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文檔簡介

1、 物質(zhì)的提取質(zhì)粒DNA的提取1、 實(shí)驗(yàn)原理:質(zhì)粒是存在于染色體外、能獨(dú)立復(fù)制的雙鏈閉合的環(huán)狀DNA分子,以超螺旋的形式存在。在高pH值得NaOH和SDS溶液中,細(xì)菌細(xì)胞壁破裂,蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生變性。當(dāng)加入中和溶液后,變性的染色體DNA與蛋白質(zhì)纏繞形成大型復(fù)合體,被SDS包蓋,當(dāng)K 取代Na 時(shí),這些復(fù)合體會(huì)沉淀下來;而質(zhì)粒DNA雙鏈能夠迅速復(fù)性,呈溶解狀態(tài),留在上清液中。在上清液中加入乙醇,通過離心就可使質(zhì)粒DNA沉淀下來。2、 實(shí)驗(yàn)步驟 1.取1.5ml菌液,室溫下,12 000rpm,離心30秒。 2.棄上清,留沉淀,加入150l冰預(yù)冷的溶液I(已加入RNase A),劇烈震蕩,重懸沉淀

2、。 3.加入150l新配置的溶液II,快速顛倒混勻5次(注意:切勿震蕩?。糜诒?。 4.加入200l冰預(yù)冷的溶液III,反復(fù)顛倒數(shù)次混勻,冰浴5分鐘。室溫下,12 000rpm,離心5分鐘。 5.取上清,轉(zhuǎn)移到另一EP試管中,加等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),顛倒混勻有機(jī)相和水相,室溫下,12 000rpm,離心5分鐘。 6.將上清轉(zhuǎn)移到另一EP試管中,加等體積氯仿:異戊醇(24:1),顛倒混勻,室溫下,12 000rpm,離心2分鐘。 7.將上清轉(zhuǎn)移到另一EP試管中,加兩倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇,顛倒數(shù)次混勻,冰浴1015分鐘后,室溫下,12 000rpm,離心15分鐘。 8.棄

3、上清,留沉淀,加1ml75%乙醇洗滌,12 000rpm,離心2分鐘。 9.棄上清,室溫下,12 000rpm,離心30s,吸除乙醇,室溫干燥,使酒精充分揮發(fā)。 10.加20l TE,溶解沉淀。3、 實(shí)驗(yàn)討論 1.離心機(jī)需配平離心。 2.加入溶液III后,溶液中出現(xiàn)絮狀物,可以多離心1分鐘使溶液與絮狀物分離更徹底。 3.加入的酚使蛋白質(zhì)迅速變性,氯仿與異戊醇增強(qiáng)極性,純化酚,同時(shí)進(jìn)行有機(jī)抽提。 4.再次加入的氯仿與異戊醇為去除酚對(duì)實(shí)驗(yàn)后續(xù)產(chǎn)生的影響。 5.溶液I使沉淀重懸,其中Tris-Cl(pH8.0)為緩沖液;EDTA(pH8.0)為金屬螯合劑,防止DNA酶作用;RNase A則降解RNA

4、。 6.溶液II為實(shí)驗(yàn)提供堿性環(huán)境并裂解細(xì)胞。 7.溶液III中和溶液II并使質(zhì)粒DNA復(fù)性;其中KAC與SDS結(jié)合后離子置換成鉀鹽,因其水溶性低可以后續(xù)去除。 8.質(zhì)粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù),但提取方法有很多種,以下介紹一 種最常用的方法: 1)堿裂解法:此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取,提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀 染序列分析。方法如下:1、接1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2ml LB培養(yǎng)基。2、37振蕩培養(yǎng)過夜。3、 取1.5ml菌體于Ep管,以4000rpm離心3min,棄上清液。 4、加0.lml溶液I(1葡萄糖,50mM/L EDTA pH

5、8.0,25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH,1 SDS),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻,置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1預(yù)冷溶液III(5 mol/L KAc,pH4.8),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻,置于冰浴5 min 。 7、以10,000rpm離心20min,取上清液于另一新Ep管。8、加入等體積的異戊醇,混勻后于?0靜置10min。 9、再以10,000rpm離心20min,棄上清。10、用70乙醇05ml洗滌一次,抽干所有液體。11、待沉淀干燥后,溶于005mlTE緩沖液中。 2)煮沸法 1、將1.5ml培養(yǎng)液倒入eppen

