中藥分子檢測解決方案

1、主要內容主要內容 中藥材分子檢方法介紹 目標客戶及客戶工作中的主要困難 耶拿公司的相關高效整體解決方案 中藥分子檢測對AJ銷售的重要意義2中藥材鑒定的主要內容中藥材鑒定的主要內容 鑒定目的：保證用藥的安全性和有效性4鑒定內容真?zhèn)舞b定純度鑒定品質優(yōu)良度鑒定中藥材：包括藥材、藥材粉末、部分藥材飲片中藥材鑒定的主要內容中藥材鑒定的主要內容 鑒定目的：保證用藥的安全性和有效性5鑒定內容真?zhèn)舞b定純度鑒定品質優(yōu)良度鑒定重點、難點重點、難點四大傳統經典的鑒定方法四大傳統經典的鑒定方法一、原植物（原動物）基原鑒定一、原植物（原動物）基原鑒定： 是中藥基原鑒定的基礎，觀察其形態(tài)特征，應用植（動）物分類學的知識進

2、行鑒定 局限性：直接用于中藥材及其飲片的鑒別有一定難度，因為形態(tài)易有較大變化6四大傳統經典的鑒定方法四大傳統經典的鑒定方法二、性狀鑒定二、性狀鑒定： 利用人體的感覺器官（眼觀、手摸、鼻聞、口嘗、水試、火試等）去觀察性狀，進行鑒定 局限性：可以確定部分中藥的基原品種，但難以區(qū)別開大部分來自近緣物種的中藥材和中藥飲片7四大傳統經典的鑒定方法四大傳統經典的鑒定方法三、顯微鑒定三、顯微鑒定： 利用顯微鏡對藥材或成方制劑的組織、細胞或內含物進行鑒別 局限性：可以確定部分中藥的基原品種，但難以區(qū)別開大部分來自近緣物種的中藥材和中藥飲片8四大傳統經典的鑒定方法四大傳統經典的鑒定方法四、理化鑒定四、理化鑒定：

3、 利用物理或化學的方法對藥材和制劑進行定性和定量的分析（色譜、紫外、紅外、質譜、核磁共振等） 局限性：因中藥活性成分的含量受到其生長條件、采收時間、貯藏等因素的影響而發(fā)生變化，容易影響鑒定結果的準確性，同時親緣關系較近的物種化學成分相似而難以區(qū)分9中藥材的分子鑒定法應運而生中藥材的分子鑒定法應運而生正如法醫(yī)領域的犯罪嫌疑人鑒定、親子鑒定等，采用的就是基于DNA的分子鑒定法 A、T、G、C四種核苷酸組成的基因序列 每個人種都有自己特定的基因 每個人都有自己特定的基因利用DNA分子鑒定的方法，可以最準確、最科學地得到真?zhèn)舞b定結果10中國藥典在中藥材分子鑒定相關內容的發(fā)展中國藥典在中藥材分子鑒定相關

4、內容的發(fā)展2010版中國藥典收載了烏梢蛇飲片、蘄蛇飲片、川貝母藥材烏梢蛇飲片、蘄蛇飲片、川貝母藥材的DNA分子鑒定方法2015版中國藥典收載了“中藥材中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原條形碼分子鑒定法指導原則則”，標志著中藥材的分子鑒定從實驗室科研層面進入國家標準的應用層面11中藥材分子鑒定方法中藥材分子鑒定方法聚合酶鏈式反應法（聚合酶鏈式反應法（PCR法）法）取樣及樣品處理DNA提取PCR擴增電泳分離凝膠成像判定結果12第一步第一步 第二步第二步 第三步第三步核酸質控以以2015中國藥典中的烏梢蛇飲片為例：中國藥典中的烏梢蛇飲片為例：13聚合酶鏈式反應法PCR第一步：第一步：DNA提取提取以

