生化21常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用

1、常用分子生物學(xué)技術(shù)常用分子生物學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用原理及其應(yīng)用第第 1 節(jié)節(jié)分子印跡與雜交技術(shù)分子印跡與雜交技術(shù)一、核酸分子印跡與雜交技術(shù)一、核酸分子印跡與雜交技術(shù)核酸分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 把不同來源而具有一定同源性的把不同來源而具有一定同源性的DNA分子放在同分子放在同一溶液中做變性處理一溶液中做變性處理 ，或把單鏈，或把單鏈DNA與與RNA放在一放在一起，在一定條件下，它們之間的同源區(qū)域可按堿基互起，在一定條件下，它們之間的同源區(qū)域可按堿基互補(bǔ)原則復(fù)性形成雜合雙鏈補(bǔ)原則復(fù)性形成雜合雙鏈(heteroduplex) ，這一過程，這一過

2、程稱為雜交。稱為雜交。 在雜交之前，通常用瓊脂糖凝膠分離待在雜交之前，通常用瓊脂糖凝膠分離待測的測的DNA分子，再將分離的分子，再將分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到片段轉(zhuǎn)移到特定的支持物上。由于轉(zhuǎn)移后各個(gè)特定的支持物上。由于轉(zhuǎn)移后各個(gè)DNA片段片段在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置一在膜上的相對位置與在凝膠中的相對位置一樣，故稱為印跡（樣，故稱為印跡（ blotting）。）。 印跡（印跡（ blotting）（一）（一）Southern印跡雜交印跡雜交 Southern印跡雜交（印跡雜交（Southern blotting）是是指指DNA與與DNA分子之間的雜交。其基本過程分子之間的雜交。其基本過程

3、是將瓊脂糖凝膠電泳分離的待測是將瓊脂糖凝膠電泳分離的待測DNA片段變性片段變性后，將凝膠中的后，將凝膠中的DNA分子轉(zhuǎn)移到一定的固相支分子轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上，然后用標(biāo)記的探針檢測待測的持物上，然后用標(biāo)記的探針檢測待測的DNA。 探針（探針（probe） 是指經(jīng)過特殊標(biāo)記的是指經(jīng)過特殊標(biāo)記的已知序列核苷酸片已知序列核苷酸片段段，可以用來檢測某一特定核苷酸序列或基，可以用來檢測某一特定核苷酸序列或基因序列的因序列的DNA或或RNA片段。片段。 探針的種類探針的種類 寡核苷酸寡核苷酸 基因組基因組DNA cDNA片段片段 RNA片段片段標(biāo)記物標(biāo)記物 放射性同位素放射性同位素 生物素生物素 熒光

4、染料熒光染料 Southern印跡雜交的基本步驟印跡雜交的基本步驟 u待測待測DNA樣品的限制性內(nèi)切酶消化樣品的限制性內(nèi)切酶消化 u酶切酶切DNA樣品的電泳分離樣品的電泳分離 u凝膠中凝膠中DNA的變性和的變性和Southern轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移 u探針的制備探針的制備 uSouthern雜交雜交 u雜交結(jié)果的檢測雜交結(jié)果的檢測 M1 210SSC 轉(zhuǎn)移緩沖液轉(zhuǎn)移緩沖液Whatman濾紙濾紙凝膠凝膠Whatman濾紙濾紙紙巾紙巾玻璃板玻璃板重物重物支持物支持物500g1 2與探針同源雜交的與探針同源雜交的基因基因DNA片段片段基因組基因組DNADNA酶切片段酶切片段內(nèi)切酶內(nèi)切酶NC或尼龍膜或尼龍膜NC膜

5、或尼龍膜膜或尼龍膜 基因組基因組DNA的定性與定量分析。的定性與定量分析。 如對在基因組中特異基因的定位及檢測等。如對在基因組中特異基因的定位及檢測等。重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。Southert blotting用途用途（二）（二）Northern印跡雜交印跡雜交 利用類似于利用類似于Southern印跡雜交的技術(shù)來印跡雜交的技術(shù)來檢測檢測RNA稱為稱為Northern印跡雜交（印跡雜交（Northern blotting）。）。 Northern印跡雜交基本原理和過程與印跡雜交基本原理和過程與Southern印跡基本相同，只是檢測的分子是印跡基本相同，只是檢測的分子是R

