實驗六 葉綠體的分離與熒光觀察

1、實驗六 葉綠體的分離與熒光觀察授課人： 齊云峰實驗目的實驗目的1、通過植物細胞葉綠體的分離、通過植物細胞葉綠體的分離, 了解細胞器分離了解細胞器分離的一般原理和方法。的一般原理和方法。2、觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光、觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光, 并熟悉熒并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。光顯微鏡的使用方法。實驗原理實驗原理n 細胞器分離過程包括兩個階段：細胞器分離過程包括兩個階段：破碎細胞破碎細胞和和細胞組細胞組分的分離分的分離n 在等滲溶液中進行組織勻漿、分離在等滲溶液中進行組織勻漿、分離 葉綠體的分離在等滲溶液（葉綠體的分離在等滲溶液（0.35mol/L氯化鈉氯化鈉或或0.4mol/L蔗

2、糖溶液）中進行蔗糖溶液）中進行n 葉綠體的分離采用葉綠體的分離采用差速離心差速離心或密度梯度離心或密度梯度離心n 利用利用熒光顯微鏡熒光顯微鏡觀察葉綠體的自發(fā)熒光和間接熒光觀察葉綠體的自發(fā)熒光和間接熒光（次生熒光）（次生熒光）常用的細胞破碎方法常用的細胞破碎方法離心分離技術離心分離技術n 離心是分離細胞組分和生物大分子最常用的分離方法離心是分離細胞組分和生物大分子最常用的分離方法 不同的細胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同不同的細胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力、不同介質(zhì)中沉降分離。離心力、不同介質(zhì)中沉降分離。n 分離各種細胞組分的方法主要有：分離各種細胞組分的方法主要有： 差

3、速離心差速離心 密度梯度離心密度梯度離心 速率速率-區(qū)帶梯度離心區(qū)帶梯度離心 等密度離心等密度離心差速離心差速離心n 采用逐漸提高離心速度或低速和高速交替進行離心，使各種采用逐漸提高離心速度或低速和高速交替進行離心，使各種沉降系沉降系數(shù)不同數(shù)不同的顆粒在不同的離心速度及不同的離心時間下的顆粒在不同的離心速度及不同的離心時間下分批分離分批分離的方的方法。法。 n 操作過程中一般是起始離心速度較低，讓沉降系數(shù)較大的顆粒沉降操作過程中一般是起始離心速度較低，讓沉降系數(shù)較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍懸浮在上清中。收集上清，改用較高轉(zhuǎn)速離心到管底，小的顆粒仍懸浮在上清中。收集上清，改用較高轉(zhuǎn)速離心，將

4、較小顆粒沉淀。以此類推，達到分離不同大小顆粒的目的。，將較小顆粒沉淀。以此類推，達到分離不同大小顆粒的目的。 n 方法較簡單，但分辨率方法較簡單，但分辨率不高不高。沉降系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒。沉降系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開。子不容易分開。 密度梯度離心密度梯度離心n 用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞勻漿液混懸或置于介質(zhì)的頂部，通過重梯度，將細胞勻漿液混懸或置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞器分層、分離的方法。分力或離心力場的作用使細胞器分層、分離的方法。分為為速率速率-區(qū)帶梯度離心區(qū)帶梯度離

5、心和和等密度梯度離心等密度梯度離心。n 一次離心可分離提純樣品中幾種組分，用于較精細的一次離心可分離提純樣品中幾種組分，用于較精細的分離。分離。兩種密度梯度離心方法的異同兩種密度梯度離心方法的異同差速離心與密度梯度離心的區(qū)別差速離心與密度梯度離心的區(qū)別n 差速離心是用差速離心是用不同強度的離心力不同強度的離心力使具有不同質(zhì)量的物質(zhì)分級分使具有不同質(zhì)量的物質(zhì)分級分離；密度梯度離心中單一樣品組分的分離是借助于混合樣品離；密度梯度離心中單一樣品組分的分離是借助于混合樣品穿穿過梯度層的沉降或上浮過梯度層的沉降或上浮來達到的；來達到的；n 差速離心要用差速離心要用兩個甚至更多兩個甚至更多的轉(zhuǎn)速，而密度梯

