動物細胞工程高三生物一輪復習

1、2.2 動物細胞工程動物細胞工程植物細胞工程常用的技術植物細胞工程常用的技術動物細胞工程常用的技術動物細胞工程常用的技術植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)植物體細胞雜交植物體細胞雜交動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)核移植核移植動物細胞融合動物細胞融合單克隆抗體單克隆抗體 概念：就是從動物機體中取出相關的組織，概念：就是從動物機體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞，然后放在適宜的培將它分散成單個細胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基上養(yǎng)基上, , 讓這些細胞生長和增殖。讓這些細胞生長和增殖。一一. 動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)（一）過程（一）過程細胞貼壁細胞貼壁：培養(yǎng)貼附性細胞的時候，細胞要能夠貼附于：培養(yǎng)貼附性細胞的時候，細

2、胞要能夠貼附于底物上才能生長。底物上才能生長。接觸抑制接觸抑制：貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞：貼壁細胞分裂生長到表面相互接觸時，細胞就會停止分裂增長。就會停止分裂增長。原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)：動物組織消化后的初次培養(yǎng)，包括培養(yǎng)的：動物組織消化后的初次培養(yǎng)，包括培養(yǎng)的第第一代與第十代以內的細胞。一代與第十代以內的細胞。傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)的細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配置成：將原代培養(yǎng)的細胞從培養(yǎng)瓶中取出，配置成細胞懸液，分裝到兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞懸液，分裝到兩個以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞貼壁過程細胞貼壁過程細胞在貼壁生長過程細胞在貼壁生長過程中中, ,隨著細胞分裂隨著細胞分裂

3、, ,數數量不斷增加量不斷增加, ,最后形最后形成一個成一個單層單層, ,此時細此時細胞間胞間相互接觸相互接觸, ,細胞細胞分裂和生長停止。分裂和生長停止。接觸抑制接觸抑制單個細胞單個細胞剪碎剪碎 胰蛋白酶胰蛋白酶原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)（分瓶前）（分瓶前）傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)（分瓶后）（分瓶后）胚胎或幼齡動物的組織器官胚胎或幼齡動物的組織器官( (細胞來源細胞來源) )加培養(yǎng)液加培養(yǎng)液細胞懸浮液細胞懸浮液1010代細胞代細胞5050代細胞代細胞無限傳代無限傳代（二）動物細胞培養(yǎng)的條件：（二）動物細胞培養(yǎng)的條件：1.無菌無毒的環(huán)境無菌無毒的環(huán)境 無菌操作并加抗生素無菌操作并加抗生素2.2.營養(yǎng)營養(yǎng)葡萄糖葡

4、萄糖，氨基酸，無機鹽，微量元素，氨基酸，無機鹽，微量元素，動物血清動物血清3.3.溫度和溫度和PHPH與哺乳動物體溫接近，與哺乳動物體溫接近，PHPH為為7.2-7.47.2-7.44.4.氣體環(huán)境氣體環(huán)境O2O2和和CO2CO2定期更換培養(yǎng)液定期更換培養(yǎng)液（三）動物細胞培養(yǎng)的應用（三）動物細胞培養(yǎng)的應用生物制品：培養(yǎng)雜交瘤細胞獲得病毒疫苗，干擾生物制品：培養(yǎng)雜交瘤細胞獲得病毒疫苗，干擾素，單克隆抗體等生物制品。素，單克隆抗體等生物制品。檢測有毒物質：有毒物質可以引起培養(yǎng)動物細胞檢測有毒物質：有毒物質可以引起培養(yǎng)動物細胞畸形或病變。畸形或病變。理論研究：通過培養(yǎng)正常或各種病變細胞進行生理論研究

5、：通過培養(yǎng)正常或各種病變細胞進行生理，病理，藥理等方面的研究理，病理，藥理等方面的研究植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較比較項目比較項目植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理原理細胞的全能性細胞的全能性細胞增殖細胞增殖培養(yǎng)基性質培養(yǎng)基性質固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 動物血清動物血清培養(yǎng)結果培養(yǎng)結果植物體植物體細胞株、細胞系細胞株、細胞系培養(yǎng)目的培養(yǎng)目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育無病毒植株無病毒植株獲得細胞或細胞獲得細胞或細胞分泌蛋白分泌蛋白 二二. .動物體細胞核移植和