6、NA，可用來對組織或細(xì)胞中的，可用來對組織或細(xì)胞中的mRNA進(jìn)行定進(jìn)行定性或定量分析。性或定量分析。 Northern印跡雜交的基本過程印跡雜交的基本過程 相同點(diǎn)：相同點(diǎn)：名稱相對于名稱相對于Southern blotting轉(zhuǎn)移的是轉(zhuǎn)移的是RNA轉(zhuǎn)移前無需酶切轉(zhuǎn)移前無需酶切轉(zhuǎn)移效率較高轉(zhuǎn)移效率較高變性方法變性方法不同點(diǎn)不同點(diǎn)原理均為毛細(xì)作用原理均為毛細(xì)作用 Northern blotting 用途用途 檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異檢測某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA 的表達(dá)水平。的表達(dá)水平。 比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。比較不同組織和細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。二、蛋白質(zhì)印跡技

7、術(shù)二、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blotting) 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)分子之間存在蛋白質(zhì)印跡技術(shù)是根據(jù)蛋白質(zhì)分子之間存在相互作用的特點(diǎn)，將蛋白質(zhì)電泳分離，然后將相互作用的特點(diǎn)，將蛋白質(zhì)電泳分離，然后將其轉(zhuǎn)移和固定于固體支持物（其轉(zhuǎn)移和固定于固體支持物（NC膜或其它膜）膜或其它膜）上，再用相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子對其進(jìn)行檢測。最上，再用相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子對其進(jìn)行檢測。最常用的蛋白質(zhì)是抗體，因此被稱為免疫印跡常用的蛋白質(zhì)是抗體，因此被稱為免疫印跡（immunoblotting）技術(shù)。）技術(shù)。 首先將混合蛋白質(zhì)用首先將混合蛋白質(zhì)用PAGE按分子大小按分子大小分開，再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到分開，再將蛋白質(zhì)

8、轉(zhuǎn)移到NC膜上，蛋白質(zhì)膜上，蛋白質(zhì)的位置可保持在膠中的原位上。的位置可保持在膠中的原位上。與與DNA和和RNA印跡相似之處印跡相似之處n蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移只有靠電轉(zhuǎn)移n蛋白質(zhì)的檢測以蛋白質(zhì)的檢測以抗體抗體作探針作探針n用堿性磷酸酶（用堿性磷酸酶（ALP）、辣根過氧化酶）、辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記第二抗體，）標(biāo)記第二抗體，底物顯色底物顯色來檢測來檢測蛋白區(qū)帶的信號，底物亦可與蛋白區(qū)帶的信號，底物亦可與化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光劑結(jié)合以提高敏感度。結(jié)合以提高敏感度。n或用同位素標(biāo)記第二抗體，或用同位素標(biāo)記第二抗體，放射自顯影法放射自顯影法檢測蛋白區(qū)帶的信號。檢測蛋白區(qū)帶的信號。與與DN

9、A和和RNA印跡不同之處印跡不同之處Western blotting應(yīng)用應(yīng)用 檢測樣品中的特異蛋白質(zhì)的存在檢測樣品中的特異蛋白質(zhì)的存在 細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的定量分析細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的定量分析 蛋白質(zhì)分子的相互作用研究蛋白質(zhì)分子的相互作用研究三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較Western blotting垂直槽垂直槽Northern blotting水平槽水平槽Southern blotting水平槽水平槽第第 2 節(jié)節(jié) PCR技術(shù)的原理與應(yīng)用技術(shù)的原理與應(yīng)用（Polymerase Chain Reaction，PCR）聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng) PCR技術(shù)是技術(shù)是1985年由美國科學(xué)家年由美國

10、科學(xué)家Kary B Mullis建立的建立的體外體外擴(kuò)增基因片段的方法，它擴(kuò)增基因片段的方法，它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、簡便、重復(fù)性好、具有特異、敏感、產(chǎn)率高、簡便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)突出優(yōu)點(diǎn)，是分子生物學(xué)技術(shù)中，是分子生物學(xué)技術(shù)中一項(xiàng)具有一項(xiàng)具有革命性的創(chuàng)舉革命性的創(chuàng)舉。 PCR方法被美國方法被美國Science雜志評為雜志評為1989年年的十大科技成就之一，而的十大科技成就之一，而Taq DNA聚合酶聚合酶被被評選為象征評選為象征1989年的年的“年分子年分子”(the molecule of year)。5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle

11、 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、一、PCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的的含量可以擴(kuò)大含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。萬倍以上。n模板模板DNAn 特異性引物特異性引物n耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶n dNTPsn Mg2+ PCR體系基本組成成分體系基本組成成分二、二、PCR技術(shù)的主要特點(diǎn)技術(shù)的主要特點(diǎn)1.特異性強(qiáng)特異性強(qiáng) 2.靈敏度高靈敏度高 3.簡便快速簡便快速 4.對標(biāo)本的純度要求低對標(biāo)本的純度要求低 2. 采用采用

12、PCR方法獲得目的基因方法獲得目的基因 引物選擇：引物選擇：特異引物、隨機(jī)引物、簡并引物特異引物、隨機(jī)引物、簡并引物 1. 采用采用RT-PCR方法擴(kuò)增目的基因方法擴(kuò)增目的基因三、三、PCR技術(shù)技術(shù)的主要用途的主要用途（一）目的基因的擴(kuò)增與克?。ㄒ唬┠康幕虻臄U(kuò)增與克?。ǘ┗虻捏w外定點(diǎn)突變（二）基因的體外定點(diǎn)突變（三）基因突變分析（三）基因突變分析（四）（四） DNA和和RNA的微量分析的微量分析（五）（五） DNA序列測定序列測定三、三、PCR技術(shù)技術(shù)的主要用途的主要用途 (Sanger雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法)HO P O P O P O CH2OOOOHOHOHOA, C, G

13、or T13 OH5 雙脫氧核苷三磷酸雙脫氧核苷三磷酸脫去脫去DNA鏈末端合成終止法鏈末端合成終止法Sanger 1958年和年和1980年兩次獲年兩次獲Nobel獎(jiǎng)獎(jiǎng)DNA鏈末端合成終止法鏈末端合成終止法DNA自動(dòng)測序自動(dòng)測序用用熒光替代放射性核素?zé)晒馓娲派湫院怂貥?biāo)記是實(shí)現(xiàn)標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分序列分析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。析自動(dòng)化的基礎(chǔ)。用用不同熒光不同熒光分子標(biāo)記分子標(biāo)記4種種ddNTP，然后進(jìn)行，然后進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管測序反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離。電泳）分離。通過通過4種激光激發(fā)不同大小種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光片段上的熒光分

14、子使之發(fā)射出分子使之發(fā)射出4種不同波長熒光，檢測器采集熒種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。堿基的排列順序。 DNA自動(dòng)測序結(jié)果自動(dòng)測序結(jié)果四、幾種重要的四、幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)技術(shù) (RT-PCR)（二）原位（二）原位PCR技術(shù)技術(shù) (ISP)（三）實(shí)時(shí)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)技術(shù) (real time PCR)RT-PCR技術(shù)技術(shù)AAnATTnT 55mRNA反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3TTnTAAnA核糖核酸酶HTTnT3DNA poly IcDNA核酸酶S1雙鏈cDNA35 35 5加熱變性加入特

15、異性引物DNA聚合酶PCR擴(kuò)增出大量的產(chǎn)物實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)技術(shù)原理原理第第 3 節(jié)節(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與基因剔除技術(shù)與基因剔除技術(shù) 是指將外源基因整合到動(dòng)物細(xì)胞或是指將外源基因整合到動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞的基因組中并使外源基因在動(dòng)植物細(xì)胞的基因組中并使外源基因在動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的物細(xì)胞或植物細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的技術(shù)。技術(shù)。 基因的導(dǎo)入方式主要：基因的導(dǎo)入方式主要： 顯微注射法顯微注射法 胚胎干細(xì)胞法胚胎干細(xì)胞法 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法 一、一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù) 即即體細(xì)胞克隆技術(shù)體細(xì)胞克隆技術(shù)，是用顯微操作、，是用顯微操作、電融合等方法將動(dòng)物體細(xì)胞的細(xì)胞核電融

16、合等方法將動(dòng)物體細(xì)胞的細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)個(gè)體的去除細(xì)胞核的全部導(dǎo)入另一個(gè)個(gè)體的去除細(xì)胞核的卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成為個(gè)體。卵細(xì)胞內(nèi)，使之發(fā)育成為個(gè)體。二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)二、核轉(zhuǎn)移技術(shù) 核轉(zhuǎn)移技術(shù)可使一個(gè)細(xì)胞變成一個(gè)核轉(zhuǎn)移技術(shù)可使一個(gè)細(xì)胞變成一個(gè)個(gè)體，這樣產(chǎn)生的個(gè)體所攜帶的遺傳個(gè)體，這樣產(chǎn)生的個(gè)體所攜帶的遺傳物質(zhì)與細(xì)胞核供體的遺傳物質(zhì)完全一物質(zhì)與細(xì)胞核供體的遺傳物質(zhì)完全一樣，是一種無性繁殖的過程，即樣，是一種無性繁殖的過程，即克隆克隆(clone)。通過分子生物學(xué)的方法定向地敲除動(dòng)通過分子生物學(xué)的方法定向地敲除動(dòng)物體細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)基因的技術(shù)稱為物體細(xì)胞內(nèi)的某個(gè)基因的技術(shù)稱為基因基因剔除剔除 (gene

