食品中蛋白質(zhì)的檢測

1、蛋白質(zhì)的檢測簡介蛋白質(zhì)是由氨基酸以“脫水縮合”的方式組成的多肽鏈經(jīng)過盤曲折疊形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。蛋白質(zhì)是由氨基酸按一定順序結(jié)合形成一條多肽鏈，再由一條或一條以上的多肽鏈按照其特定方式結(jié)合而成的高分子化合物。蛋白質(zhì)就是構(gòu)成人體組織器官的支架和主要物質(zhì)，在人體生命活動中，起著重要作用，可以說沒有蛋白質(zhì)就沒有生命活動的存在。每天的飲食中蛋白質(zhì)主要存在于瘦肉、蛋類、豆類及魚類中。性質(zhì)具有兩性 蛋白質(zhì)是由-氨基酸通過肽鍵構(gòu)成的高分子化合物，在蛋白質(zhì)分子中存在著氨基和羧基，因此跟氨基酸相似，蛋白質(zhì)也是兩性物質(zhì)。 可發(fā)生水解反應(yīng) 蛋白質(zhì)在酸、堿或酶的作用下發(fā)生水解反應(yīng)，經(jīng)過多肽，最后得到多種-氨基

2、酸。 蛋白質(zhì)水解時，應(yīng)找準(zhǔn)結(jié)構(gòu)中鍵的“斷裂點”，水解時肽鍵部分或全部斷裂。 溶水具有膠體的性質(zhì) 有些蛋白質(zhì)能夠溶解在水里（例如雞蛋白能溶解在水里）形成溶液。 蛋白質(zhì)的分子直徑達(dá)到了膠體微粒的大小（109107m）時，所以蛋白質(zhì)具有膠體的性質(zhì)。 蛋白質(zhì)沉淀 原因：加入高濃度的中性鹽、加入有機溶劑、加入重金屬、加入生物堿或酸類、熱變性 少量的鹽（如硫酸銨、硫酸鈉等）能促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解。如果向蛋白質(zhì)水溶液中加入濃的無機鹽溶液，可使蛋白質(zhì)的溶解度降低，而從溶液中析出，這種作用叫做鹽析 這樣鹽析出的蛋白質(zhì)仍舊可以溶解在水中，而不影響原來蛋白質(zhì)的性質(zhì)，因此鹽析是個可逆過程利用這個性質(zhì)，采用分段鹽析方法可以

3、分離提純蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的變性 在熱、酸、堿、重金屬鹽、紫外線等作作用下，蛋白質(zhì)會發(fā)生性質(zhì)上的改變而凝結(jié)起來這種凝結(jié)是不可逆的，不能再使它們恢復(fù)成原來的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的這種變化叫做變性蛋白質(zhì)變性之后，紫外吸收，化學(xué)活性以及粘度都會上升，變得容易水解，但溶解度會下降。 蛋白質(zhì)變性后，就失去了原有的可溶性，也就失去了它們生理上的作用因此蛋白質(zhì)的變性凝固是個不可逆過程 造成蛋白質(zhì)變性的原因 物理因素包括：加熱、加壓、攪拌、振蕩、紫外線照射、X射線、超聲波等： 化學(xué)因素包括：強酸、強堿、重金屬鹽、三氯乙酸、乙醇、丙酮等。 顏色反應(yīng) 蛋白質(zhì)可以跟許多試劑發(fā)生顏色反應(yīng)。 蛋白質(zhì)在灼燒分解時，可以產(chǎn)生一種燒焦羽

4、毛的特殊氣味檢測方法目前, 測定食品中蛋白質(zhì)含量的方法有多種, 一般可分為間接方法和直接方法。間接方法是通過測定樣品中蛋白質(zhì)的含氮量進(jìn)行推算蛋白質(zhì)含量的方法; 直接方法則是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì), 直接測定蛋白質(zhì)含量的方法。多年來, 利用蛋白質(zhì)的主要性質(zhì)( 如含氮量、肽鍵、折射率等) 和蛋白質(zhì)含有的特定氨基酸殘基( 如芳香基、酸性基、堿性基等) 來測定蛋白質(zhì)含量的方法不斷發(fā)展, 主要有凱氏定氮法( 國際經(jīng)典測定方法) 、分光光度法和滴定法等。1. 凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)最常用的方法是凱氏定氮法, 它是測定試樣中總有機氮最準(zhǔn)確和最簡單的方法之一, 是被國內(nèi)外作為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法。1 材料與方

