第5章 農(nóng)藥殘留測(cè)定方法

1、第五章 農(nóng)藥殘留測(cè)定方法5.1 5.1 氣相色譜法氣相色譜法5.2 5.2 高效液相色譜法高效液相色譜法5.3 5.3 高效薄層色譜法高效薄層色譜法5.4 5.4 色譜色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)5.1 氣相色譜法（1）氣相色譜法基本術(shù)語(yǔ) 色譜圖：響應(yīng)信號(hào)時(shí)間or響應(yīng)信號(hào)載氣流出體積 基線：僅載氣載氣通過(guò)時(shí)檢測(cè)器所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)曲線 色譜峰：色譜柱流出組分組分通過(guò)檢測(cè)器時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)曲線 峰底：峰起點(diǎn)與終點(diǎn)之間連接的直線 峰高：色譜峰最高點(diǎn)到峰底的距離 峰寬：峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)間的距離 半高峰寬：峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直線與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)間的距離 峰面積（A

2、）：峰與峰底之間的面積（1）氣相色譜法基本術(shù)語(yǔ) 死時(shí)間tr0：不被固定相吸附或溶解的組分（如空氣）從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值之間的時(shí)間。 保留時(shí)間tr：組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值時(shí)所經(jīng)過(guò)的時(shí)間。 調(diào)整保留時(shí)間tr ：某組分的保留時(shí)間扣除死時(shí)間。p tr= tr - tr0 相對(duì)保留值：兩組分調(diào)整保留時(shí)間的比值，通常作為衡量固定相選擇性的指標(biāo)，又稱選擇因子。p 12rrtt例題 由以上氣相色譜圖及數(shù)據(jù)，求組分1和2的調(diào)整保留時(shí)間tr1和 tr2，并計(jì)算選擇因子 的值。（2）氣相色譜法的分配原理 氣相色譜分析的關(guān)鍵是物質(zhì)的分離問(wèn)題。怎樣實(shí)現(xiàn)兩物質(zhì)色譜峰的完全分離？ 分配系數(shù)K 分配比k，又稱為容量因子，組

3、分在兩相間分配平衡時(shí)，固定相和流動(dòng)相中的組分的質(zhì)量比，即（2）氣相色譜法的分配原理0rrmsttkmmk時(shí)間組分在流動(dòng)相中的滯留時(shí)間組分在固定相中的滯留組分在流動(dòng)相中的質(zhì)量組分在固定相中的質(zhì)量另可證明得出塔板理論的假設(shè)a. 在柱內(nèi)一小段長(zhǎng)度H內(nèi)，組分可以在兩相間迅速達(dá)到平衡，這一小段柱長(zhǎng)稱為理論塔板理論塔板高度高度H；b. 載氣進(jìn)入色譜柱不是連續(xù)進(jìn)行的，而是脈動(dòng)式，每次進(jìn)氣為一個(gè)塔板體積；c. 所有組分開(kāi)始時(shí)都集中于0號(hào)板上，而且組分的縱向擴(kuò)散可忽略；d. 分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無(wú)關(guān)。（3）塔板理論 在N為8和9時(shí)，組分從具有5塊塔板的柱中洗脫出來(lái)達(dá)到最大濃度。流出

4、曲線呈峰形，由于柱子的塔板數(shù)太少，峰形不對(duì)稱。當(dāng)塔板數(shù)n50時(shí)，就可以得到對(duì)稱的峰形曲線。在GC中，一般n值很大，約103106，因而流出曲線可趨于正態(tài)分布。理論塔板數(shù)塔板理論222222154. 51654. 516 kknttnnnnnLHwtwtnnLHwtwtnrreffeffeffeffhrbreffhrbr的關(guān)系：與有效塔板高度有效塔板數(shù)理論塔板高度理論塔板數(shù)n越大或H越小，則柱效越高。理論塔板數(shù)與選擇因子、分離度的關(guān)系p 選擇因子是固定液對(duì)兩個(gè)相鄰組分的調(diào)整保留時(shí)間之比。 越大，兩組分越易分離。柱溫降低柱溫降低， 增大，有利于分離和柱效率的提高。p 分離度R定義為兩個(gè)相鄰組分的保

