精化13級-精化產(chǎn)品綜合分析及質(zhì)量控制(含化妝品微生物)-實訓(xùn)指導(dǎo)書

1、中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院實訓(xùn)教學(xué)指導(dǎo)書系 別： 生物醫(yī)藥系 指導(dǎo)教師： 楊懋勛 職 稱： 副教授 學(xué) 期： 20152016學(xué)年 一 學(xué)期精化產(chǎn)品綜合分析及質(zhì)量控制（含化妝品微生物） 實訓(xùn)指導(dǎo)書實訓(xùn)一 玻璃器皿的清洗、包扎和干熱滅菌一、實訓(xùn)目的1、能說出微生物實訓(xùn)所需的各種常用器皿名稱和規(guī)格。2、會清洗各種常用的玻璃器皿。3、能對玻璃器皿進(jìn)行干熱滅菌操作 。二、實訓(xùn)器材1、常用各種玻璃器皿。2、清洗工具和去污粉、肥皂、洗滌液。3、電熱干燥箱。三、實訓(xùn)原理為了保證實訓(xùn)順利進(jìn)行，要求把實訓(xùn)用器皿清洗干凈。保持滅菌后無菌狀態(tài)，需要對培養(yǎng)皿、吸管等進(jìn)行妥善包扎。試管和三角瓶要做棉塞。這些工作看來很普通，如

2、操作不當(dāng)或不按規(guī)定要求去做，會導(dǎo)致實訓(xùn)的失?。∫虼藨?yīng)看作是微生物實訓(xùn)的基本操作。四、實訓(xùn)步驟（一）器皿洗滌的注意事項和方法1、任何洗滌方法，都不應(yīng)對玻璃器皿有所損傷，所以不能用有腐蝕作用的化學(xué)藥劑，也不能使用比玻璃硬度大的物品來擦拭玻璃器皿。2、一般新的玻璃器皿用12%的鹽酸溶液浸泡數(shù)小時（2-6h），用水充洗干凈。3、用過的器皿應(yīng)立即洗滌，有時放置太久會增加洗滌困難。4、難洗滌的器皿不要與易洗滌的器皿放在一起。有油的器皿不要與無油的器皿放在一起，否則使本來無油的器皿也沾上了油垢，浪費藥劑和時間。5、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、瓊脂等腐蝕、阻塞管道的物質(zhì)不能直接倒在洗滌槽內(nèi)，必須倒在廢缸內(nèi)或指定的地方。6、含

3、有瓊脂培養(yǎng)基的器皿，可先用小刀或鐵絲將器皿中的瓊脂培養(yǎng)基刮去，或把它們用水蒸煮，待瓊脂融化后趁熱倒出，然后用水洗滌。7、一般的器皿都可用去污粉、肥皂或配成5%熱肥皂水來清洗，油質(zhì)很重的器皿，應(yīng)先將油層擦去。8、如果器皿沾有煤膏、焦油及樹脂類的一些物質(zhì)，可用濃硫酸或40%的氫氧化鈉液洗，或用洗滌液浸泡。9、當(dāng)器皿上沾有蠟或油漆等物質(zhì)，用加熱方法使之融化揩去，或用有機(jī)溶劑（苯、二甲苯、丙酮、松節(jié)油等）拭揩。10、洗滌后的器皿達(dá)到玻璃能被水均勻濕潤而無條紋和水珠。11、載玻片或蓋玻片可先在2%鹽酸溶液中浸1小時，然后在水中沖洗23次，最后用蒸餾水洗23次，洗后烘干冷卻或浸于95%酒精中保存?zhèn)溆谩Ｓ眠^

4、的載玻片或蓋玻片，先擦去油垢，再放在5%肥皂水中煮10分鐘后，立即用清水沖洗，以后放在洗滌液（稀釋）中浸泡2小時，再用清水洗至無色為止，最后用蒸餾水洗數(shù)次，干后浸于95%酒精中保存?zhèn)溆谩?2、凡遇有傳染性材料的器皿，洗滌前應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后清洗。【一般玻璃器皿洗滌操作要點】：（1） 用試管刷蘸取少量去污粉反復(fù)刷洗器皿2-3次。（2） 用自來水沖洗2-3次。（3） 用少量蒸餾水或去離子水蕩洗1-2次，控干水分。（二）器皿干燥洗干凈的玻璃器皿，一般是在室溫下自然干燥。若急需使用或需要高溫干燥，可使用電熱干燥箱干燥，溫度一般在105120烘0.51h。（使用干燥箱時應(yīng)注意，要在溫度下降到60以下再打開箱

