植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)

1、 植物細(xì)胞植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)技術(shù)技術(shù)目錄 1.植物單細(xì)胞的獲得 2.懸浮培養(yǎng)的特點(diǎn) 3.懸浮培養(yǎng)途徑與植株再生 4.懸浮培養(yǎng)基的條件控制 5.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化處理 6.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目的測(cè)定 7.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞活性的測(cè)定 8.胡蘿卜的懸浮培養(yǎng) 1.1.單細(xì)胞的單細(xì)胞的獲得獲得從植物器官中分離單細(xì)胞從如愈傷組織中分離單細(xì)胞1.1 由完整的植物器官分離單細(xì)胞機(jī)械法機(jī)械法酶解法酶解法 葉片葉片是分離單細(xì)胞的最好材料是分離單細(xì)胞的最好材料1.1.11.1.1機(jī)械法機(jī)械法 方法方法A A：用刀片刮葉片：用刀片刮葉片 ( (花生成熟葉片花生成熟葉片) )具體方法具體方法: :撕去表皮撕去表皮露出葉

2、肉細(xì)胞露出葉肉細(xì)胞用解剖刀刮下細(xì)胞用解剖刀刮下細(xì)胞 方法方法B B：葉片研碎、離心：葉片研碎、離心輕輕研磨輕輕研磨加研磨介質(zhì)加研磨介質(zhì)過濾、離心過濾、離心 研磨介質(zhì)：研磨介質(zhì)：40ml40ml 20umol Sucrose 20umol Sucrose 10umol MgCl 10umol MgCl2 2 20umol TrisHCL 20umol TrisHCL ( (三羥甲基氨基甲烷三羥甲基氨基甲烷 ) PH 7.8 PH 7.8 注意：注意：只有只有薄壁組織排列松散薄壁組織排列松散，細(xì)胞間結(jié)觸，細(xì)胞間結(jié)觸點(diǎn)很少時(shí)用機(jī)械法分離葉肉細(xì)胞才能取得成點(diǎn)很少時(shí)用機(jī)械法分離葉肉細(xì)胞才能取得成功。功。

3、注意注意：大麥、小麥和玉米很難通：大麥、小麥和玉米很難通過酶解法使細(xì)胞分離。過酶解法使細(xì)胞分離。（葉肉細(xì)胞伸長(zhǎng)，并在許多地方（葉肉細(xì)胞伸長(zhǎng)，并在許多地方收縮，細(xì)胞間形成一種收縮，細(xì)胞間形成一種互鎖結(jié)構(gòu)互鎖結(jié)構(gòu)，要細(xì)胞結(jié)合較為疏散的組織才宜要細(xì)胞結(jié)合較為疏散的組織才宜作為分離單細(xì)胞的材料。）作為分離單細(xì)胞的材料。）例 分離籬天劍葉肉細(xì)胞的機(jī)械方法葉片消毒勻漿過濾離心植板75酒精，7次氯酸鈉10ml培養(yǎng)基1.5克1cm2葉片低速，去碎屑，游離細(xì)胞沉降1.1.2 1.1.2 酶解法酶解法TakebeTakebe等（等（19681968）最早報(bào)道：用果膠酶處）最早報(bào)道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細(xì)

4、胞理可以分離大量的葉肉細(xì)胞加果膠酶加果膠酶過濾過濾 、離心、離心1.1.3 1.1.3 機(jī)械法和酶解法比較機(jī)械法和酶解法比較機(jī)械法機(jī)械法酶解酶解法法 細(xì)胞不受到酶的傷害；細(xì)胞不受到酶的傷害； 不用質(zhì)壁分離；不用質(zhì)壁分離； 細(xì)胞產(chǎn)量低；細(xì)胞產(chǎn)量低； 細(xì)胞易破。細(xì)胞易破。 細(xì)胞受到酶的傷害；細(xì)胞受到酶的傷害； 要質(zhì)壁分離；要質(zhì)壁分離； 細(xì)胞產(chǎn)量高；細(xì)胞產(chǎn)量高； 細(xì)胞不易破。細(xì)胞不易破。1.2 1.2 由培養(yǎng)組織（愈傷組織）分離單細(xì)胞由培養(yǎng)組織（愈傷組織）分離單細(xì)胞材料：胡蘿卜肉質(zhì)根材料：胡蘿卜肉質(zhì)根步驟：步驟：1 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織2 愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；2.植物