6、dorf管中,4下12000離心30秒。 2、棄上清,將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘,使液體流盡。 3、將菌體沉淀懸浮于120ml STET溶液中, 渦旋混勻。 4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 渦旋振蕩3秒鐘。 5、將eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。 6、用微量離心機(jī)4下12000g離心10分鐘。 7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細(xì)菌碎片。8、取20ml進(jìn)行電泳檢查。 質(zhì)粒DNA的大量提取和純化。 *在制作酶譜、測定序列、制備探針等實(shí)驗(yàn)中需要高純度、高濃度的質(zhì)粒DNA,為此需要大量提取質(zhì)粒 DNA。大量提取的質(zhì)粒DNA一般需進(jìn)一步純化,常用柱層析

7、法和氯化絕梯度離心法。 3)堿法1、取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長后期的含pBS質(zhì)粒的細(xì)菌培養(yǎng)液250ml,4下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管 倒置使上清液全部流盡。2、將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50ml用冰預(yù)冷的STE中(此步可省略)。3、同步驟1方法離心以收集細(xì)菌細(xì)胞。4、將細(xì)菌沉淀物重新懸浮于5ml溶液I中,充分懸浮菌體細(xì)胞。5、加入12ml新配制的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數(shù)次,以充分混勻內(nèi)容物,冰浴10分鐘。 6、加9ml用冰預(yù)冷的溶液III, 搖動(dòng)離心管數(shù)次以混勻內(nèi)容物,冰上放置15分鐘,此時(shí)應(yīng)形成白色絮狀沉淀。 7、4下5000g離心15分鐘。 8、取上清液,加入50ml RN

8、A酶A(10mg/ml), 37水浴20分鐘。9、 加入等體積的飽和酚/氯仿,振蕩混勻,4下12000g離心10分鐘。 10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振蕩混勻,4下12000g離心10分鐘。 11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分鐘。 12、4下12000g離心15分鐘, 沉淀用數(shù)ml 70%冰冷乙醇洗滌,4下12000g離心5分鐘。13、 真空抽干沉淀,溶于500ml TE或水中。小鼠肝組織總RNA的提?。═rizol法)1 實(shí)驗(yàn)原理Trizol是由異硫氰酸胍和苯酚配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑,在勻漿和裂解

9、的過程中,能在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其他成分的同時(shí)保持RNA的完整性。在氯仿抽提、離心分離后,RNA處于水相中,將水相轉(zhuǎn)移后用異丙醇沉淀RNA。2 操作步驟 1.取50100mg新鮮小鼠肝組織置于用DEPC 水處理過的玻璃勻漿管中,加入1ml Trizol充 分勻漿,室溫靜置5分鐘,4攝氏度,12000rpm離心10分鐘。 2.上清液移至一新的用DEPC處理過的1.5ml離心管中,加入氯仿至1.5ml,劇烈震蕩15秒, 室溫靜置2分鐘。4攝氏度,12000rpm離心15分鐘。 3.小心將上清液無色水相移至一新的離心管(DEPC處理)中,加入異丙醇至1.5ml,顛倒 混勻數(shù)次,室溫靜置10分鐘,放入

10、冰箱保存待用。 4.加入1ml 75%乙醇,輕輕洗滌沉淀。4攝氏度,7500rpm離心5分鐘,棄上清。 5.晾干沉淀(不要過干,否則不易溶解),加入20lDEPC 水溶解RNA。3 注意事項(xiàng) 1.提取RNA時(shí)最關(guān)鍵的因素是盡量避免RNA酶的污染。在實(shí)際的操作中應(yīng)遵循以下指南: (1)全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和真菌,可能污染RNA的抽提并提成為 RNA酶的來源。 (2)使用滅菌的,一次性的塑料器皿和自動(dòng)吸管抽提RNA,避免使用公共儀器所導(dǎo)致的 RNA酶交叉污染。 (3)玻璃器皿在洗干凈并用蒸餾水沖洗后,在150攝氏度的烘箱中烘烤6小時(shí)。 2.實(shí)驗(yàn)中各步操作在冰浴中進(jìn)行。 3.酚具有高