5、門，取出器皿使用）。知識拓展：玻璃稱量瓶等在烘干后要放在干燥器中冷卻和保存；帶實心玻璃蓋的及厚壁儀器烘干時要注意慢慢升溫并且溫度不可過高，以免破裂。量器不可放在烘箱中烘，硬質(zhì)試管可用酒精燈加熱烘干，要從底部烤起，把管口向下，以免水珠倒流把試管炸裂，烘到無水珠后把試管口向上趕凈水氣。（三）器皿包扎為了滅菌后仍保持無菌狀態(tài)，各種玻璃器皿均需包扎。1、培養(yǎng)皿：洗凈烘干后每7套迭在一起，用牢固的紙卷成一筒，外面用繩子捆扎，以免散開，然后進(jìn)行滅菌。到使用時在無菌環(huán)境中才打開取出培養(yǎng)皿。2、吸管：洗凈烘干后的吸管，在口吸的一端用尖頭攝子或針塞入少許脫脂棉花，以防在使用時造成污染。塞入棉花的量要適宜，棉花不

6、宜露在吸管口的外面，多余的棉花可用酒精燈的火焰把它燒掉。每支吸管用一條寬約4-5厘米，以30-50左右的角度螺旋形卷起來，吸管的尖端在頭部，吸管的另一端用剩余紙條迭打結(jié)，不使散開，標(biāo)上容量。若干支吸管扎成一束，滅菌后，同樣要在使用時才從吸管中間擰斷紙條抽去吸管（見下圖）。3、試管和錐形瓶：試管和三角瓶都要作合適的棉花塞。棉花塞的作用是起過濾作用，避免空氣中的微生物進(jìn)入試管或三角瓶。棉塞制作方法如下圖所示。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。棉塞過緊易擠破管口和不易塞入，過松易掉落和污染。要使棉塞總長約2/3至3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以

7、防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。合格的棉塞不合格的棉塞 具體可參考視頻“學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)的基本技術(shù)”（09：1809：55）。若干支試管用繩子扎在一起，在棉花塞部分用報紙或包扎紙包扎，再在紙外用繩扎緊。具體請參考視頻：“器皿包扎”、“微生物檢驗準(zhǔn)備工作”。（四）干熱滅菌使玻璃器皿達(dá)到無菌狀態(tài)叫滅菌，玻璃器皿主要用電熱干燥箱進(jìn)行滅菌。1、干燥箱滅菌的物品放在箱內(nèi)，堆置時要留空隙勿使接觸四壁，關(guān)閉箱門。2、接通電源，控溫儀上有數(shù)字顯示。3、按SET鍵進(jìn)入溫度設(shè)定，將溫度設(shè)定為160（160-170）。再按SET鍵進(jìn)入時間設(shè)定，將時間設(shè)

8、定為80min（1-2h）4、切斷電源，冷卻到60以下時，才能把箱門打開，取出滅菌物品。干凈的玻璃器皿及其它耐熱器皿等一般都可用此法滅菌。但培養(yǎng)基和其它不耐熱的橡皮塞等不可用此法滅菌。五、實訓(xùn)作業(yè) 認(rèn)真完成實訓(xùn)記錄報告。附：鉻酸洗液配方及配法。濃配方：重鉻酸鉀（工業(yè)用） 40.0克蒸餾水 160.0毫升濃硫酸（粗） 800.0毫升稀配方：重鉻酸鉀（工業(yè)用） 50.0克蒸餾水 850.0毫升濃硫酸（粗） 100.0毫升配法：將重鉻酸鉀溶解在蒸餾水中（可加熱），待冷卻后，再慢慢地加入濃硫酸，邊加邊攪拌，配好后存放備用。此液可使用很多次，每次用后倒回瓶中貯存，直至洗滌液變成青褐色時才失去效用。器皿上

9、有大量有機(jī)質(zhì)時，不可直接用洗滌液來洗滌，應(yīng)盡量先行清除后再用，否則洗滌液很快會失效。洗滌液不能用手洗滌金屬器皿，洗滌液有強(qiáng)腐蝕性，如濺于桌椅上，應(yīng)立即用水沖洗，然后用碳酸鈉溶液或氨水洗。實訓(xùn)二 固體培養(yǎng)基的制備及滅菌一、實訓(xùn)目的1、能說出培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制過程。2、能說出加壓蒸汽滅菌鍋的原理并能熟練操作該設(shè)備。二、實訓(xùn)器材1、儀器設(shè)備：錐形瓶、量筒、移液管、燒杯、棉花、玻璃棒、pH試紙、電爐或電熱套、天平、藥勺、包扎紙、棉繩、標(biāo)簽紙、電烘箱、高壓滅菌鍋。2、試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水、NaOH溶液（1mol/L），HCl溶液（1mol/L）。三、實訓(xùn)原理1.培養(yǎng)

10、基：用人工方法將多種營養(yǎng)物質(zhì)按微生物生長代謝的需要配制成的一種營養(yǎng)基質(zhì)。2.培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)來源：水，碳源，氮源，礦質(zhì)營養(yǎng)，生長因素或生長因子。3.培養(yǎng)基的分類：按照配制培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)來源可分為：（1）天然培養(yǎng)基 ：利用天然的有機(jī)物配制而成的培養(yǎng)基。如：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。 （2）半合成培養(yǎng)基：既有天然物質(zhì)又含化學(xué)試劑的培養(yǎng)基稱半合成培養(yǎng)基。如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。（3）合成培養(yǎng)基：采用多種化學(xué)試劑配制的，各種成分及其用量都確切知道的培養(yǎng)基。如高氏一號培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基制成后的物理狀態(tài)可分為：（1）液體培養(yǎng)基：呈液體狀態(tài)的培養(yǎng)基。（2）固體培養(yǎng)基：外觀呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。（3）半固體培養(yǎng)基：將各種