5、以2015中國藥典中的烏梢蛇飲片為例：中國藥典中的烏梢蛇飲片為例：14聚合酶鏈式反應法PCR：在體外將某一DNA片段（目的基因）擴增，以獲得大量的目的DNA片段1248163264128- 2n指數擴增指數擴增一般PCR反應運行30個循環(huán)，即可得到幾百萬條目的DNA片段第二步：第二步：PCR反應反應以以2015中國藥典中的烏梢蛇飲片為例：中國藥典中的烏梢蛇飲片為例：15聚合酶鏈式反應法第三步：第三步：電泳檢測電泳檢測（含電泳分離和凝膠成像條帶分析）結論：樣品是烏梢蛇 川貝母川貝母 蘄蛇蘄蛇162015中國藥典中另一種分子鑒定方法：中國藥典中另一種分子鑒定方法：中藥材中藥材DNA條形碼分子鑒定條

6、形碼分子鑒定由中國中醫(yī)科學院中藥研究所所長 陳士林院士為主開發(fā)制定主要的核心也是PCR方法，區(qū)別：下游改用測序的方法，比對數據庫序列來鑒定17取樣及樣品處理DNA提取PCR擴增電泳分離凝膠成像回收片段測序數據庫序列比對得到鑒定結果測序鑒定中藥材中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導原則介紹條形碼分子鑒定法指導原則介紹中藥材DNA條形碼分子鑒定法，就是通過分子生物學的方法測定中藥材基因組上一段標準的、具有足夠變異的特有的DNA 序列，來實現物種鑒定。指導原則中，以ITS2為主體條形碼序列鑒定中藥材的方法體系植物類中藥材選用ITS2為主體序列，psbA-trnH為輔助序列動物類中藥材采用COI為主體序列

7、，ITS2為輔助序列 ITS2：核糖體DNA中內部轉錄間隔區(qū)2 psbA-trnH：葉綠體上去除psbA基因及trnH基因的基因間隔區(qū)序列 COI：線粒體上細胞色素C氧化酶輔酶I 以上基因片段通常是幾百bp，都具有多態(tài)性，常用于物種鑒定18核心：核心：PCR法法實驗設計：實驗設計：ITS2片段擴增： 正向引物ITS2F：5-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3； 反向引物ITS3R：5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3。psbA-trnH片段擴增 正向引物：5-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3； 反向引物：5-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC

8、-3。COI序列擴增 正向引物HCO2198：5-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3； 反向引物LCO1490：5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3。19PCR反應體系配置：反應體系配置：PCR反應體系以25 L為參照： PCR Buffer（10）2.5 L MgCl2 2 L（25 mmol/L） dNTPs混合物 2 L（2.5 mmol/L） 上游和下游引物各1.0 L（2.5 mol/L） Taq DNA聚合酶 1.0 U 模板DNA 1 L 加無菌雙蒸水至25 L應設置未加模板DNA的陰性對照。20PCR反應程序：反應程序：ITS2序列

9、擴增程序：94，變性5 min；94變性30 s，56退火30 s，72延伸45 s，40個循環(huán)；72延伸10 min。psbA-trnH序列擴增程序：94變性5 min；94變性1 min，55退火1 min，72延伸1.5 min，30個循環(huán)；72延伸7 min。COI序列擴增程序：94 1 min；94 1 min，45 1.5 min，72 1.5 min，5個循環(huán)；94 1 min，50 1.5 min，72 1 min，35個循環(huán)；72 5 min。21測序后結果分析測序后結果分析將獲得的序列應用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）方法進

10、行結果判定，可以在中藥材DNA條形碼鑒定系統或GenBank數據庫中進行BLAST鑒定 中藥材中藥材DNA條形碼鑒定系統條形碼鑒定系統 http:/www. GenBank數據庫BLAST鑒定 /Blast.cgi22PCR產物電泳產物電泳回收擴增片段進行測序以及序列拼接中藥材中藥材DNA條形碼鑒定系統條形碼鑒定系統23中藥材中藥材DNA條形碼鑒定數據庫條形碼鑒定數據庫 中藥材DNA條形碼鑒定數據庫涵蓋了中國藥典、韓國藥典、日本藥局方、印度藥典、歐洲藥典和美國藥典幾乎所有的中草藥藥材 中草藥DNA條形碼鑒定數據庫每6個月更新一次 數據庫具