5、法1.1 試驗材料1.1.1 試驗樣品肉禽制品（牛肉、馬肉、葷餃子餡）、豆制品（豆腐乳）、調(diào)味品（雞精）、乳制品（純牛奶）、糕點（面包）、植物蛋白飲料（椰汁）、冷飲及冰制品（雪糕、冰激淋）。1.1.2 試驗藥品和試劑所有試劑均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸；40氫氧化鈉溶液：稱取 40g 氫氧化鈉溶于 60ml 蒸餾水中；4硼酸溶液：稱取 4g 硼酸溶于蒸餾水中稀釋至 100ml；0.1mol/l 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液；甲基紅次甲基藍(lán)混合指示液：將次甲基藍(lán)乙醇溶液（1g/l）與甲基紅乙醇溶液（1g/l）按 12 體積比混合。1.1.3 儀器和設(shè)備實驗室常規(guī)儀器及下列各項

6、：凱氏燒瓶：500ml；可調(diào)式電爐；蒸汽蒸餾裝置；絞肉機：篦孔徑不超過 4nm；組織搗碎機；粉碎機；研缽：玻璃或瓷質(zhì)；化學(xué)消化器；凱氏定氮儀；空氣濾過器。1.2 試驗方法1.2.1 微量凱氏定氮法微量凱氏定氮法的原理：樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后取消化液的 1/10 加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計算出蛋白質(zhì)的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定 4 個步驟。2.1 微量凱氏定氮法的分析過程2.1.1 樣品消化步驟：準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，加入硫酸銅

7、 0.5g、硫酸鉀10g 和濃硫酸 20ml、玻璃珠數(shù)粒小心移入干燥潔凈的500ml 凱氏燒瓶中（固體或粉沫用紙卷成紙筒送入），輕輕搖勻，以 45°斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上用電爐以小火加熱（或先燒瓶放在距電爐較遠(yuǎn)處），待內(nèi)容物全部炭化、泡沫停止產(chǎn)生后加大火力（或?qū)糠旁陔姞t上），保持瓶內(nèi)液體微沸至液體變藍(lán)綠色透明后繼續(xù)加熱微沸 30min關(guān)閉電爐，取下瓶、冷卻轉(zhuǎn)移至 100ml 容量瓶中，加水定容。2.1.2 蒸餾與吸收按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至 2/3 容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠。在接受瓶中加入 10ml 40g/

8、l 硼酸及2 滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。準(zhǔn)確吸取消化液 10ml 于反應(yīng)管內(nèi)，經(jīng)漏斗再加入 10ml 氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水進(jìn)行蒸餾。指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾 10min，將冷凝管尖端提離液面繼續(xù)蒸 1min。2.1.3 滴定將接受瓶內(nèi)的硼酸液用 0.01mol/l 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至終點。同時做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。2.1.4 結(jié)果計算式中：W蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；c鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/l；V1空白滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，ml；V2試劑滴定消耗標(biāo)準(zhǔn)液量，ml；m樣品質(zhì)量，g；0.014氮的毫摩

9、爾質(zhì)量，g/mmol；F蛋白質(zhì)系數(shù)。2 雙縮脲法雙縮脲法對白蛋白、紅蛋白產(chǎn)生的顏色反應(yīng)相近, 不受溫度影響7, 可快速測定蛋白質(zhì)含量, 但靈敏度低, 測定范圍為120 mg 蛋白質(zhì)5, 適用于精度要求不高的蛋白質(zhì)含量的測定, 常用于谷物蛋白質(zhì)含量測定。三羥甲基氨基甲烷和一些氨基酸、EDTA 等會干擾該反應(yīng)1 實驗方法1.2.1標(biāo)準(zhǔn)樣品蛋白溶液的制備以大豆分離蛋白A為標(biāo)準(zhǔn)(凱氏定氮法測得蛋白質(zhì)含量為84·55% ),用0·05N氫氧化鈉溶液制成濃度為10、16mg/mL大豆分離蛋白樣品溶液。1·2·2雙縮脲試劑的配制稱0·375g硫酸銅(CuSO