11、營養(yǎng)成份按比例配制成營養(yǎng)液后，加入適量固化劑 ，處于半固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。根據(jù)培養(yǎng)基的功能和用途可分為：（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 含有多數(shù)有機(jī)營養(yǎng)型細(xì)菌所需養(yǎng)分。（2）加富培養(yǎng)基：加入有利于某類微生物生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，使其增值速度快于其他微生物。（3）選擇培養(yǎng)基：加入某些物質(zhì)或除去某些營養(yǎng)物質(zhì)以阻抑其他微生物生長，從而有利于某一類群或某一目標(biāo)微生物生長。（4）鑒別培養(yǎng)基：用來檢查微生物的某些代謝特性。4.培養(yǎng)基的制備原則（1）有供微生物生長發(fā)育的各種營養(yǎng)物質(zhì)及足夠的水分；（2）有合適的酸堿度；（3）絕對無菌；（4）均質(zhì)透明(以便觀察微生物生長現(xiàn)象)；（5）材料和容器應(yīng)沒有抑制細(xì)菌生長的物質(zhì)（如不

12、能用鐵鍋和銅鍋）。5、高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌法是在密閉的加壓容器內(nèi)進(jìn)行，加熱使器內(nèi)的水產(chǎn)生蒸汽，由于密閉，增加了器內(nèi)的壓力，使水的沸點升高，從而獲得高于100度的蒸汽溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。高壓蒸汽滅菌法為濕熱滅菌法，其優(yōu)點有三：一是濕熱滅菌時菌體蛋白容易變性，二是濕熱穿透力強(qiáng)，三是蒸氣變成水時可放出大量熱增強(qiáng)殺菌效果，因此，它是效果最好的滅菌方法。適用于一般培養(yǎng)基、玻璃器皿、無菌水、金屬用具。一般培養(yǎng)基在121.3滅菌20min即可。四、實訓(xùn)步驟（一）培養(yǎng)基的制備稱量溶解調(diào)節(jié)pH值過濾分裝、包扎滅菌1.稱量按照培養(yǎng)基配方，準(zhǔn)確稱量各成份放于錐形瓶中。配方：牛肉膏0.6

13、g,蛋白胨2.0g，氯化鈉1.0g,瓊脂4.0g。先加入其它成分，加水溶解后再加瓊脂。2.溶解向上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃棒攪拌，藥品完全溶解后，將稱好的瓊脂放入已溶的藥品中，然后在電熱套上加熱使其溶解，或磁力攪拌使其溶解，補(bǔ)充水到所需總體積200ml。（在瓊脂的熔化過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。待完全熔化后，補(bǔ)足所損失水分。） 3.調(diào)節(jié)pH值用玻璃棒沾少許液體，測pH值。用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.27.4。注：培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后pH值一般要降低0.1-0.2，所以在滅菌前調(diào)pH值時要相應(yīng)提高。4.包扎瓶口塞上棉塞，用報紙（或牛皮紙）包好。6.滅菌：高

14、壓蒸汽滅菌，121滅菌20分鐘。具體請參考視頻：“培養(yǎng)基的配制和滅菌消毒”（04：4016：35）、“學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)的基本技術(shù)”（開始15：55）。另：配制生理鹽水，一共配制2000 ml，全班共用。 配方：氯化鈉 18 g 蒸餾水2000ml溶解后，121，20 min高壓滅菌備用。（二）培養(yǎng)基的滅菌加壓蒸汽滅菌法 重點掌握：高壓滅菌鍋的使用高壓蒸汽滅菌法是在密閉的加壓容器內(nèi)進(jìn)行，加熱使器內(nèi)的水產(chǎn)生蒸汽，由于密閉，增加了器內(nèi)的壓力，使水的沸點升高，從而獲得高于100度的蒸汽溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。高壓蒸汽滅菌法為濕熱滅菌法，其優(yōu)點有三：一是濕熱滅菌時菌體蛋白容易變性，二

15、是濕熱穿透力強(qiáng)，三是蒸氣變成水時可放出大量熱增強(qiáng)殺菌效果，因此，它是效果最好的滅菌方法。適用于一般培養(yǎng)基、玻璃器皿、無菌水、金屬用具。一般培養(yǎng)基在121.3滅菌20min即可。（手提式）高壓蒸汽滅菌器使用方法：1、加水（約3L）至外筒內(nèi)，被滅菌物品放入內(nèi)筒。注：水浸沒電熱絲約一個指頭（也不要太多）；鍋內(nèi)積水要清理掉。2、將頂蓋上的排氣管插入消毒桶內(nèi)壁的方管中（無軟管或軟管銹蝕破裂的滅菌器不得使用），蓋上滅菌器蓋，擰緊螺旋使之密閉。注：擰螺絲要對稱擰，不要一次擰緊，約3次擰緊。3、打開排氣閥，通電加熱，使水沸騰以排凈其中冷空氣。待冷空氣全部排出后，關(guān)閉（蓋回）排氣閥。注：若不將鍋內(nèi)的冷空氣排凈，