6、克隆動物動物體細胞核移植和克隆動物（一）核移植：將動物的一個細胞的細胞核，移（一）核移植：將動物的一個細胞的細胞核，移入一個已經去掉細胞核的卵母細胞中，使其重入一個已經去掉細胞核的卵母細胞中，使其重組并發(fā)育成為一個新的胚胎，使這個新的胚胎組并發(fā)育成為一個新的胚胎，使這個新的胚胎最終發(fā)育成為動物個體。最終發(fā)育成為動物個體。（二）克隆動物：用核移植技術得到的動物。（二）克隆動物：用核移植技術得到的動物。 克?。和ㄟ^克?。和ㄟ^無性生殖而產生的具有完全相同的無性生殖而產生的具有完全相同的遺傳組成的一群細胞或生物的個體，遺傳組成的一群細胞或生物的個體，克隆在希克隆在希臘語中是臘語中是“小樹枝葉小樹枝葉”

7、的意思，用以指無性增的意思，用以指無性增殖動物，現在指個體，細胞，基因等不同水平殖動物，現在指個體，細胞，基因等不同水平上無性增殖動物。上無性增殖動物。卵細胞卵細胞母綿羊母綿羊母綿羊母綿羊乳腺細胞乳腺細胞細胞質細胞質細胞核細胞核細胞核移植細胞核移植早期胚胎早期胚胎卵裂卵裂C母綿羊子宮母綿羊子宮胚胎移植胚胎移植多莉羊多莉羊分娩分娩妊娠妊娠融合后的卵細胞融合后的卵細胞核移植技術：核移植技術：將動物的一將動物的一個細胞的細個細胞的細胞核，移入胞核，移入一個已經去一個已經去核的卵母細核的卵母細胞中，使其胞中，使其重新并發(fā)育重新并發(fā)育成為一個新成為一個新的胚胎，這的胚胎，這個新的胚胎個新的胚胎最終發(fā)育成

8、最終發(fā)育成為動物個體。為動物個體。分為：胚胎分為：胚胎細胞的核移細胞的核移植和體細胞植和體細胞核移植。核移植。1、在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，、在體細胞的細胞核移植到受體卵母細胞之前，為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？為什么必須先去掉受體卵母細胞的核？2 2、用于核移植的供體細胞一般都選用傳代、用于核移植的供體細胞一般都選用傳代1010代以代以內的細胞，為什么？內的細胞，為什么？為使核移植動物的遺傳物質全部來自為使核移植動物的遺傳物質全部來自有利用價值有利用價值的動物的動物提供的細胞。提供的細胞。1010代以內的細胞一般保持正常二倍體的核型，未代以內的細胞一般保持正常二倍體的核型，

9、未發(fā)生突變發(fā)生突變3 3、體細胞核移植方法生產的克隆動物是對體細、體細胞核移植方法生產的克隆動物是對體細胞供體動物進行了胞供體動物進行了100%的復制嗎？為什么？的復制嗎？為什么？不是，克隆動物絕大部分不是，克隆動物絕大部分DNADNA來自供體細胞核，但來自供體細胞核，但核外還有少部分核外還有少部分DNADNA（如線粒體（如線粒體DNADNA）來自受體卵）來自受體卵母細胞母細胞（三）體細胞核移植技術的應用（三）體細胞核移植技術的應用閱讀閱讀P49-501、畜牧業(yè)方面：、畜牧業(yè)方面：2、醫(yī)藥衛(wèi)生方面：、醫(yī)藥衛(wèi)生方面：可以加速家畜遺傳改良的進程，促進優(yōu)良畜群繁育?？梢约铀偌倚筮z傳改良的進程，促進優(yōu)

10、良畜群繁育。 保護瀕危物種，增加其存活數量保護瀕危物種，增加其存活數量生產醫(yī)用蛋白質生產醫(yī)用蛋白質 組織器官的移植組織器官的移植3、其他領域、其他領域了解胚胎發(fā)育及衰老過程了解胚胎發(fā)育及衰老過程更好追蹤研究疾病的發(fā)展過程、治療疾病更好追蹤研究疾病的發(fā)展過程、治療疾?。ㄋ模w細胞核移植技術存在的問題（四）體細胞核移植技術存在的問題1、成功率低、成功率低2、克隆動物存在健康問題、克隆動物存在健康問題三三.動物細胞融合動物細胞融合 原理原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞相互與細胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細胞相互凝集，細胞膜上的蛋

