基因工程與應(yīng)用

1、基因工程與應(yīng)用課程設(shè)計(jì)題目： 花香基因重組改善寵物體味 姓 名： 張超 學(xué) 號(hào)： 201004030122 班 級(jí)： 藥物制劑122班 指導(dǎo)教師： 張?chǎng)?2015 年 5 月 9日在狗胚胎中導(dǎo)入花香基因改善寵物體味一、 緒論轉(zhuǎn)基因技術(shù)是近年來研究最熱門 、發(fā)展最快的領(lǐng)域之一 。所謂轉(zhuǎn)基因動(dòng)物就是指用試驗(yàn)的方法將人們所需要的外源基因?qū)氲絼?dòng)物體內(nèi) , 使這種外源基因與動(dòng)物本身的染色體整合在一起 , 這樣外源基因就能隨著細(xì)胞的分裂而增殖 ,在動(dòng)物體內(nèi)得到表達(dá) , 并且能夠穩(wěn)定遺傳給后代的動(dòng)物 。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物自產(chǎn)生以來 , 隨著研究的不斷深入 ,近些年來得到了迅速的發(fā)展 。由于它打破了自然繁殖中的種間

2、隔離 ,使基因能在種系關(guān)系很遠(yuǎn)的機(jī)體間流動(dòng) , 實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物種間遺傳物質(zhì)的交換與重組 ,這不僅為遺傳物質(zhì)的研究提供了新的手段 ,豐富了物種的基因庫 , 而且擴(kuò)大了生命科學(xué)的視野 。寵物是人類的好朋友。它不僅能幫助人們解悶，還對(duì)人體健康具有重要作用。美國“網(wǎng)絡(luò)醫(yī)學(xué)博士網(wǎng)”列舉了寵物改善健康的27種好處。其中包括調(diào)節(jié)情緒，減輕壓力；穩(wěn)定血壓；降低膽固醇；有益心臟；治療抑郁；有益健身；促進(jìn)血液循環(huán)，降低中風(fēng)危險(xiǎn)；促進(jìn)主人們之間的人際交往，減少孤獨(dú)；減少孩子過敏癥，增強(qiáng)免疫力；用于診所和養(yǎng)老院有助于改善老年人以及患者情緒等等多種好處。但在養(yǎng)寵物特別是貓貓狗狗的過程中我們能感受到，寵物身上的異味讓很多愛貓

3、愛狗人士苦不堪言 ，主人們想盡辦法減輕寵物體味：定期洗澡、選擇清新體味的浴液甚至狗狗專用香水，但這也只能解決一時(shí)之需。隨著生活節(jié)奏的逐步加快，最需要養(yǎng)寵物緩解壓力的人群卻往往沒有時(shí)間打理寵物，導(dǎo)致很多人不得不放棄飼養(yǎng)寵物而失去一個(gè)改善健康提高生活質(zhì)量的機(jī)會(huì)。這一問題給基因工程的研究提出一個(gè)新思路，我們可以通過將控制花香的基因?qū)雽櫸锸芫阎?，調(diào)節(jié)控制花香基因的表達(dá)，使貓狗等天生便帶有體香，使更多需要寵物的人愿意去養(yǎng)寵物，使人類更加健康，社會(huì)更加和諧?，F(xiàn)以茉莉花香基因?qū)牍敷w內(nèi)進(jìn)行表達(dá)為例。二、設(shè)計(jì)過程： 2.1.提取目的基因獲取目的基因是實(shí)施基因工程的第一步。以雙瓣茉莉花瓣為材料，采

4、用 RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR） 和 RACE（cDNA末端快速克?。?技術(shù)相結(jié)合的方法，獲得茉莉花香氣形成限速酶，即5磷酸脫氧木酮糖合成酶（Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase，DXS）基因（命名為 JsDXS）。1、首先采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取茉莉花瓣總RNA，以總RNA為模板合成雙鏈cDNA。根據(jù)已報(bào)道的丹參、連翹、金等 DXS 基因序列，用 DNAMAN 設(shè)計(jì)出保守區(qū)簡并引物；DXS-R：5-TGGGA(T/C)GT(C/T)GG(T/C)CA(C/T)CAG(G/T)(C/T)-3DXS-F：5-GC(T/C)TC(G/A)TC