16、壓力與溫度不能同步上升，出現(xiàn)低溫高壓現(xiàn)象，影響滅菌效果。4、繼續(xù)加熱，待壓力表漸漸升至所需壓力時(一般是0.11Mpa，即15磅/英寸2，溫度為121)，開始計時，至126（0.14Mpa）關(guān)閉電源，降壓，至121再打開電源，如此循環(huán)約15-20min。5、滅菌時間到達(dá)后，停止加熱（斷電）。注：不要立即打開氣閥！6、待壓力表降至零時，慢慢打開排氣閥，排除余氣，開蓋取物。注：切不可在壓力尚未降低為零時突然打開排氣閥門，以免滅菌器中液體噴出。滅菌后注意事項：1、滅菌后物品，按正常情況已屬無菌，從滅菌器中取出應(yīng)仔細(xì)檢查，以免再度污染。2、物品取出，隨即檢查包裝的完整性，若有破壞或棉塞脫掉，不可作為無

17、菌物品使用。3、取出的物品，如為包裝有明顯的水浸者，不可作為無菌物品使用。4、培養(yǎng)基或試劑等，應(yīng)檢查是否符合達(dá)到滅菌后的色澤或狀態(tài)，未達(dá)到者應(yīng)廢棄。5、取出的物品掉落在地或誤放不潔之處，或沾有水液，均視為受到污染，不可作為無菌物品使用。6、取出的合格滅菌物品，應(yīng)存放于貯藏室或防塵柜內(nèi)，嚴(yán)禁與未滅菌物品混放。7、凡屬合格物品，應(yīng)標(biāo)有滅菌日期及有效期限（滅菌包在未污染和干燥的情況下，5月1日9月30日有效期為1周，10月1日次年4月30日有效期為2周，過期要重新滅菌。）。8、每批滅菌處理完成后，記錄滅菌品名、數(shù)量、溫度、時間、操作者。9、如要求嚴(yán)格的實訓(xùn)，滅好菌的培養(yǎng)基一般要觀察1-4天，確定徹底

18、滅菌后才使用。具體請參考視頻：“培養(yǎng)基的配制和滅菌消毒”、“學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)的基本技術(shù)”相關(guān)內(nèi)容。五、思考題1、 固體培養(yǎng)基加瓊脂后加熱溶化時要注意哪些問題？2、 培養(yǎng)基中加瓊脂的作用是什么？3、 如何檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底？六、實訓(xùn)作業(yè) 認(rèn)真完成實訓(xùn)記錄報告。實訓(xùn)三 化妝品日化品菌落總數(shù)的測定一、實驗原理菌落總數(shù)（aerobic bacterial count）是指化妝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH值、需氧性質(zhì)等），1g（1mL）檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。常用的方法是稀釋平板計數(shù)法。稀釋平

19、板計數(shù)是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的單個菌落，是由一個單細(xì)胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征設(shè)計的計數(shù)方法，即一個菌落代表一個單細(xì)胞。計數(shù)時，首先將待測樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開，使成單個細(xì)胞存在 （否則一個菌落就不只是代表一個細(xì)胞），再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。經(jīng)培養(yǎng)后，由單個細(xì)胞生長繁殖形成菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)。此法所計算的菌數(shù)是培養(yǎng)基上長出來的菌落數(shù)，故又稱活菌計數(shù)。一般用于某些成品檢定（如化妝品、日化品等）、生物制品檢驗、土壤含菌量測定及食品、水源的污染程度的檢驗等。 測定菌落總數(shù)便于判明樣品

20、被細(xì)菌污染的程度，是對樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)總評價的綜合依據(jù)。二、主要儀器和設(shè)備錐形瓶、量筒、pH計或pH試紙、高壓滅菌器、試管、平皿（直徑9cm）、吸管（10mL）、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、放大鏡。三、操作步驟（一）培養(yǎng)基和試劑的制備與滅菌（實訓(xùn)二已完成） （二）供檢樣品的制備（各小組可自備供檢樣品）1、液體樣品（香水、花露水、洗手液等）本實驗主要用水溶性的液體樣品，吸取10mL加到90mL滅菌生理鹽水中，混勻后，制成1:10檢液。2、膏、霜、乳劑半固體狀樣品（牙膏、沐浴露等）本實驗主要用親水性的樣品，稱取10g，加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min。取其上清液作