5、細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 技術(shù) （Suspension cultureSuspension culture）特點(diǎn)：特點(diǎn)：細(xì)胞可以不斷增殖，形成高密度的細(xì)胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)；能夠提供大量較為均勻的細(xì)胞，為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化創(chuàng)造方法和條件。必須指出：懸浮培養(yǎng)中既有單細(xì)胞，也有小細(xì)胞團(tuán)。概念：是指一種在受到不斷搖動(dòng)的液體培養(yǎng)基里，培養(yǎng)單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)的組織培養(yǎng)系統(tǒng)。搖床用于振蕩繼代懸浮2 Subculture:懸浮培養(yǎng) 將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞團(tuán)成小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞；在培養(yǎng)基中均勻分布；有空氣交流。2.1起始懸浮液的制備愈傷組織液體培養(yǎng)基搖床振蕩懸浮培養(yǎng)質(zhì)地疏松，細(xì)胞分散程度大

6、；質(zhì)地緊密，細(xì)胞分散程度小，不適于懸浮培養(yǎng)轉(zhuǎn)速30150rpm防細(xì)胞破裂2.22.2、懸浮培養(yǎng)的基本形式、懸浮培養(yǎng)的基本形式分批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)2.2.1 分批培養(yǎng)（Batch culture）含義：將細(xì)胞分散在一定容積的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中除了氣體和揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可以同外界空氣交換外，一切都是密閉的。 它是進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。如研究植物代謝的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成，細(xì)胞的活性等。2.2.1.1 2.2.1.1 分批培養(yǎng)的特點(diǎn)分批培養(yǎng)的特點(diǎn) 培養(yǎng)基體積固定 當(dāng)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡時(shí)，細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)也停止 必須適當(dāng)攪拌，促進(jìn)氧氣的溶解，和廢氣的排放。2.

7、2.1.2 繼代的方法和最佳時(shí)期 繼代方法：用注射器或移液管吸取一定量的含單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。 注意：要適當(dāng)稀釋（可以一瓶稀釋成2瓶，或者3瓶。繼代最佳繼代時(shí)期： 選擇指數(shù)生長(zhǎng)期和直線生長(zhǎng)期。2.2.1.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 在整個(gè)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長(zhǎng)停止的細(xì)胞周期。 細(xì)胞的生長(zhǎng)呈S形曲線起始期 (lag phase)指數(shù)生長(zhǎng)期(exponential phase)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(linear phase)減慢期(progressive deceleration phase)靜止期(station

8、ary phase)培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目1 12 23 34 45 51 12 23 34 45 5起始期 (lag phase) 細(xì)胞很少分裂，其時(shí)間長(zhǎng)短取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞數(shù)量的多少，細(xì)胞適應(yīng)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)環(huán)境。培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目1 12 23 34 45 51 1指數(shù)生長(zhǎng)期(exponential phase) 細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目迅速增加 培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目1 12 23 34 45 52 2對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(linear phase)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育最快的時(shí)期培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目1

9、 12 23 34 45 53 3減慢期(progressive deceleration phase) 由于培養(yǎng)基中某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)耗盡，或是由于有毒代謝產(chǎn)物的積累，細(xì)胞的增長(zhǎng)逐漸減慢。培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目1 12 23 34 45 54 4 生長(zhǎng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加極少，甚至開始死亡。穩(wěn)定期(stationary phase)培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目1 12 23 34 45 55 5小結(jié)： （1）起始的長(zhǎng)短主要取決于在繼代時(shí)原種培養(yǎng)細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)入細(xì)胞數(shù)量的多少。（2）加入條件培養(yǎng)基可以縮短滯后期。 條件培養(yǎng)基：曾培養(yǎng)過一段時(shí)間組織或細(xì)

10、胞的培養(yǎng)基。（3）縮短兩次繼代時(shí)間間隔，則可使懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一直保持指數(shù)生長(zhǎng)期。（4）如果使處在靜止期的細(xì)胞懸浮液保持時(shí)間太長(zhǎng)，則會(huì)引起細(xì)胞的大量死亡和解體。操作注意事項(xiàng)： 對(duì)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞繼代時(shí)，進(jìn)液口的孔徑要小，只能通過單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)（24細(xì)胞），使用吸管或注射器。 繼代前，培養(yǎng)容器靜置短時(shí)間，大細(xì)胞團(tuán)沉降，再吸上層懸浮液。依此，多次，可建立良好的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。2.2.2 連續(xù)培養(yǎng)（Continuous culture）加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物分：開放式連續(xù)培養(yǎng) 封閉式連續(xù)培養(yǎng)開放式和封閉式區(qū)別封閉式中：排出液中的細(xì)胞用機(jī)械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目不斷增加；開