5、(A/T)GA(A/T)GGAGCCAT-3PCR 擴(kuò)增體系： dNTPs，模板，引物 DXS-R， 引物DXS-F，Ex-Taq 酶，MgCl2 95 預(yù)變性 5 min，95 變性 30 s，53 退火 45 s，72 延伸 90 s，35 個(gè)循環(huán)，最后72 延伸 10 min 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。2、根據(jù)保守區(qū)克隆結(jié)果分別設(shè)計(jì)特異性 5RACE 和 3RACE 引物5-DXS：5-AGTAGTTCGTGTATGACTGAGTTGGTGC-33-DXS：5-CATGCAAAGGGCTTATGACCAGGTAGTGC-3 退火溫度提高至 55 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。將獲得的全長 cDNA，在其

6、 ORF(開放閱讀框)兩端設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增全長序列。將保守區(qū)、5RACE 和 3RACE 序列拼接，得到茉莉花 DXS 基因 cDNA 全長 2505 bp。包含1個(gè)完整的閱讀框（232 2 380 bp），編碼 714 個(gè)氨基酸，該基因含有起始密碼子 ATG、終止密碼子TAA、16個(gè)A的PolyA 尾巴和AATAAA 加尾信號(hào)，并含有保守功能結(jié)構(gòu)域。2.2. 表達(dá)載體的構(gòu)建選用逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus,RV)載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體與其他用于真核表達(dá)的載體相比，具有以下優(yōu)點(diǎn): ( 1) 逆轉(zhuǎn)錄病毒寄主范圍廣泛; ( 2) 逆轉(zhuǎn)錄病毒具有強(qiáng)啟動(dòng)子，能夠高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因; ( 3) 具有

7、很高的病毒滴度及轉(zhuǎn)染效率， 且不會(huì)致死寄主細(xì)胞; ( 4) 對(duì)宿主細(xì)胞沒有毒副作用; ( 5) 可以攜帶較大的目的基因; ( 6) 只能感染分裂細(xì)胞( 7) 大多數(shù)情況下，其攜帶基因能夠在正常的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄病毒經(jīng)寄主細(xì)胞表面的受體蛋白識(shí)別后進(jìn)入細(xì)胞,然后在自身基因組編碼的反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以基因組RNA為模板反轉(zhuǎn)錄出雙鏈DNA。雙鏈DNA能夠隨機(jī)整合到寄主細(xì)胞的染色體上,隨著寄主細(xì)胞的復(fù)制而復(fù)制?；蚪M由3個(gè)結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env構(gòu)成,兩側(cè)有長末端重復(fù)序列(long terminal re-peat,LTR)。去除LTR及包裝信號(hào)序列(psi-site)外的所有基因,插入啟動(dòng)子和

8、抗性基因（氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因）, 利用限制性核酸內(nèi)切酶切開插入的氨芐青霉素抗性基因，將茉莉花JsDXS基因?qū)胍呀?jīng)被酶切開的青霉素抗性基因缺口處；利用T4連接酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行連接；將重組的RV利用影印得到含有JsDXS基因的重組載體,包裝病毒所需的結(jié)構(gòu)蛋白則由輔助病毒提供。利用抗生素抗性基因插入失活法實(shí)現(xiàn)含有目的基因的重組載體的篩選。2.3.將目的基因?qū)牍放咛ゼ?xì)胞內(nèi)直接將狗胚胎細(xì)胞與能釋放反轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共孵育,通過病毒將目的基因插入 ,隨著病毒 DNA的整合,目的基因也整合到靶細(xì)胞基因組并進(jìn)行表達(dá),完成基因轉(zhuǎn)移。再將帶有JsDXS基因的胚胎移植到懷孕的或假孕的

9、雌性狗體內(nèi)。2.4.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)對(duì)于子代動(dòng)物有可能并不會(huì)表達(dá)出外源基因，需要我們?cè)跇?gòu)建胚胎宿主細(xì)胞的時(shí)候可以大規(guī)模多數(shù)量進(jìn)行。對(duì)出生的幼畜進(jìn)行基因整合表達(dá)的檢測(cè)，把篩選出來的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁殖傳代培養(yǎng)，然后就可以建立轉(zhuǎn)基因種群的大量繁殖，即可生產(chǎn)帶有茉莉花體香的寵物狗。參考文獻(xiàn)（1）、茉莉花香氣相關(guān)基因 JsDXS 及其啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)分析 孫君，陳桂信等 園藝學(xué)報(bào) 2014，41（6）：12361244 （2）、植物花香代謝調(diào)節(jié)與基因工程研究進(jìn)展 趙印泉、周斯建等 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)2011，19( 4):381390（3）、基因治療的病毒載體系統(tǒng) 張嬋,邵艷軍 生物技術(shù)BIOTECHNOLOGY第17卷第1期:902007年2月（4）、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及其在動(dòng)物病毒病的