21、為1:10的檢液。3、固體樣品（口紅、粉劑等化妝品樣品）稱取10g，加到90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1:10的檢液。注意：吸管使用（打開方式、取液、調(diào)節(jié)液面、放液）；試管、錐形瓶操作（開塞、管口滅菌、持法、蓋塞）。（三）樣品的稀釋參考視頻：“平板菌落計數(shù)”、“菌落總數(shù)檢驗方法”、“稀釋平板測數(shù)法”，及“稀釋平板計數(shù)法課件”。1、用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢液2mL，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中（注意勿使吸管接觸液面），并振搖試管使其充分混勻【扣分點】，制成1:100檢液。振搖時，幅度為30cm，7s

22、內(nèi)振搖25次。從容器中吸取樣品勻液和以后的稀釋操作中，吸管尖不要碰著瓶口。吸入的液體應(yīng)先高于所要求的刻度，然后提起吸管使其尖端離開液面并貼在容器內(nèi)壁將液體調(diào)至所要求的刻度。2、更換一支吸管，吸取2mL 1:100檢液，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中，制成1:1000檢液，并吸取2mL 1:1000檢液，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。【扣分點：（各步驟）酒精燈無菌區(qū)操作，接種（換管、培養(yǎng)皿個數(shù)）】3、將融化并冷至4550的培養(yǎng)基（使用前可放置于461水浴保溫）傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL20mL，隨即轉(zhuǎn)動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻。【

23、扣分點：加培養(yǎng)基（培養(yǎng)皿持法、加入量、污染皿壁、混勻、）】另取一個不加樣品（加入1mL稀釋液）的滅菌空平皿，加入約15mL20mL培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，為空白對照【扣分點：是否進(jìn)行】?；旌蠒r要防止把混合物濺到平皿壁和蓋上。將樣品液加入平皿后應(yīng)立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用的時間不得超過20min。（四）樣品的培養(yǎng)待瓊脂凝固【扣分點：是否凝固】后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿【扣分點：是否進(jìn)行】，置361恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24-48h。注：微生物培養(yǎng)時一般培養(yǎng)基中的水分含量較高，且培養(yǎng)溫度一般較高，如果不將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)基中的水分會揮發(fā)出來，造成培養(yǎng)基中的水分損失，另外，揮發(fā)出

24、來的水分會在培養(yǎng)皿蓋子上凝結(jié)成水珠，水珠較大時會滴落下來，對菌落生長和菌落形態(tài)都會造成影響。因此，為了避免這兩方面的影響應(yīng)將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)過來。（五）菌落計數(shù)與記錄培養(yǎng)后，立即計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)。如不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板存放于0-4，但不得超過24h。 先用肉眼觀察，點數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大510倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個平皿菌落計數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落數(shù)。操作者對同一平板復(fù)核自己的計數(shù)結(jié)果，其差

25、異應(yīng)在5之內(nèi)，而其他人對這一平板重復(fù)計數(shù)，其差異應(yīng)在10這內(nèi)。否則，應(yīng)找出原因，加以校正。記錄時，只有在換算到每克（毫升）樣品中平板菌落數(shù)時，才能定下兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)字采用四舍五入的方法記錄。也可將樣品的平板菌落數(shù)記錄為10的指數(shù)形式。（六）菌落計算及報告方法1、首先選取平均菌落數(shù)在30300個之間的平皿，作為菌落總數(shù)測定的范圍。當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（見表1中例1）。2、若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30300個之間，則應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于2，應(yīng)報告其平均數(shù)，若大于2則報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)（見表1

26、中例2及例3）。3、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例4）。4、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1例5）。5、若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300個之間，其中一個稀釋度大于300個，而相鄰的另一稀釋度小于30個時，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（見表1中例6）。6、若所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每g或每mL小于10CFU。7、菌落計數(shù)的報告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時，按實有數(shù)值報告之，大于100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五

27、入法計算。為了縮短數(shù)字后面零的個數(shù)，可用10的指數(shù)來表示（見表1報告方式欄）。在報告菌落數(shù)為“不可計”時，應(yīng)注明樣品的稀釋度。表1 菌落計數(shù)結(jié)果及報告方式例 次不同稀釋度平均菌落數(shù)10-1 10-2 10-3兩稀釋度菌數(shù)之比菌落總數(shù) CFU/mL或 CFU/g 報告方式 CFU/mL或 CFU/g11365 164 20 1640016000 或 1.610422760 295 46 1.6 3800038000或3.810432890 271 60 2.2 2710027000 或 2.71044不可計 4650 513 513000510000 或 5.11055 27 11 5 2702

28、70或 2.71026不可計 305 12 3050031000 或 3.11047 0 0 0 1010 CFU：菌落形成單位。注：數(shù)據(jù)計算及結(jié)果報告可參考國標(biāo)及課件。四、實訓(xùn)作業(yè)認(rèn)真完成實訓(xùn)記錄報告。實訓(xùn)四 光學(xué)顯微鏡的使用一、實訓(xùn)目的1、能說出普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造、工作原理和保養(yǎng)方法；2、能熟練使用普通光學(xué)顯微鏡進(jìn)行微生物檢驗。二、實訓(xùn)原理普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造可分為兩大部分：一為機(jī)械裝置，一為光學(xué)系統(tǒng)，這兩部分很好的配合，才能發(fā)揮顯微鏡的作用。1、顯微鏡的機(jī)械裝置顯微鏡的機(jī)械裝置包括鏡座、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺、推動器、粗動螺旋、微動螺旋等部件。（1）鏡座 鏡座是顯微鏡的基本支架，它由