11、放式中：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞隨同培養(yǎng)液一起流出 。連續(xù)培養(yǎng)意義：1.植物細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)的研究2.某種生長(zhǎng)限制因子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 3.次生產(chǎn)物的大量生產(chǎn) 紫杉醇是獲得美國(guó)FDA(1992)認(rèn)證的優(yōu)良抗腫瘤藥物。紅豆杉樹皮中紫杉醇的含量為萬(wàn)分之二，其在國(guó)際市場(chǎng)上售價(jià)為20萬(wàn)美元/kg 3 由懸浮細(xì)胞再生植株的途徑 由懸浮細(xì)胞直接形成體細(xì)胞胚 先將懸浮細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后再由愈傷組織分化植株3.1 懸浮培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基的要求 能用來(lái)建立生長(zhǎng)快、易散碎的愈傷組織的培養(yǎng)基，一般也適用于建立該物種的懸浮培養(yǎng)。 在活躍生長(zhǎng)的懸浮培養(yǎng)物中，無(wú)機(jī)磷酸鹽的消耗很快，不久成為限制因子。

12、要及時(shí)繼代。 Noguchi等(1977)證明，把煙草懸浮培養(yǎng)物保存在一種含有標(biāo)準(zhǔn)的MS無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)開始3d之內(nèi)無(wú)機(jī)磷酸鹽的濃度就幾乎下降為零，即使把培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度提高到原來(lái)的水平的3倍，5d之內(nèi)也會(huì)被細(xì)胞全部用完。 高等植物的懸浮培養(yǎng)，B5和ER培養(yǎng)基。3.2 條件培養(yǎng)基 把在液體培養(yǎng)基里 培養(yǎng)46周的高濃度細(xì)胞濾掉，而用他的培養(yǎng)基制成懸滴或薄層來(lái)培養(yǎng)單細(xì)胞或低密度細(xì)胞群體。3.3 培養(yǎng)基的振蕩的意義 防治細(xì)胞缺氧死亡 防治大的細(xì)胞團(tuán)的形成4 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的同步化 同步培養(yǎng)： 指在培養(yǎng)中大多數(shù)細(xì)胞都能同時(shí)通過細(xì)胞周期的各個(gè)階段。 應(yīng)用：為了便于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞代謝4.1 物理

13、方法A 按細(xì)胞團(tuán)的大小 通過對(duì)細(xì)胞物理特性（細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)的大?。┑目刂?，以實(shí)現(xiàn)高度的同步化B 低溫休克法 通過對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境條件（光照、溫度等）的控制，以實(shí)現(xiàn) 高度的同步化4.2 化學(xué)方法A 饑餓法 先對(duì)細(xì)胞斷絕一種細(xì)胞分裂所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分或激素，使細(xì)胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過一段時(shí)間的饑餓后，當(dāng)重新在培養(yǎng)基中加入這種限制因子時(shí)，靜止細(xì)胞就會(huì)同步進(jìn)入分裂。 細(xì)胞周期（cell cycle)是指細(xì)胞從第一次分裂結(jié)束產(chǎn)生新細(xì)胞到第二次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期與分裂期兩個(gè)階段。 間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）。 細(xì)胞分裂期：前期，

14、中期，后期，末期 B 抑制法 使用DNA合成抑制劑，如5-氨基尿嘧啶、羥基尿和胸腺嘧啶脫氧核苷 當(dāng)細(xì)胞受到化學(xué)藥物抑制時(shí)，細(xì)胞周期只能進(jìn)行到G1，細(xì)胞滯留在G1期S期的邊界上。5 懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量的計(jì)算細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞密實(shí)體積（PCV）5鉻酸或0.25果膠酶使懸浮細(xì)胞團(tuán)分散用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行。將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個(gè) 15ml 的離心管中，3000rpm離心，用每毫升培養(yǎng)液中細(xì)胞總體積的毫升數(shù)表示。細(xì)胞鮮重細(xì)胞干重細(xì)胞鮮重：細(xì)胞培養(yǎng)物過濾，洗去培養(yǎng)基，真空抽濾，稱重。細(xì)胞干重：60干燥12h，稱重。 以每毫升培養(yǎng)物或106個(gè)細(xì)胞的重量表示。6.培養(yǎng)細(xì)胞活力的測(cè)定相差顯微術(shù)法 TTC法