11、度腐蝕性,容易引起嚴(yán)重的灼傷。在操作過程中,如果皮膚沾污了酚,應(yīng)立即 用水徹底沖洗,并用肥皂或稀釋的蘇打水洗滌。切記不能用酒精擦洗。4 實(shí)驗(yàn)討論 1.DEPC是強(qiáng)烈的烷化劑,通過與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制RNA酶活 性,是消除外源性RNA酶的主要方法。但CEPC有致癌作用,并具有很強(qiáng)的反應(yīng)性,因 此注意: 使用時(shí),不直接接觸 DEPC處理的器皿和水必須經(jīng)高壓滅菌處理,使DEPC分解后使用。 為避免酶蛋白反復(fù)凍溶而失去活性,酶制劑溶于50的甘油中,-20oC儲(chǔ)存可保持液 狀。但高濃度的甘油對(duì)酶促反應(yīng)有抑制作用,因此酶的用量不能超過反應(yīng)體積的1/10。 在進(jìn)行各種酶促反應(yīng)時(shí),應(yīng)首

12、先加水,再加入其它成分,最后加酶。 2.為何無RNA沉淀:勻漿不完全時(shí),基因組DNA分子仍然很大,溶液粘稠。變性的蛋白質(zhì)和基因組DNA一起形成絮狀凝集物容易包裹RNA,使之不能有效地釋放到溶液中。 3.RNA抽提率低的原因:樣品均化或裂解不完全: 勻漿不完全時(shí),RNA分子易被蛋白質(zhì)和基因組DNA復(fù)合物包裹,不能被有效釋放。終RNA不完全溶解:未溶解的RNA丟失。 4.RNA降解原因:從動(dòng)物體取下的組織沒有立即進(jìn)行抽提或冰凍保存。水溶液或試管污染有RNA酶。加氯仿后離心收集上清時(shí),吸到中間蛋白質(zhì)。操作時(shí)沒戴手套,口罩。 5.DNA污染的原因:樣品勻漿化時(shí)所加的TRIZOL量太少。 人組培組織基因

13、組DNA的提取 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?真核生物基因組DNA的提取2、 實(shí)驗(yàn)原理真核生物基因組DNA以核蛋白形式存在于細(xì)胞核中,制備DNA的原則是既要將蛋白質(zhì)、脂類、糖類等物質(zhì)分離干凈。又要盡可能保持DNA分子的完整。為了從組織中獲得純凈和大分子量的DNA,本實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合采用勻漿、蛋白酶K和去污劑溫和處理法。在提取DNA的反應(yīng)體系中,勻漿起到破壞細(xì)胞膜和核膜的作用,SDS進(jìn)一步協(xié)助破膜過程,并將組蛋白從DNA分子上拉開。SDS及EDTA抑制細(xì)胞中DNA酶的活性,蛋白酶K將所有蛋白降解成小肽和氨基酸,隨后用酚-氯仿抽提,將蛋白質(zhì)和DNA分離,得到較純的DNA分子。3、 操作步驟 1.取動(dòng)物新鮮組織約50mg

14、,用預(yù)冷的生理鹽水洗去表面殘血,剪碎,加入45l STE裂解液和50l 10% SDS至濃度為0.5%,勻漿后再加入10mg/ml的蛋白酶K 5l至終濃度為100l/ml,置55水浴箱保溫3小時(shí)。(老師預(yù)先準(zhǔn)備) 2.取500l反應(yīng)液加入等體積TrisCl(pH8.0)飽和酚,顛倒混勻10分鐘,4000rpm離心5分鐘。 3.取上層粘稠水相,加入酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)溶液至1ml,顛倒混勻10分鐘,4000rpm離心5分鐘。 4.取上層水相,加氯仿:異戊醇(24:1)溶液至1ml,顛倒混勻5分鐘,4000rpm離心5分鐘。 5.取上層水相,加1/10體積pH5.2的3M NaAC,