29、底座和鏡臂兩部分組成。在它上面連接有載物臺和鏡筒，它是用來安裝光學(xué)放大系統(tǒng)部件的基礎(chǔ)。（2）鏡筒 鏡筒上接接目鏡，下接轉(zhuǎn)換器，形成接目鏡與接物鏡（裝在轉(zhuǎn)換器下）間的暗室。從物鏡的后緣到鏡筒尾端的距離稱為機(jī)械筒長。因為物鏡的放大率是對一定的鏡筒長度而言的。鏡筒長度的變化，不僅放大倍率隨之變化，而且成像質(zhì)量也受到影響。因此，使用顯微鏡時，不能任意改變鏡筒長度。國際上將顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)筒長定為160mm，此數(shù)字標(biāo)在物鏡的外殼上。（3）物鏡轉(zhuǎn)換器 物鏡轉(zhuǎn)換器上可安裝34個接物鏡，一般是三個接物鏡（低倍、高倍、油鏡）。Nikon顯微鏡裝有四個物鏡。轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，可以按需要將其中的任何一個接物鏡和鏡筒接通，與鏡

30、筒上面的接目鏡構(gòu)成一個放大系統(tǒng)。（4）載物臺 載物臺中央有一孔，為光線通路。在臺上裝有彈簧標(biāo)本夾和推動器，其作用為固定或移動標(biāo)本的位置，使得鏡檢對象恰好位于視野中心。（5）推動器 是移動標(biāo)本的機(jī)械裝置，它是由一橫一縱兩個推進(jìn)齒軸的金屬架構(gòu)成的，好的顯微鏡在縱橫架桿上刻有刻度標(biāo)尺，構(gòu)成很精密的平面座標(biāo)系。如果我們須重復(fù)觀察已檢查標(biāo)本的某一部分，在第一次檢查時，可記下縱橫標(biāo)尺的數(shù)值，以后按數(shù)值移動推動器，就可以找到原來標(biāo)本的位置。（6）粗動螺旋 粗動螺旋是移動鏡筒調(diào)節(jié)接物鏡和標(biāo)本間距離的機(jī)件，老式顯微鏡粗螺旋向前扭，鏡頭下降接近標(biāo)本。新近出產(chǎn)的顯微鏡（如Nikon顯微鏡）鏡檢時，右手向前扭載物臺上

31、升，讓標(biāo)本接近物鏡，反之則下降，標(biāo)本脫離物鏡。（7）微動螺旋 用粗動螺旋只可以粗放的調(diào)節(jié)焦距，要得到最清晰的物象，需要用微動螺旋做進(jìn)一步調(diào)節(jié)。微動螺旋每轉(zhuǎn)一圈鏡筒移動0.1毫米（100微米）。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡的粗動螺旋和微動螺旋是共軸的。2、顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)由反光鏡，聚光器，接物鏡，接目鏡等組成，光學(xué)系統(tǒng)使物體放大，形成物體放大像 。（1）反光鏡 較早的普通光學(xué)顯微鏡是用自然光檢視物體，在鏡座上裝有反光鏡。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成，可以將投射在它上面的光線反射到聚光器透鏡的中央，照明標(biāo)本。不用聚光器時用凹面鏡，凹面鏡能起會聚光線的作用。用聚光器時，一般都用

32、平面鏡。新近出產(chǎn)的較高檔次的顯微鏡鏡座上裝有光源，并有電流調(diào)節(jié)螺旋，可通過調(diào)節(jié)電流大小調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度。（2）聚光器 聚光器在載物臺下面，它是由聚光透鏡、虹彩光圈和升降螺旋組成的。其作用是將光源經(jīng)反光鏡反射來的光線聚焦于樣品上，以得到最強(qiáng)的照明，使物象獲得明亮清晰的效果。聚光器前透鏡組前面還裝有虹彩光圈，它可以開大和縮小，影響著成像的分辨力和反差，若將虹彩光圈開放過大，超過物鏡的數(shù)值孔徑時，便產(chǎn)生光斑；若收縮虹彩光圈過小，分辨力下降，反差增大。因此，在觀察時，通過虹彩光圈的調(diào)節(jié)再把視場光闌（帶有視場光闌的顯微鏡）開啟到視場周緣的外切處，使不在視場內(nèi)的物體得不到任何光線的照明，以避免散射光的干擾。（