11、有提交數據功能，研究人員可以提交可靠的DNA條形碼序列，經審核后提交的DNA條形碼序列將被納入中藥材DNA條形碼數據庫，供世界范圍的研究者使用24DNA條形碼分子鑒定的優(yōu)勢條形碼分子鑒定的優(yōu)勢是傳統鑒定方法的有效補充：是傳統鑒定方法的有效補充：直接從基因水平上提供鑒別依據，可以實現對中藥材原植物、飲片、粉末以及細胞、組織等材料來源的準確鑒定，尤其適合以不同部位入藥的中藥材的物種鑒定可建立數據庫，實現中藥基源鑒定的標準化：可建立數據庫，實現中藥基源鑒定的標準化：能夠構建國際共享的技術平臺，形成國際統一的物種鑒定標準；可促進DNA 條形碼技術操作的程序化和規(guī)范化，實現中藥鑒定的標準化和自動化有助于

12、緩解鑒定人才缺乏的現狀：有助于緩解鑒定人才缺乏的現狀：不依賴于個人經驗，操作人員經過培訓可得到客觀準確的結果促進中藥新資源的開發(fā)利用：促進中藥新資源的開發(fā)利用：尋找分子水平上密切聯系的物種，發(fā)現可替代的新的資源物種利于對中藥資源生物多樣性的保護：利于對中藥資源生物多樣性的保護：加快發(fā)現新種的速度，并有可能解決形態(tài)學手段難以攻克的隱存種問題，揭示動植物隱存多樣性利于在中藥材生產和流通環(huán)節(jié)的監(jiān)管：利于在中藥材生產和流通環(huán)節(jié)的監(jiān)管：可通過二維碼技術進行聯網監(jiān)管和溯源25中藥材中藥材DNA條形碼分子鑒定法條形碼分子鑒定法 方法流程方法流程26樣品采集樣品采集DNA提取提取PCR擴增擴增電泳電泳凝膠成像

13、凝膠成像條帶測序條帶測序試劑盒試劑盒CTAB法法序列拼接序列拼接數據分析數據分析膠回收膠回收物種鑒定物種鑒定DNA質控質控核心：核酸提取核心：核酸提取 PCR法法 測序測序中藥分子鑒定通則中藥分子鑒定通則團體標準正式發(fā)布團體標準正式發(fā)布 2016年12月12日，中華中醫(yī)藥學會批準中藥分子鑒定通則(T/CACM 010-2016)標準，并予以公告 由中國中醫(yī)科學院中藥資源中心、中國食品藥品檢定研究院、國藥種業(yè)有限公司起草 適用于對主要中藥材、中藥飲片、中藥提取物、中成藥、中藥材種子種苗生產基地、加工、經營等場所開展的抽樣檢驗活動中，需要對其進行真實性驗證或身份鑒定的，允許采用DNA分子檢測方法

14、分為三個部分，即第1部分：中藥材與中藥飲片、第2部分：中藥提取物與中成藥、第3部分：中藥材種子種苗27中草藥參考基因庫計劃中草藥參考基因庫計劃 2017年3月， Illumina與中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所（IMPLAD）簽署協議，開展千種藥用植物基因組計劃（1KMPG），共同創(chuàng)建世界首個藥用植物參考基因庫。 分兩個階段，第一批500種藥用植物，第二批500種藥用植物，共計1000種 主要測葉綠體基因組序列 利用行業(yè)領先技術促進藥用植物基因測序與精準鑒定，確保中醫(yī)產品的質量、安全和有效性，為中醫(yī)藥全面步入國際市場奠定堅實的基礎28關注單位關注單位 各地食品藥品監(jiān)督管理局 各地食品藥品檢驗檢測