10、4·5H2O)和1·5g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O),用125mL蒸餾水溶解,在攪拌下加75mL10% NaOH,用水稀釋到250mL,儲存于塑料瓶中(或內(nèi)壁涂有石蠟的瓶中),此時即可長期保存。若儲存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn),則需重新配置。1·2·3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取試管,分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL濃度為10mg/mL的大豆分離蛋白樣品溶液(相當(dāng)于含0、2、4、6、8、10mg蛋白質(zhì)),0.75、0.88、1.0mL濃度為16mg/mL樣品蛋白溶液(相當(dāng)于含12、14、16mg蛋白質(zhì)),用蒸餾水補足到1mL然后

11、加入4mL雙縮脲試劑。用漩渦混合器充分搖勻后,在室溫(2025)下放置30min,于540nm處進(jìn)行比色測定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。取三組測定的平均值,以蛋白質(zhì)的mg數(shù)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求回歸方程。1·2·4重復(fù)性分析及與凱氏定氮法比較取大豆分離蛋白樣品B、C、D、E 1g左右,配制樣品溶液,用雙縮脲法對同一樣品蛋白質(zhì)進(jìn)行重復(fù)測定,比較差異性。對大豆分離蛋白樣品F采用凱氏定氮法(GB/T5009·5-1985)和雙縮脲法測定其蛋白質(zhì)含量,每組實驗3個重復(fù)(n=3),用T檢驗對結(jié)果進(jìn)行比較,檢驗其差異性。3.甲醛值滴定法1

12、方法原理牛奶中蛋白質(zhì)含量與游離氨基酸含量呈良好的正相關(guān)。氨基酸為兩性電解質(zhì),在接近中性的水溶液中,全部解離為雙極離子。當(dāng)甲醛溶液加入后,與中性的游離氨基酸中非解離型氨基反應(yīng),生成單羥甲基和二羥甲基誘導(dǎo)體,使氨基酸失去氨基特性,游離的羧基(-COOH)可以用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液滴定,根據(jù)堿溶液的消耗量得出游離氨基酸含量,乘以經(jīng)驗常數(shù)計算出蛋白質(zhì)的含量。1.2儀器與試劑儀器堿式滴定裝置。樣品3個品牌的成品純牛奶和1個企業(yè)的鮮原料牛奶。試劑飽和草酸鉀溶液:330 g/L;酚酞指示液:5g/L,用乙醇溶液配制;氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液c(NaOH)=0.1 mol/L;氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液c(NaOH)=0.05 mo

13、l/L;中性甲醛水溶液。1.3測定方法準(zhǔn)確吸取奶樣10.0 ml于三角瓶中,加入0.5 ml飽和草酸鉀溶液和0.5 ml酚酞指示液,約2 min后用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至粉紅色。然后加入2 ml中性甲醛溶液,再用0.05 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至粉紅色,記錄滴定消耗的0.05 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。1.4結(jié)果表述牛奶中蛋白質(zhì)的含量X(g/100 ml) =C×V1×0·014×6·38×1005·006V×100式中:C氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度,單位為mol/L;V

14、1加入中性甲醛溶液后,滴定試樣消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積,單位為ml;0.0141ml 1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于氮的克數(shù);6.8氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù);100/5.06經(jīng)驗常數(shù),由本方法實測值與國標(biāo)法(凱氏定氮)測定值相比較計算得出;V樣品的體積,ml成品。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量方法：準(zhǔn)確稱取已搗碎的豬瘦肉樣品109，加入Zmol/LKOH溶液loml，于水浴上煮沸，經(jīng)一定時間使之完全水解后，冷卻，稀釋定容至200ml，以雙層濾紙過濾，棄去初濾液，吸取濾液lml，以0.lmol/LKOH溶液定容至SOml，以0.lmol/LKOH溶液作空白，調(diào)零，以ICm吸蛋白質(zhì)百分含量%，布1儡丫備粵又揣畏二器未)去等不又00一蒜x449式中w為樣品質(zhì)量(g);94.4%為典型豬瘦肉中酪氨酸的紫外吸收比;181.19為酪氨酸的摩爾質(zhì)量;11310為酪氨酸在波長24onm處的摩爾吸光系數(shù);3.37%為典型豬瘦肉中酪氨酸的百分含量。書是我們時代的生命別林斯基書籍是巨大的力量列寧書是人類進(jìn)步的階梯高爾基書籍是人類知識的總統(tǒng)莎士比亞