33、3）物鏡 安裝在鏡筒前端轉(zhuǎn)換器上的接物透鏡利用光線使被檢物體第一次造像，物鏡成像的質(zhì)量，對分辨力有著決定性的影響。物鏡的性能取決于物鏡的數(shù)值孔徑（numerical apeature簡寫為NA），每個物鏡的數(shù)值孔徑都標(biāo)在物鏡的外殼上，數(shù)值孔徑越大，物鏡的性能越好。物鏡的種類很多，可從不同角度來分類：根據(jù)物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質(zhì)不同，可分為：干燥系物鏡 以空氣為介質(zhì)，如常用的40以下的物鏡，數(shù)值孔徑均小于1。油浸系物鏡 常以香柏油為介質(zhì)，此物鏡又叫油鏡頭，其放大率為90100，數(shù)值孔值大于1。根據(jù)物鏡放大率的高低，可分為：低倍物鏡 指16，NA值為0.040.15；中倍物鏡 指625，NA

34、值為0.15 0.40；高倍物鏡 指2563，NA值為0.350.95；油浸物鏡 指90100，NA值為1.251.40。（4）目鏡 目鏡的作用是把物鏡放大了的實像再放大一次，并把物像映入觀察者的眼中。目鏡的結(jié)構(gòu)較物鏡簡單，普通光學(xué)顯微鏡的目鏡通常由兩塊透鏡組成，上端的一塊透鏡稱“接目鏡”，下端的透鏡稱“場鏡”。上下透鏡之間或在兩個透鏡的下方，裝有由金屬制的環(huán)狀光闌或叫“視場光闌”，物鏡放大后的中間像就落在視場光闌平面處，所以其上可安置目鏡測微尺。顯微鏡的幾個常用系數(shù)：a.放大倍數(shù)=接物鏡放大倍數(shù)接目鏡放大倍數(shù) b.分辨率 ： 是表示顯微鏡辨析物體（兩端）兩點之間距離的能力。c.數(shù)值孔徑 ：也

35、叫做鏡口率（或開口率），它與顯微鏡的分辨力成正比，與焦深成反比，與鏡象亮度的平方根成正比。三、實訓(xùn)器材1、顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。2、微生物玻片標(biāo)本或待測樣品標(biāo)本。四、實訓(xùn)步驟顯微鏡結(jié)構(gòu)精密，使用時必須細(xì)心，要按下述操作步驟進(jìn)行。（一）觀察前的準(zhǔn)備1、顯微鏡從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)拿出時，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運到實驗桌上。2、將顯微鏡放在自己身體的左前方，離桌子邊緣約10cm左右，右側(cè)可放記錄本或繪圖紙。3、調(diào)節(jié)光照 不帶光源的顯微鏡，可利用燈光或自然光通過反光鏡來調(diào)節(jié)光照，但不能用直射陽光，直射陽光會影響物像的清晰并刺激眼睛。將10物鏡轉(zhuǎn)入光孔，將聚光

36、器上的虹彩光圈打開到最大位置，用左眼觀察目鏡中視野的亮度，轉(zhuǎn)動反光鏡，使視野的光照達(dá)到最明亮最均勻為止。光線較強(qiáng)時，用平面反光鏡，光線較弱時，用凹面反光鏡。自帶光源的顯微鏡，可通過調(diào)節(jié)電流旋鈕來調(diào)節(jié)光照強(qiáng)弱。4、調(diào)節(jié)光軸中心 顯微鏡在觀察時，其光學(xué)系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光闌的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。帶視場光闌的顯微鏡，先將光闌縮小，用10物鏡觀察，在視場內(nèi)可見到視場光闌圓球多邊形的輪廓像，如此像不在視場中央，可利用聚光器外側(cè)的兩個調(diào)整旋鈕將其調(diào)到中央，然后緩慢地將視場光闌打開，能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓像完全與視場邊緣內(nèi)接，說明光線已經(jīng)合軸。（

37、二）低倍鏡觀察 鏡檢任何標(biāo)本都要養(yǎng)成必須先用低倍鏡觀察的習(xí)慣。因為低倍鏡視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。將標(biāo)本片放置在載物臺上，用標(biāo)本夾夾住，移動推動器，使被觀察的標(biāo)本處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標(biāo)本處，用目鏡觀察并同時用粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢升起鏡筒（或下降載物臺），直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動器移動標(biāo)本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進(jìn)行觀察。（三）高倍鏡觀察 在低倍物鏡觀察的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦的，在正常情況下，高倍物鏡的轉(zhuǎn)換不應(yīng)碰到載玻片或其上的蓋玻片。若使用不同型號的物鏡，在轉(zhuǎn)換物鏡時要從側(cè)面觀察，避免鏡

38、頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使載物臺上升（或鏡筒下降），直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至物像清晰為止，找到需觀察的部位，并移至視野中央進(jìn)行觀察。（四）油鏡觀察 油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在0.2mm以內(nèi)，再加上一般光學(xué)顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時要特別細(xì)心，避免由于“調(diào)焦”不慎而壓碎標(biāo)本片并使物鏡受損。使用油鏡按下列步驟操作：1、先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升（或?qū)⑤d物臺下降）約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。2、在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。3、從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺緩緩地上升，