15、加入預(yù)冷的無水乙醇至1ml,緩慢搖動(dòng)均勻,可見乳白色絲狀DNA沉淀出現(xiàn),12 000rpm離心15分鐘。 6.棄上清,向沉淀中加75%乙醇500l漂洗,12 000rpm離心3分鐘。 7.棄上清,沉淀室溫干燥,加入100lTE溶解。4、 實(shí)驗(yàn)討論 1、 裂解液要預(yù)熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進(jìn)DNA溶解. 2、 酚一定要堿平衡.苯酚具有高度腐蝕性,飛濺到皮膚、粘膜和眼睛會(huì)造成損傷,因此應(yīng)注意防護(hù).氯仿易燃、易爆、易揮發(fā),具有神經(jīng)毒作用,操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù). 3、 各操作步驟要輕柔,盡量減少DNA的人為降解. 4、 取各上清時(shí),不應(yīng)貪多,以防非核酸類成分干擾. 5、 異丙醇,乙醇.NaA

16、c,KAc等要預(yù)冷,以減少DNA的降解,促進(jìn)DNA與蛋白等的分相及DNA沉淀. 6、 提取DNA過程中所用到的試劑和器材要通過高壓烤干等辦法進(jìn)行無核酸酶化處理. 7、 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制. 8、分離純化核酸總的原則: 應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性;排除其它分子的污染(蛋白質(zhì)、脂類、糖、有機(jī)溶劑、金屬離子、外源DNA、RNA等) 。 9、核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求: 核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子; 其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度;排除其它核酸分子的污染。 10、核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng): 盡量簡化操作步驟,縮短提取過程。 減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解(如過量

17、酸堿) 減少物理因素對(duì)核酸的降解:機(jī)械剪切力(強(qiáng)烈震蕩、滲透壓急劇改變、反復(fù)凍融)和高溫 防止核酸的生物降解(核酸酶的預(yù)防) 。 11、核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑 蛋白質(zhì)變性劑的作用: 使蛋白質(zhì)變性、沉淀,從核酸提取液中分離除去,以防造成蛋白污染。 使蛋白質(zhì)變性,故可使核糖體解聚釋放出核酸。 某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。 如:苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC 12、DNA提取常見問題 DNA樣品不純,抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。 原因:(1)DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì) (2)DNA在溶解前,有酒精殘留,酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng) (3)DNA中殘留有金屬離子 對(duì)策:(

18、1)重新純化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì) (2)重新沉淀DNA,讓酒精充分揮發(fā) (3)增加70乙醇洗滌的次數(shù)(2-3次) DNA降解 原因:(1)材料不新鮮或反復(fù)凍融 (2)未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性 (3)提取過程操作過于劇烈,DNA被機(jī)械打斷 (4)外源核酸酶污染 (5)反復(fù)凍融 對(duì)策:(1)盡量取新鮮材料,低溫保存材料避免反復(fù)凍融 (2)液氮研磨或勻漿組織后,應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液 (3)在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí),可增加裂解液中螯合劑的含量 (4)細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔 (5)所有試劑用無菌水配制,耗材經(jīng)高溫滅菌 (6)將DNA分裝保存于緩沖液中,避免反復(fù)

19、凍融 DNA提取量少 原因:(1)實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少 (2)破壁或裂解不充分 (3)沉淀不完全 (4)洗滌時(shí)DNA丟失 對(duì)策:(1)盡量選用新鮮(幼嫩)的材料 (2)動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分;G菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁 (3)高溫裂解時(shí),時(shí)間適當(dāng)延長(對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量) (4)低溫沉淀,延長沉淀時(shí)間 (5)加輔助物,促進(jìn)沉淀 (6)洗滌時(shí),最好用槍頭將洗滌液吸出,勿傾倒 人-actin基因片段的PCR擴(kuò)增1、 實(shí)驗(yàn)原理 PCR技術(shù)是在模板DNA、引物、和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下,TaqDNA聚合酶催化的DNA體外擴(kuò)增方法,用于檢測微量DNA。PCR技術(shù)的特異性

20、決定于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)過程如下:(1) 變性:通過熱變性95度DNA雙鏈之間的堿基氫鍵斷裂形成單鏈DNA。(2) 退火:在溫度降低的情況下,模板DNA通過堿基互補(bǔ)與引物形成雜交鏈,實(shí)驗(yàn)所用的溫度為五十五度。(3) 延伸:在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷酸及鎂離子的存在下,一引物為起點(diǎn),沿5到3的方向合成DNA新鏈。以上三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán),每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板,進(jìn)行36個(gè)循環(huán)后,兩個(gè)引物之間的片段得到了大量的擴(kuò)增。人-actin為細(xì)胞內(nèi)比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì),其基因總長為3065bp,含六個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子,實(shí)驗(yàn)選用第四個(gè)外顯子的部分設(shè)計(jì)引物。上游引物:5-GAGACCT