11、白質分子和脂質分子重凝集，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。新排布，細胞膜打開，細胞發(fā)生融合。 滅活滅活：用物理或化學手段使病毒或細菌失去：用物理或化學手段使病毒或細菌失去感染力，但是并不破壞這些病原體的抗原結感染力，但是并不破壞這些病原體的抗原結構。構。 概念概念：指兩個或多個動物細胞結合成一個細胞的：指兩個或多個動物細胞結合成一個細胞的過程。過程。 結果結果: :單核的雜交細胞。單核的雜交細胞。 原理原理：細胞膜的流動性。：細胞膜的流動性。 誘導的方法誘導的方法：物理法：離心，振動，電激：物理法：離心，振動，電激 化學法：化學法：PEGPEG 滅活的病毒滅活

12、的病毒注意：動物細胞融合需要把多個兩種細胞放在一起，讓他注意：動物細胞融合需要把多個兩種細胞放在一起，讓他們隨機融合，而從中篩選雜交細胞。們隨機融合，而從中篩選雜交細胞。意義：意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交突破了有性雜交方法的局限，使遠緣雜交( (種間，種間，屬間，科間，甚至動植物間）成為可能。屬間，科間，甚至動植物間）成為可能。四四. .單克隆抗體單克隆抗體1.傳統(tǒng)抗體的獲得方法：傳統(tǒng)抗體的獲得方法：長期以來，人們?yōu)榱双@得抗體，向動物體長期以來，人們?yōu)榱双@得抗體，向動物體反復反復注射注射某種抗某種抗原原，使動物產生抗體，從動物的，使動物產生抗體，從動物的血清血清中分離所需抗體，這

13、中分離所需抗體，這種方法種方法產量低，純度低且特異性差產量低，純度低且特異性差，反應不夠靈敏。，反應不夠靈敏。2.一個美麗的發(fā)現：一個美麗的發(fā)現：在動物發(fā)生免疫的過程中，體內的多種在動物發(fā)生免疫的過程中，體內的多種B淋巴可產生多達淋巴可產生多達百萬種以上的抗體，但是百萬種以上的抗體，但是每個每個B淋巴只分泌一種抗體淋巴只分泌一種抗體。要。要想獲得大量的單一抗體，必須用單個的想獲得大量的單一抗體，必須用單個的B淋巴進行無性生淋巴進行無性生殖，即克隆。殖，即克隆。B1B1B2B2B3B3B4B4B3B3B3B3 B3B3 3.3.一個大膽的猜想：一個大膽的猜想：將能夠將能夠產生特定抗體的產生特定抗

14、體的B淋巴細胞淋巴細胞與能在體外與能在體外大大量增殖的骨髓瘤細胞量增殖的骨髓瘤細胞進行融合，形成雜交進行融合，形成雜交瘤細胞。瘤細胞。 杰尼杰尼 丹麥丹麥 米爾斯坦米爾斯坦 英國英國 科勒科勒 德國德國注射抗原注射抗原B B淋巴細胞淋巴細胞骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞融合融合選擇性培養(yǎng)基篩選選擇性培養(yǎng)基篩選專一抗體檢驗陽性專一抗體檢驗陽性克隆化克隆化克隆化克隆化用有限稀釋法進行用有限稀釋法進行單克隆，再專一抗單克隆，再專一抗體檢驗陽性體檢驗陽性專一抗體檢驗陽性專一抗體檢驗陽性單克隆抗體單克隆抗體 細胞合成細胞合成DNADNA有有D D和和S S兩條途徑，其中兩條途徑，其中D D途徑能被途徑能被氨基喋呤

15、氨基喋呤阻斷。人淋巴細胞有這兩種途徑，但阻斷。人淋巴細胞有這兩種途徑，但一般不分裂增殖。骨髓瘤細胞中盡管沒有一般不分裂增殖。骨髓瘤細胞中盡管沒有S S途徑，途徑，但能不斷分裂增殖。將這兩種細胞在試管中混但能不斷分裂增殖。將這兩種細胞在試管中混合，加合，加PEGPEG促融，而后在培養(yǎng)液中加氨基喋呤。促融，而后在培養(yǎng)液中加氨基喋呤。B B淋巴細胞淋巴細胞D D途徑途徑S S途徑途徑骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞氨基喋呤氨基喋呤D D途徑途徑合成合成DNADNA 通過恰當的稀釋達到分離單個細胞進行培養(yǎng)通過恰當的稀釋達到分離單個細胞進行培養(yǎng)的目的。的目的。 （1 1）取出陽性孔的細胞數進行計數）取出陽性孔的細胞