5、留值之差與其平均峰寬值之比。R值越大，分離越好。R=1時(shí)，兩峰重疊約2%。通常降低柱溫，增加柱長(zhǎng)降低柱溫，增加柱長(zhǎng)，使兩峰間距增大，R提高，但又會(huì)使峰加寬，因此需進(jìn)行最優(yōu)化選擇。（3）塔板理論12rrtt2112211222/bbrrbbrrwwttwwttR理論塔板數(shù)與選擇因子、分離度的關(guān)系p理論塔板數(shù)n與選擇因子 、分離度R的關(guān)系：（3）塔板理論222221116116 kkRnRneff 范弟姆特（Van Deemter）速率理論： 塔板高度H-載氣線速度u關(guān)系 H = A + B/u + Cu（4）速率理論及影響柱效率的因素渦流擴(kuò)散項(xiàng)分子擴(kuò)散項(xiàng)傳質(zhì)阻力項(xiàng) 柱長(zhǎng)柱長(zhǎng)：柱長(zhǎng)可使理論塔板數(shù)n

6、 ，但峰寬，分析時(shí)間。 柱徑柱徑：柱徑小利于減少組分在柱內(nèi)的分子擴(kuò)散，提高柱效，但柱徑太小不利操作。填充柱的柱內(nèi)徑23mm為宜。 載氣及流速載氣及流速： H = A + B/u + Cu 柱溫柱溫：需綜合考慮。農(nóng)藥多殘留等多組分的分析通常采用程序升溫的辦法解決。 擔(dān)體擔(dān)體：粒度細(xì)小、裝填均勻有利于減小渦流擴(kuò)散項(xiàng)、提高柱效。一般粒度直徑為柱內(nèi)徑的1/201/25為宜。 氣化溫度氣化溫度：應(yīng)高于各組分最高沸點(diǎn)，保證瞬間氣化。 樣品進(jìn)樣量樣品進(jìn)樣量：不宜過(guò)大，進(jìn)樣量超過(guò)柱負(fù)荷，會(huì)降低柱效，色譜峰變寬。（5）操作條件的選擇GC檢測(cè)器 檢測(cè)器是測(cè)量柱后流出物質(zhì)成分和濃度變化的裝置，通過(guò)化學(xué)和物理作用，將

7、流出物質(zhì)成分和濃度的變化轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。濃度型檢測(cè)器濃度型檢測(cè)器熱導(dǎo)檢測(cè)器熱導(dǎo)檢測(cè)器電子捕獲檢測(cè)器電子捕獲檢測(cè)器質(zhì)量型檢測(cè)器質(zhì)量型檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)器氫火焰離子化檢測(cè)器火焰光度檢測(cè)器火焰光度檢測(cè)器氮磷檢測(cè)器氮磷檢測(cè)器熱導(dǎo)檢測(cè)器（熱導(dǎo)檢測(cè)器（TCD）濃度型檢測(cè)器通用型檢測(cè)器，對(duì)有機(jī)物和無(wú)機(jī)物都有響應(yīng)不破壞樣品，可收集餾分 缺點(diǎn)：靈敏度較低缺點(diǎn)：靈敏度較低p 原理：載氣中混入其他氣態(tài)物質(zhì)時(shí)熱導(dǎo)率發(fā)生變化。 載氣中無(wú)組分時(shí)，平衡電橋，無(wú)電壓信號(hào)輸出，記錄儀走直線（基線）。 載氣攜帶試樣組分時(shí)，電橋失去平衡，有電壓信號(hào)輸出，記錄儀記錄組分濃度隨時(shí)間變化的峰狀圖形。氫火焰離子化檢測(cè)器（氫火焰離子化檢測(cè)