39、（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。4、從接目鏡內(nèi)觀察，放大視場光闌及聚光鏡上的虹彩光圈（帶視場光闌油鏡開大視場光闌），上調(diào)聚光器，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺徐徐下降（或鏡筒上升），當(dāng)出現(xiàn)物像一閃后改用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至最清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物象，必須再從側(cè)面觀察，重復(fù)上述操作。5、觀察完畢，下降載物臺，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦鏡紙蘸少許乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份）或二甲苯，擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用擦鏡紙擦拭23下即可，（注意向一個方向擦拭）。6、將各部分還原，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭不與載物臺通光孔相對，而是

40、成八字形位置，再將鏡筒下降至最低，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直，用一個干凈手帕將接目鏡罩好，以免目鏡頭沾污灰塵。最后用柔軟紗布清潔載物臺等機(jī)械部分，然后將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。五、注意事項1、學(xué)生使用顯微鏡固定鏡號、位置，后面的實訓(xùn)一直使用本臺顯微鏡。2、不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件，以免損壞。3、鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度。 4、觀察標(biāo)本時，必須依次用低、高倍鏡，最后用油鏡。當(dāng)目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。 5、觀察時，兩眼睜開，養(yǎng)成兩眼能夠輪換觀察的習(xí)慣，以免眼睛疲勞，并且能夠在左眼觀察時，右眼注視繪圖。 6、拿顯微

41、鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。 六、實訓(xùn)作業(yè)認(rèn)真完成實訓(xùn)記錄報告。實訓(xùn)五 微生物的染色一、實訓(xùn)目的 能熟練進(jìn)行微生物涂片、簡單染色操作。二、實訓(xùn)原理用單一染料進(jìn)行細(xì)菌染色，操作簡便，適于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。 常用堿性染料進(jìn)行簡單染色，這是因為：在中性、堿性或弱堿性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷（酸性染料電離時，其分子的染色部分帶正電荷），因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色，經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下易于識別。常用作簡單染色的染料有：美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。三、實訓(xùn)器材1

42、、儀器和材料：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、擦鏡紙、燒杯、滴管、洗瓶、香柏油、二甲苯、生理鹽水、吸水紙。2、染色液：呂氏堿性美籃染液、石炭酸復(fù)紅或草酸銨結(jié)晶紫。3、菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌。四、實訓(xùn)步驟1、涂片 取兩塊載玻片，各滴一小滴蒸餾水于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作分別從培養(yǎng)1416h的枯草芽孢桿菌和培養(yǎng)24h的大腸桿菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。載玻片要潔凈無油跡；滴蒸餾水和取菌不宜過多；涂片要均勻，不宜過厚。2、干燥 室溫自然干燥。3、固定 固定時通過火焰23次即可。此過程稱熱固定，其目的是使細(xì)胞質(zhì)凝固，以固定細(xì)胞形態(tài)，并使之牢固附著在載玻片上。熱固定溫度不宜過高，以

43、載玻片背面不燙手為宜，否則會改變甚至破壞細(xì)胞形態(tài)。4、染色 染色 滴加染液于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍(lán)染色12min；石炭酸復(fù)紅或草酸銨結(jié)晶紫染色約1min。 水洗 傾去染液，用自來水沖洗，直至涂片上流下的水無色為止。水洗時，不要直接沖洗液面，而應(yīng)使水從載玻片的一段流下，水流不易過急過大，以免涂片薄膜脫落。 干燥 自然干燥或用電吹風(fēng)吹干，也可用吸水紙吸干。 鏡檢 涂片干燥后鏡檢。 清理 實訓(xùn)完畢后，對所用的顯微鏡進(jìn)行整理，及時用二甲苯擦拭油鏡頭，再用擦鏡紙抹去殘留的二甲苯；有菌的涂片放入消毒液中浸泡，然后用洗衣粉水煮沸，再用自來水沖洗并瀝干。試驗臺清理干凈，用消毒液洗手。

44、五、實訓(xùn)作業(yè)認(rèn)真完成實訓(xùn)記錄報告。六、拓展 微生物的革蘭氏染色。實訓(xùn)六 微生物大小的測定及直接計數(shù)（1）一、實訓(xùn)目的1、能說出血球計數(shù)板的構(gòu)造、原理和使用方法。2、 能熟練運用血球計數(shù)板測定微生物的數(shù)量。二、實訓(xùn)原理顯微直接計數(shù)法，即利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計數(shù)方法，各種單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液、菌體較大的酵母菌、霉菌孢子、放線菌和真菌的原生質(zhì)體等均可采用血球計數(shù)板計數(shù)。將孢子懸液（或菌懸液）放在血球計數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計數(shù)室內(nèi)，由于載玻片上的計數(shù)室蓋上蓋玻片后的容積（0.1mm3）是一定的，所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目換算為單位體積內(nèi)的微生物數(shù)目。樣品中菌（或孢子）數(shù)（個/ml）每小格的平均數(shù) 稀釋倍數(shù)在這一公式中，1000代表1ml的容積（即1000mm3），0.00025為每一小格的容積（即0.00025mm3），上面公式可進(jìn)一步改寫為：樣品中菌（或孢子）數(shù)（個/ml）每小格的平均數(shù)稀釋倍數(shù)