21、TCAACACCCCAGCC-3下游引物:5-TCAGGGCAGCGGAACCGCTCA-3通過PCR擴(kuò)增,使其之間的404bp的片段得以大量擴(kuò)增。2、 操作步驟 (1) 在無菌dorf管中依次加入PCRmax17l、引物1 1l、引物2 1l、模板1l,總體積為20l. 將反應(yīng)緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶混合后再加入溴酚藍(lán)指示劑共17l稱為PCRmax。(2) 離心混勻后,將dorf管放入PCR儀。(3) 進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件為: 1)九十五度預(yù)變性五分鐘。 2)九十四度變性40秒,五十五度退火40秒,七十二度延伸1分鐘,循環(huán)36次。3) 七十二度延伸5分鐘。 三、實(shí)驗(yàn)討論1. 引物有

22、多種設(shè)計(jì)方法,由PCR在實(shí)驗(yàn)中的目的決定,但基本原則相同。PCR所用的酶主要有兩種來源:Taq和Pfu,分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇。2. 緩沖液的成分最為復(fù)雜,除水外一般包括四個(gè)有效成分:緩沖體系,一般使用HEPES或MOPS緩沖體系;一價(jià)陽離子,一般采用鉀離子,但在特殊情況下也可使用銨根離子;二價(jià)陽離子,即鎂離子,根據(jù)反應(yīng)體系確定,除特殊情況外不需調(diào)整;輔助成分,常見的有DMSO、甘油等,主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。3. 引物設(shè)計(jì)的基本原則引物長度:15-30bp,常用為2

23、0bp左右。引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,尤其是避免3 端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,引物3末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列,否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),最佳選擇是G和C。引物的5 端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn),引入突變位點(diǎn),用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記,加入其它短序列,包括起始密碼子、終止密碼子等。、4

24、. PCR技術(shù)的特點(diǎn) 特異性強(qiáng),靈敏度高,簡單快速5. 常見問題1)假陰性不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備,引物的質(zhì)量與特異性,酶的質(zhì)量及溴乙錠的使用, PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模板:模板中含有雜蛋白質(zhì),模板中含有Taq酶抑制劑,模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白,在提取制備模板時(shí)丟失過多,或吸入酚。模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。2)假陽性出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更

25、整齊,亮度更高。3)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有:必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性,65左右退火與延伸)。4) 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶5) PCR擴(kuò)增有時(shí)

26、出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有:減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。物質(zhì)的鑒定將上三次實(shí)驗(yàn)中得到的質(zhì)粒DNA、小鼠肝臟RNA、PCR擴(kuò)增所得的產(chǎn)物在凝膠電泳上鑒定一、瓊脂糖凝膠電泳鑒定 瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物,應(yīng)選用電泳純的,瓊脂糖此級(jí)產(chǎn)品篩除了抑制物和核 酸酶,而且用溴化乙錠染色后熒光背景最小。 (1)瓊脂糖凝膠電泳裝置 由于瓊脂糖凝膠電泳既要求不高,而適應(yīng)性又強(qiáng),在過去20年里已成功地設(shè)計(jì)了形形色色及大大小小 的電泳槽。對(duì)這些裝置的選擇主要是依據(jù)個(gè)人的喜惡。使用最普遍的裝置是Walter Schaffner發(fā)明的水 平板凝膠。 水平板凝膠通常在一塊可安放于電泳槽平臺(tái)的玻璃板或塑料盤上灌制。在有些裝置中,則可將凝膠直 接鋪在平臺(tái)上。凝膠恰好浸在緩沖液液面下進(jìn)行電泳。凝膠的電阻幾乎與緩沖液的電阻相同,所以有 相當(dāng)一部分的電流將通過凝膠的全長。 (2)瓊脂糖凝膠的制備 瓊脂糖凝膠的制備是將瓊脂糖在所需緩沖液中熔化成清澈、透明的溶液。然后將熔化液倒入膠模中,令其固化。凝固后,瓊脂糖形成一種固體基質(zhì),其密度取決于瓊脂糖的濃度。通貫?zāi)z的電

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