8、器（FID）質(zhì)量型檢測(cè)器選擇型檢測(cè)器，對(duì)大多數(shù)有機(jī)化合物有響應(yīng)，對(duì)永久性氣體及H2S、H2O、NH3、CS2等在火焰中不電離的無(wú)機(jī)物無(wú)響應(yīng)靈敏度比熱導(dǎo)檢測(cè)器高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，可檢測(cè)ppb（10-3ppm）級(jí)的痕量物質(zhì) 缺點(diǎn)：破壞樣品，對(duì)無(wú)機(jī)物無(wú)響應(yīng)缺點(diǎn)：破壞樣品，對(duì)無(wú)機(jī)物無(wú)響應(yīng)p 原理：色譜柱流出物中可燃燒 有機(jī)物在氫-氧火焰中發(fā)生電離。 有機(jī)物CnHm在火焰中發(fā)生化學(xué) 電離： 化學(xué)電離產(chǎn)生的正離子（CHO+與H3O+）和電子（e）在外加恒定直流電場(chǎng)作用下分別向兩極定向移動(dòng)而產(chǎn)生微電流（10-710-14A）。微電流單位時(shí)間進(jìn)入離子室的被測(cè)組分質(zhì)量。COOHOH6CHOeCHOOCHCHHC322

9、mn（自由基）定性與定量分析p 定性分析的主要依據(jù)保留值 利用已知物直接對(duì)照定性 如果樣品比較復(fù)雜，可在未知混合物中加入已知純物質(zhì)，通過(guò)未知物中峰的變化，來(lái)確定未知物中成分。定性與定量分析p 定量分析的依據(jù)色譜峰的峰高或峰面積 外標(biāo)法：直接對(duì)比法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法例：例：已知敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)據(jù)如下表所示，另實(shí)驗(yàn)測(cè)得敵敵畏的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=2304.0 x-7.477，r=0.9999，分別用直接對(duì)比法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算樣品中的敵敵畏含量。敵敵畏敵敵畏含量（含量（mg/L）峰面積峰面積標(biāo)準(zhǔn)物0.050110.723樣品x150.509定性與定量分析p定量分析的依據(jù)在一定操作條件下，分析組分的質(zhì)量（mi）

10、或其在載氣中的濃度（Ci）與檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)（色譜峰的峰高h(yuǎn)i或峰面積Ai）成正比： mi = f i Ai 定量校正因子f i = mi /Ai（單位面積的組分含量） 由于f i受操作條件影響較大，測(cè)定比較困難，因此在實(shí)際工作中都使用相對(duì)校正因子fi ： 常用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：熱導(dǎo)池是苯，氫火焰是正庚烷。ississiisiiAmAmAmAmfff定性與定量分析p定量分析 內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法：在試樣中加入能與所有組分完全分離的已知量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，根據(jù)被測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量及其在色譜圖上相應(yīng)的峰面積求出某組分的含量。 內(nèi)標(biāo)法要求：內(nèi)標(biāo)物為樣品中不存在，且內(nèi)標(biāo)與其他組分可完全分離；內(nèi)標(biāo)峰與被測(cè)組分峰要靠近，內(nèi)標(biāo)

11、量也要接近被測(cè)組分含量，最少取三位有效數(shù)字。 內(nèi)標(biāo)法優(yōu)點(diǎn)是，定量準(zhǔn)確，可以抵消操作條件變化所產(chǎn)生的誤差；彌補(bǔ)了歸一化法使用限制上的不足。缺點(diǎn)是，每次分析需要用分析天平準(zhǔn)確稱量，不太方便。例題 有一試樣含甲酸、乙酸、丙酸及不少水、苯等物質(zhì)，稱取此試樣1.055g，以環(huán)己酮作內(nèi)標(biāo)，稱取0.1907g環(huán)己酮加到試樣中混合均勻后，吸取3L進(jìn)樣，得到色譜圖。從色譜圖上測(cè)得的各組分峰面積及已知的fi如下表所示，求甲酸、乙酸、丙酸的百分含量。甲酸甲酸乙酸乙酸環(huán)己酮環(huán)己酮丙酸丙酸峰面積峰面積14.872.613342.4相對(duì)校正因子相對(duì)校正因子fi3.831.781.001.07定性與定量分析p定量分析 歸一