17、knock-out)或或基因打靶基因打靶 (gene targeting)。三、基因剔除技術(shù)三、基因剔除技術(shù)四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（一）建立疾病動(dòng)物模型（一）建立疾病動(dòng)物模型（二）生物制藥（二）生物制藥（三）治療性克隆和生產(chǎn)可用于人體器官（三）治療性克隆和生產(chǎn)可用于人體器官 移植的動(dòng)物器官移植的動(dòng)物器官第第 4 節(jié)節(jié) 生生 物物 芯芯 片片 技技 術(shù)術(shù)DNA芯片芯片(DNA chip)、DNA陣列陣列(DNA array)cDNA芯片芯片(cDNA chip) 指將許多特定的指將許多特定的DNA片段或片段或cDNA片段片段作為探針，有規(guī)律地緊密

18、排列固定于單位作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上。面積的支持物上。一、基因芯片一、基因芯片(gene chip) 將探針與熒光標(biāo)記的待測樣品分子將探針與熒光標(biāo)記的待測樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測系統(tǒng)檢測雜交的熒進(jìn)行雜交，通過檢測系統(tǒng)檢測雜交的熒光信號和強(qiáng)度，從而獲取樣品分子的數(shù)光信號和強(qiáng)度，從而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。量和序列信息。 將高度密集排列的蛋白分子作為探將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和白，再經(jīng)檢測系

19、統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片 (protein chip)又稱又稱蛋白質(zhì)陣列蛋白質(zhì)陣列 (protein array)基本原理基本原理： 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構(gòu)象上能蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)分子之間在空間構(gòu)象上能特異性的相互識(shí)別和相互結(jié)合。如抗體與抗原特異性的相互識(shí)別和相互結(jié)合。如抗體與抗原或受體與配體之間的特異性結(jié)合?；蚴荏w與配體之間的特異性結(jié)合。最常用的探針：最常用的探針： 抗體，抗體與抗原結(jié)合的特異性最強(qiáng)?？贵w，抗體與抗原結(jié)合的特異性最強(qiáng)。檢測方法：檢測方法： 標(biāo)記檢測法、直接檢測法標(biāo)記檢測法、直接檢測法第第5節(jié)節(jié) 蛋白質(zhì)相互作用

20、研究技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 1989年美國紐約州立大學(xué)的年美國紐約州立大學(xué)的Fields和和Song首先首先描述了酵母雙雜交系統(tǒng)描述了酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system)。 該系統(tǒng)的建立是基于對酵母轉(zhuǎn)錄因子該系統(tǒng)的建立是基于對酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4分子分子的研究。的研究。轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNA binding domain) 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activation domain) 一、酵母雙雜交系統(tǒng)一、酵母雙雜交系統(tǒng)（一）酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理（一）酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理N端端C端端 這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域

21、各具功能，互不影響這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響, , 單獨(dú)存在時(shí)沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有單獨(dú)存在時(shí)沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有兩者通過共價(jià)或非共價(jià)鍵連接建立起來兩者通過共價(jià)或非共價(jià)鍵連接建立起來的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完整的激活的空間結(jié)構(gòu)方可表現(xiàn)出一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子的功能。特定基因表達(dá)的激活因子的功能。（二）酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用（二）酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用1. 分析已知蛋白質(zhì)之間的相互作用及蛋白質(zhì)分析已知蛋白質(zhì)之間的相互作用及蛋白質(zhì) 的功能結(jié)構(gòu)域的功能結(jié)構(gòu)域2. 篩選和發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)篩選和發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì) 3. 篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對蛋白質(zhì)之篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對蛋白質(zhì)之 間相互作用的影響間相互作用的影響 4. 繪制蛋白相互作用系統(tǒng)圖譜繪制蛋白相互作用系統(tǒng)圖譜基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué) 基因組學(xué)是研究生物體基因組的結(jié)基因組學(xué)是研究生物體基因組的結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、以及基因之構(gòu)、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)