15、中心/所 當地藥企（希望在行業(yè)內建立更先進更高的標準） 一些跟中藥相關的科研單位29目標客戶群及銷售機會目標客戶群及銷售機會 各地食品藥品檢測中心國家強制執(zhí)行中藥材分子檢測，各地中藥材分子檢測平臺建設各種中藥材分子鑒定方法的開發(fā) 規(guī)模較大的中藥材生產企業(yè)國家強制執(zhí)行中藥材分子檢測，中藥材分子檢測平臺建設各種中藥材分子鑒定方法的開發(fā) 中藥相關的科研單位各種中藥材分子鑒定方法的開發(fā)Dummy text30客戶現實情況客戶現實情況 國家強制執(zhí)行2015年藥典中藥分子檢測方法 負責人非生物專業(yè) 具體操作人員不專業(yè) 如何建立PCR實驗室不清楚 試驗問題解決沒概念耶拿公司優(yōu)勢耶拿公司優(yōu)勢 整體解決方案，全

16、套產品線 專業(yè)的技術支持 完善的售后服務33樣品處理樣品處理核酸純化核酸純化核酸定量核酸定量體系構建體系構建核酸擴增核酸擴增電泳檢測電泳檢測成像分析成像分析德國耶拿的解決方案德國耶拿的解決方案SpeedMill Plus 快速勻漿器快速勻漿器高效中藥材破碎高效中藥材破碎高效：采用獨特的微珠垂直沖擊破碎法，可進行高效、完全的細胞破碎快速：可同時處理20個樣品，幾十秒至幾分鐘即可完成方便：樣品管支架可預先放在-80 等低溫環(huán)境中預冷，進一步保證破碎時樣品溫度的有效致冷，無需額外的液氮、干冰等制冷劑應用廣泛：可處理的樣品種類廣泛，如各類中藥材、動物組織（內臟、干質樣品、昆蟲、軟骨組織等）、植物組織（

17、葉、莖、根、花、果實、種子等）、各類真菌等34InnuPure C16 自動核酸純化儀自動核酸純化儀全自動中藥材全自動中藥材DNA提取提取產物無磁珠殘留：無需離心即可直接應用于下游工作無污染：即用型試劑密封預裝，tip自動穿刺取樣，避免外源污染及交叉污染，紫外燈可有效清潔儀器內部方便：不用加液，不用離心，不用操作電腦軟件，不用編程，只需加入樣品，選擇程序，儀器自動完成提取工作。免費提供核酸純化程序并終身免費升級靈活：最快40分鐘處理1-16個樣品35DNA提取試劑盒提取試劑盒有效解決中藥材有效解決中藥材DNA難提取的問題難提取的問題耶拿公司擁有專利性的最新核酸純化技術Dual Chemistr

18、y Technology (DC-Technology, 雙緩沖液技術)，與傳統的高離子強度離液鹽試劑盒相比，有以下優(yōu)點： 提供了更為溫和穩(wěn)定的裂解環(huán)境，提高核酸提取的得率 提供了更為溫和的生存環(huán)境，提高核酸產物的完整性和活性 低鹽濃度緩沖液體系可以有效減少清洗步驟，提高核酸純度 得到的核酸產物對下游應用無抑制作用，可以長久儲存36 植物DNA提取試劑盒： 含有三種不同的裂解緩沖液，特別適用于成分復雜、DNA難以提取的中藥材樣品德國耶拿的德國耶拿的innuPREP Plant DNA Kit 獨特點：提供三種裂解緩沖液 SLS, OPT, CBV，有效應對中藥材復雜樣品371、石斛-SLS 2