12、化法歸一化法：樣品中的所有組分全部流出色譜柱，并在色譜圖上都出現(xiàn)色譜峰，可以通過(guò)各組分的校正因子和峰面積計(jì)算各組分的含量。%100%100%100%111niiiiiniiiiiniiiiAACffAfAmmC值相近，則：若各組分的例題 已知大米中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留色譜圖，經(jīng)測(cè)定各組分的值和峰面積如下表所示，用歸一化法計(jì)算在大米的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留中各組分所占的比例。敵敵畏敵敵畏 樂(lè)果樂(lè)果 甲基對(duì)硫磷甲基對(duì)硫磷殺螟硫磷殺螟硫磷對(duì)硫磷對(duì)硫磷 三唑磷三唑磷Ai342142787725047.3fi0.840.741.001.051.281.365.2 高效液相色譜法p 輸液系統(tǒng) 流動(dòng)相在轉(zhuǎn)入貯液器前必

13、須過(guò)濾和脫氣 梯度洗脫裝置：將兩種或兩種以上的不同極性的溶劑進(jìn)行混合，作為流動(dòng)相使用。p 進(jìn)樣系統(tǒng) 手動(dòng)六通進(jìn)樣閥：10、20、50、100L定量環(huán) 自動(dòng)進(jìn)樣器p 分離系統(tǒng)色譜儀的核心部分 保護(hù)柱起到保護(hù)分析柱作用，固體微粒、污染物首先被保護(hù)住擋住。p 檢測(cè)系統(tǒng) 將物理或化學(xué)特性轉(zhuǎn)變?yōu)榭商幚淼碾娦盘?hào)p 控制和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 由計(jì)算機(jī)和數(shù)據(jù)處理軟件組成HPLC常用檢測(cè)器p紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器（UV-VIS） 濃度型的選擇性檢測(cè)器 液相色譜應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器 具有紫外吸收能力的物質(zhì) 缺點(diǎn)：對(duì)紫外無(wú)吸收的物質(zhì)無(wú)響應(yīng)，對(duì)紫外有吸收的溶劑（如苯）不能用作流動(dòng)相。p紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器（UV-VIS） 光源光源

14、：氘燈（紫外光源）195400nm 鎢燈（可見(jiàn)光源）400850nm 透鏡透鏡：將光源射來(lái)的光束變?yōu)槠叫泄?遮光板遮光板：將平行光變?yōu)榧?xì)小平行光束 測(cè)量池測(cè)量池：通流動(dòng)相+檢測(cè)樣品 參比池參比池：通參比品（多為空氣） 濾光片濾光片：濾去非單色光 光電倍增管光電倍增管：接收信號(hào)5.3 薄層色譜法 薄層色譜法（Thin-Layer Chromatography, TLC） TLC是在平面上進(jìn)行分離的一種方法，又叫平面色譜法，采用液體作為流動(dòng)相，屬于液相色譜的范疇。 按其固定相的性質(zhì)和分離機(jī)理可分為： 吸附薄層法 分配薄層法 離子交換薄層法 凝膠薄層法應(yīng)用較為廣泛p吸附薄層法的原理吸附薄層法的原理

15、將吸附劑（固定相）均勻地涂布在玻璃、金屬等載板上形成薄層，在薄層的一端點(diǎn)上試樣溶液，置于展開(kāi)室中，將薄層的下端浸入合適的展開(kāi)劑（流動(dòng)相），借毛細(xì)作用使溶劑上升。試樣組分不斷地被吸附劑吸附，又被溶劑溶解解吸，隨展開(kāi)劑向前移動(dòng)，由于吸附劑對(duì)不同組分有不同的吸附能力，展開(kāi)劑也有不同的解吸能力，因此在流動(dòng)相向前移動(dòng)的過(guò)程中，不同組分移動(dòng)的距離不同，從而得到分離。 薄層分離是被分離物質(zhì)（樣品）、吸附劑（固定相）及展開(kāi)劑（流動(dòng)相）共同作用的結(jié)果。薄層制備點(diǎn)樣展開(kāi)定位 定性 定量薄層板的制備 玻璃板需光潔，否則吸附劑易脫落，大小由需求決定。p 軟板：吸附劑直接干法涂層p 硬板：吸附劑加黏合劑后濕法涂層 吸附

