引物對(duì) 等位基因特異性等位基因特異性PCRPCR用于鑒定單核苷酸多態(tài)性用于鑒定單核苷酸多態(tài)性 (SNP)(SNP)五、五、PCR-RFLP 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)- -限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù) (PCR-(PCR-RFLPRFLP) )是是PCRPCR技術(shù)與技術(shù)與RFRF分析的聯(lián)合，即先用分析的聯(lián)合，即先用PCRPCR將包含待測(cè)將包含待測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)的多態(tài)性位點(diǎn)的DNADNA片段擴(kuò)增出來(lái)，然后用識(shí)別該位點(diǎn)的限片段擴(kuò)增出來(lái)，然后用識(shí)別該位點(diǎn)的限制酶切割，電泳分析其制酶切割，電泳分析其RFLPRFLP，判斷是否存在突變，判斷是否存在突變 PCR-RFLPPCR-