16、數進行計數 （2 2）用培養(yǎng)液將其稀釋到）用培養(yǎng)液將其稀釋到10Cell10Cellmlml （3 3）如果在多孔板，每孔加）如果在多孔板，每孔加0.1ml0.1ml，其幾率，其幾率為每孔內落入一個細胞為每孔內落入一個細胞 （4 4）根據檢測的陽性結果可進行克隆化）根據檢測的陽性結果可進行克隆化 m mm m 4.單抗的制備過程： 1.1.抗原的制備抗原的制備 2.2.免疫動物免疫動物 3.3.免疫脾細胞和骨髓瘤細胞免疫脾細胞和骨髓瘤細胞 4.4.細胞融合細胞融合 5.5.雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng)雜交瘤細胞的選擇培養(yǎng) 6.6.雜交瘤細胞的篩選雜交瘤細胞的篩選 7.7.雜交瘤細胞的克隆化雜交瘤細胞的

17、克隆化 8.8.單克隆抗體的檢定單克隆抗體的檢定 9.9.分泌單克隆雜交瘤細胞系的建立分泌單克隆雜交瘤細胞系的建立 10.10.單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備5.單克隆抗體的概念： 由單個由單個B B淋巴細胞進行無性生殖形成的細胞群，淋巴細胞進行無性生殖形成的細胞群，產生的化學性質單一，特異性強的抗體。產生的化學性質單一，特異性強的抗體。6.6.優(yōu)點：優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，并可大量制備。特異性強，靈敏度高，并可大量制備。五五. .單克隆抗體的應用單克隆抗體的應用 1.1.作為診斷試劑作為診斷試劑準確，簡易，高效，快速準確，簡易，高效，快速 2.2.用于治療疾病和運載藥物用于治療疾

18、病和運載藥物用用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體制備成制備成“早早早孕診斷試劑早孕診斷試劑”。受精后不久，胎盤滋養(yǎng)層細胞會分泌受精后不久，胎盤滋養(yǎng)層細胞會分泌人絨毛膜促人絨毛膜促性腺激素（性腺激素（HCG)HCG)，是由受孕婦女體內胎盤產生的是由受孕婦女體內胎盤產生的一種糖蛋白類激素，在婦女的尿液中大量存在，一種糖蛋白類激素，在婦女的尿液中大量存在，而非妊娠婦女尿液中幾乎沒有。而非妊娠婦女尿液中幾乎沒有。早孕試紙利用早孕試紙利用抗人絨毛膜促性腺激素抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體單克隆抗體為配體，固定在層析住上，為配體，固定在層析住上，以以膠體金膠體金為指示標記，檢測

19、尿液中為指示標記，檢測尿液中HCGHCG濃度，來確定婦女是否懷孕。濃度，來確定婦女是否懷孕。陽性：出現兩條紅色條帶，一條位于陽性：出現兩條紅色條帶，一條位于對照區(qū)對照區(qū)C C，另一條位于檢測區(qū)，另一條位于檢測區(qū)T T，表明，表明已懷孕。已懷孕。陰性：僅在對照區(qū)陰性：僅在對照區(qū)C C出現一條紅性條帶，出現一條紅性條帶，在檢測區(qū)在檢測區(qū)T T無紅色條帶出現，表明未懷無紅色條帶出現，表明未懷孕。孕。無效：無效：5 5分鐘內在對照區(qū)分鐘內在對照區(qū)C C無紅色條帶無紅色條帶出現，則測試失效或試紙已失效。出現，則測試失效或試紙已失效。 甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFPAFP）是一種特異性較強的腫瘤標）是一種特異性較強的腫瘤標志物，用志物，用甲胎蛋白作為抗原免疫小鼠甲胎蛋白作為抗原免疫小鼠，制備制備抗抗AFPAFP單抗單抗，并與含有放射性同位素的標記物，并與含有放射性同位素的標記物連接，單克隆抗體攜帶放射性標記物通過全連接，單克隆抗體攜帶放射性標記物通過全身血液循環(huán)運送到所有組織，由于身血液循環(huán)運送到所有組織，由于腫瘤細胞腫瘤細胞表面的表面的AFPAFP會和單克隆抗體特異性結合會和單克隆抗體特異性結合，所以，所以放射性同位素標記物就不斷積累在腫瘤上，放射性同位素標記物就不斷積累在腫瘤上，通過一定的