15、（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）FDA法（熒光素雙醋酸酯法）伊凡藍(lán)法(Evans blue)（FDA的互補(bǔ)法） 根據(jù)細(xì)胞質(zhì)環(huán)流和細(xì)胞核存在與否，鑒別細(xì)胞的死活。根據(jù)細(xì)胞質(zhì)環(huán)流和細(xì)胞核存在與否，鑒別細(xì)胞的死活。環(huán)流正常、核存在表明有活力；環(huán)流正常、核存在表明有活力； 在活細(xì)胞中，在活細(xì)胞中，TTCTTC被還原成紅色甲鐟，提取甲鐟用分光光被還原成紅色甲鐟，提取甲鐟用分光光度計(jì)檢測(cè)。度計(jì)檢測(cè)。 活力受損的細(xì)胞能夠攝取這種染料，完整的活細(xì)胞則不能，凡染藍(lán)色的細(xì)胞是不具有活力的細(xì)胞。FDA法的原理vFDA本身不具有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由出入細(xì)胞膜。v在活細(xì)胞中，F(xiàn)DA被酯酶裂解，釋放出有極性的熒光

16、素。v熒光素不能自由穿越質(zhì)膜，在活細(xì)胞中積累。v熒光素在死細(xì)胞中不能積累。v在UV照射下，活細(xì)胞中的熒光素發(fā)出綠色熒光。FDAFDA熒光素活細(xì)胞死細(xì)胞步驟：活活細(xì)胞死細(xì)胞FDA先用丙酮配成0.5%的母液，終濃度為0.01%思考題： 如何得到植物離體單細(xì)胞？ 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)有哪些方法？ 簡(jiǎn)述懸浮培養(yǎng)細(xì)胞同步化的方法 簡(jiǎn)述懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)的計(jì)量方法 如何獲得同步化的培養(yǎng)細(xì)胞？ 胡蘿卜的懸浮培養(yǎng) 1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1.1、過本次實(shí)驗(yàn)，熟練掌握愈傷組織繼代培養(yǎng)的基本操作技術(shù)，進(jìn)一步熟悉、規(guī)范無(wú)菌操作技術(shù)。 1.2、設(shè)計(jì)和配制胡蘿卜細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基。 1.3、學(xué)習(xí)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的操作。 2.實(shí)驗(yàn)原理

17、 在固體培養(yǎng)基中，在固體培養(yǎng)基中，植物的愈傷組織在生長(zhǎng)過植物的愈傷組織在生長(zhǎng)過程中的營(yíng)養(yǎng)成分、植物組織產(chǎn)生的代謝物質(zhì)呈現(xiàn)程中的營(yíng)養(yǎng)成分、植物組織產(chǎn)生的代謝物質(zhì)呈現(xiàn)一個(gè)梯度分布，隨著植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，離一個(gè)梯度分布，隨著植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，離愈傷組織越遠(yuǎn)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量逐漸增高。而且愈傷組織越遠(yuǎn)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量逐漸增高。而且瓊脂本身也有一些不明的物質(zhì)成分可能對(duì)培養(yǎng)物瓊脂本身也有一些不明的物質(zhì)成分可能對(duì)培養(yǎng)物產(chǎn)生影響產(chǎn)生影響。當(dāng)植物的組織在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，。當(dāng)植物的組織在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，可以通過薄層震蕩培養(yǎng)或向培養(yǎng)基中通氣用以改可以通過薄層震蕩培養(yǎng)或向培養(yǎng)基中通氣用以改善培養(yǎng)基中氧氣

18、的供應(yīng)。植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是善培養(yǎng)基中氧氣的供應(yīng)。植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是指將植物細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基指將植物細(xì)胞或較小的細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中能夠保持良好的分散中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中能夠保持良好的分散狀態(tài)。這些小的細(xì)胞聚合體通常來(lái)自植物的愈傷狀態(tài)。這些小的細(xì)胞聚合體通常來(lái)自植物的愈傷組織。組織。 3.實(shí)驗(yàn)器材 主要實(shí)驗(yàn)用具和儀器： 冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、燒杯、容量瓶、玻璃棒、醫(yī)用口杯、精密pH試紙（pH5.47.0）、藥勺、稱量紙、標(biāo)簽紙、封口膜、橡皮筋、電爐、高壓蒸汽滅菌鍋等。 藥品和試劑： MS培養(yǎng)基母液、瓊脂、蔗糖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、1molL-1HCl、1molL-1NaOH 實(shí)驗(yàn)材料：胡蘿卜的愈傷組織。4.實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟4.1 配制懸浮培養(yǎng)基 MS+3%蔗糖+200mg/L水解酪蛋白+0.5mg/L2,4-D+1.0mg/L 6-BA。 維生素C 20mg/L 4.2 接種 在無(wú)菌條件下，用鑷子夾取胡蘿卜根的愈傷組