19、、南柴胡-SLS 3、南柴胡-OPT 4、北柴胡-SLS 5、北柴胡-OPT 6、石斛OPT 結論：結論：石斛用石斛用OPT提取效果好提取效果好柴胡用柴胡用SLS提取效果好提取效果好唯一唯一專利性的專利性的DC-Technology 雙緩沖液技術雙緩沖液技術提取石斛和柴胡DNAScanDrop超微量核酸蛋白測定儀超微量核酸蛋白測定儀對提取的對提取的DNA質量進行把關質量進行把關多功能：是常量、微量、超微量的完美結合，具有三種檢測模式，滿足各種需求超微量：最低樣品量僅需0.3 l高通量：能用兩種檢測光程連續(xù)檢測16個樣品結果準確穩(wěn)定：檢測光程固定，獨有的雙光束光路系統，密閉的檢測環(huán)境，確保檢測結

20、果的高度準確性和重復性快速：儀器即開即用，多個樣品自動連續(xù)檢測，操作簡便38Biometra TAdvanced基因擴增儀基因擴增儀高效的基因擴增高效的基因擴增快速：鍍金純銀樣品槽，實現高效傳熱效果和快速的升降溫速率，最快升溫速度可達到8 /s精準的溫度控制：優(yōu)異的溫度準確性 0.1/s，均一性0.15/s線性溫度梯度：實現準確的溫度梯度設置和控制，方便退火溫度的優(yōu)化靜音技術 ：運行時非常安靜，無噪聲，提供舒適的工作環(huán)境儀器自檢功能：可進行自動的檢測診斷，確保儀器運行正常舒適：超大的7英寸彩色觸摸屏，高清顯示，操作直觀方便結識耐用：久經考驗的德國品質，30年的PCR儀制造經驗39Compact

21、 系列水平電泳系列水平電泳DNA分離分離Compact系列水平電泳是經典的簡便型電泳產品的代表，厚實的有機玻璃、耐用的鉑金電極和鍍金的安全插頭，處處彰顯著該產品系列高貴且耐用的品質。Compact系列按照凝膠大小可分為六種型號。皮實耐用：材料厚度是同類產品的三倍以上，極其結實耐用操作方便：安全蓋子有寬厚的邊翼，可以穩(wěn)定地豎直放置在桌面上，不占用空間，操作方便且不易污染；制膠操作極其簡單，一步即可完成制膠器的組裝凝膠托盤具有UV穿透性，可直接在紫外燈下觀察凝膠結果40UVsolo touch獨立型凝膠成像儀獨立型凝膠成像儀核酸成像分析核酸成像分析系統自帶10英寸彩色觸摸顯示屏，凝膠結果直接實時顯

22、示，不需要配置電腦獨有的四開窗設計，無需開門即可觀察凝膠和切膠，操作更加安全紫外光強度有三個檔次可設定，高檔用于凝膠成像和拍照，中檔用于樣品的快速切膠取樣，低檔用于樣品的較長時間切膠取樣帶有自動的安全保護裝置，前艙門打開時紫外燈會自動熄滅，避免操作者受到紫外光的直接照射。若10 min無操作，紫外燈會自動熄滅，以延長紫外燈的使用壽命圖片可以tif、jpg、gif等格式存儲在儀器里，也可通過前端的USB接口導出，還可通過無線或有線網絡傳輸至電腦中41PCR UV2/UV3加樣工作臺加樣工作臺PCR潔凈加樣潔凈加樣42高效滅菌：短波紫外燈滅菌多重過濾：三級過濾裝置，網篩預過濾、活性炭過濾、HEPA過濾功能齊全：內置電源接口，置物架杜絕外源污染和交叉污染！43大量加樣工作大量加樣工作手工移液器加樣手工移液器加樣自動化系統加樣自動化系統加樣效率低下效率低下容易出錯容易出錯加樣不穩(wěn)定加樣不穩(wěn)定身心疲憊身心疲憊效率高效率高不易出錯不易出錯加樣穩(wěn)定加樣穩(wěn)定解放人力解放人力大量樣