16、劑（固定相）：90%以上的分離都可應(yīng)用硅膠 常用黏合劑：煅石膏（煅石膏（CaSOCaSO4 41/2H1/2H2 2O O）機(jī)械強(qiáng)度差，易脫落，但不易腐蝕羧甲基纖維素鈉（羧甲基纖維素鈉（CMC-NaCMC-Na）機(jī)械強(qiáng)度好，不易脫落，但易腐蝕點(diǎn)樣 在薄層色譜技術(shù)中，點(diǎn)樣是造成定量誤差的主要來(lái)源。p 樣品溶液的制備：將樣品中的殘留農(nóng)藥定量地提取出來(lái)，配制成一定濃度的樣品溶液，常用溶劑為甲醇及乙醇。點(diǎn)樣后必須將溶劑全部除去后再進(jìn)行展開(kāi)。p 點(diǎn)樣技術(shù)點(diǎn)狀點(diǎn)樣和帶狀點(diǎn)樣，點(diǎn)樣體積和點(diǎn)樣量不宜過(guò)大，否則容易造成遠(yuǎn)點(diǎn)“超載”，展開(kāi)劑產(chǎn)生“繞行”現(xiàn)象，使斑點(diǎn)拖尾或重疊。點(diǎn)樣基線距底邊2.0cm，樣點(diǎn)直徑24

17、mm，點(diǎn)間距離1.52.0cm展開(kāi) 點(diǎn)樣后的薄層需置密閉并加有展開(kāi)劑的展開(kāi)室中進(jìn)行展開(kāi)。 展開(kāi)劑滲過(guò)薄層板的固定相，借毛細(xì)管作用力毛細(xì)管作用力的影響，樣品與展開(kāi)劑及固定相之間相互作用，使樣品中各成分沿展開(kāi)劑流動(dòng)的方向分開(kāi)。定性分析p斑點(diǎn)的比移值（Rf） 比移值是溶質(zhì)移動(dòng)距離與流動(dòng)相移動(dòng)距離之比，是薄層色譜的基本定性參數(shù)。 根據(jù)圖中所給數(shù)據(jù)，分別計(jì)算物質(zhì)A 和物質(zhì)B的Rf值。 Rf =0， Rf =1分別表示？的距離原點(diǎn)中心至流動(dòng)相前沿心的距離原點(diǎn)中心至組分斑點(diǎn)中fR定量分析p 間接定量（洗脫測(cè)定法） 取下斑點(diǎn)用溶劑洗脫化合物收集洗脫液分析測(cè)定。p 直接定量（原位薄層掃描法） 用薄層色譜掃描儀（

18、或薄層色譜光密度計(jì)）對(duì)薄層上被分離物質(zhì)進(jìn)行直接定量的方法。 基本測(cè)定原理：用一束具有一定波長(zhǎng)和強(qiáng)度的光照射到薄層斑點(diǎn)上進(jìn)行整個(gè)斑點(diǎn)的掃描，用儀器測(cè)量通過(guò)斑點(diǎn)或被測(cè)量通過(guò)斑點(diǎn)或被斑點(diǎn)反射的光束強(qiáng)度的變化斑點(diǎn)反射的光束強(qiáng)度的變化從而達(dá)到定量的目的。5.4 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 質(zhì)譜：化合物分子經(jīng)電離后，形成具有不同質(zhì)荷比（m/z）的離子，在質(zhì)量分析器的作用下按照其m/z大小分開(kāi)，到檢測(cè)器被檢測(cè)記錄下來(lái)而形成的譜圖。進(jìn)樣系統(tǒng)離子源質(zhì)量分析器離子檢測(cè)器數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)真空系統(tǒng)質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)質(zhì)譜儀的基本結(jié)構(gòu)質(zhì)譜（MS） 進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)：氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）和直接進(jìn)樣都可以作為MS的進(jìn)樣系統(tǒng)。 離子源離子源：使氣態(tài)分子電離成離子的裝置，MS的心臟。 質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器：將經(jīng)過(guò)電離加速的離子束按不同m/z分離，MS的分離系統(tǒng)。 離子檢測(cè)器離子檢測(cè)器：離子源產(chǎn)生的離子經(jīng)過(guò)質(zhì)量分析器被分離后到達(dá)接收檢測(cè)系統(tǒng)。p采用質(zhì)譜法對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行分析，通?？梢蕴峁┤缦滦畔ⅲ涸撧r(nóng)藥的相對(duì)分子量、分子式、分子結(jié)構(gòu)。氣相色譜氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS液相色譜液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