6、度離心只有的轉(zhuǎn)速，而密度梯度離心只有一個一個離心轉(zhuǎn)速；離心轉(zhuǎn)速；n 差速離心適用于分離混合樣品中各差速離心適用于分離混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大沉降系數(shù)差別較大的組分，的組分，而密度梯度離心可分離的物質(zhì)而密度梯度離心可分離的物質(zhì)密度差異較小密度差異較小。 實際操作中，差速離心和密度梯度離心相結合可以達到更精確實際操作中，差速離心和密度梯度離心相結合可以達到更精確的分離。的分離。熒光顯微鏡觀察熒光現(xiàn)象熒光顯微鏡觀察熒光現(xiàn)象n 某些物質(zhì)在一定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光某些物質(zhì)在一定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，就能在極短的時間能進入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)

7、回到基態(tài)時，就能在極短的時間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光就內(nèi)放射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光就稱為稱為熒光熒光。若停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。若停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。 n 有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后直接發(fā)出熒光，稱為有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后直接發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光自發(fā)熒光，如葉綠體的火紅色熒光。，如葉綠體的火紅色熒光。 n 有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光，這種熒光稱為能發(fā)出熒光，這種熒光稱為間接熒光間接熒光，如葉綠體吸附，如葉綠體吸附吖啶吖啶橙橙后可發(fā)桔紅色熒光。

8、后可發(fā)桔紅色熒光。 熒光染料：吖啶橙熒光染料：吖啶橙n 吖啶橙是一種與吖啶橙是一種與DNA和和RNA都能結合的熒光染料都能結合的熒光染料n 在在紫外光或藍光紫外光或藍光（330-485nm）激發(fā)下，）激發(fā)下，DNA可被激發(fā)出可被激發(fā)出530nm的發(fā)射熒光（細胞核發(fā)亮的發(fā)射熒光（細胞核發(fā)亮綠色熒光綠色熒光），），RNA可被激發(fā)出可被激發(fā)出640nm的發(fā)射熒光（核仁和胞質(zhì)的發(fā)射熒光（核仁和胞質(zhì)RNA發(fā)發(fā)橘紅色熒光橘紅色熒光）n 產(chǎn)生兩種不同熒光是由于產(chǎn)生兩種不同熒光是由于吖啶橙吖啶橙與雙鏈與雙鏈DNA和單鏈和單鏈RNA的的結合結合方式方式和和結合量結合量不同決定的。它與不同決定的。它與DNA結合是

9、嵌入雙鏈之間，結結合是嵌入雙鏈之間，結合量相對少而與合量相對少而與RNA的結合則由靜電吸引堆積在磷酸根上，結的結合則由靜電吸引堆積在磷酸根上，結合量相對較多。合量相對較多。n 推測：推測：葉綠體次生熒光的由來，大部分來自葉綠體的吸附作用葉綠體次生熒光的由來，大部分來自葉綠體的吸附作用，極少部分來自葉綠體中的，極少部分來自葉綠體中的RNA。n 加入吖啶橙后葉綠體的自發(fā)熒光（火紅色）消失了？加入吖啶橙后葉綠體的自發(fā)熒光（火紅色）消失了？ 原因：熒光淬滅現(xiàn)象所致。吖啶橙是一種原因：熒光淬滅現(xiàn)象所致。吖啶橙是一種芳香雜環(huán)離子型芳香雜環(huán)離子型染料染料，可透過細胞膜。推測吖啶橙陽離子是進入葉綠體膜，可透過

10、細胞膜。推測吖啶橙陽離子是進入葉綠體膜內(nèi)通過影響葉綠素分子結構或所處的化學環(huán)境使內(nèi)通過影響葉綠素分子結構或所處的化學環(huán)境使自發(fā)熒光自發(fā)熒光淬滅淬滅的。的。n 熒光淬滅現(xiàn)象產(chǎn)生的原因熒光淬滅現(xiàn)象產(chǎn)生的原因：分子結構和化學環(huán)境使影響物：分子結構和化學環(huán)境使影響物質(zhì)發(fā)射熒光和熒光強度的重要因素（質(zhì)發(fā)射熒光和熒光強度的重要因素（pH、溫度、光、淬、溫度、光、淬滅劑滅劑）熒光染料：吖啶橙熒光染料：吖啶橙實驗用品實驗用品n 材料材料： 新鮮菠菜新鮮菠菜 n 試劑試劑： 0.35mol/L氯化鈉溶液，氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙吖啶橙(acridine orange) n 儀器儀器：普通離心機、組織搗碎機、

11、粗天平、熒光顯微：普通離心機、組織搗碎機、粗天平、熒光顯微鏡鏡 、燒杯、量筒、滴管、離心管、試管架、紗布、燒杯、量筒、滴管、離心管、試管架、紗布、無熒光載片和蓋片等無熒光載片和蓋片等 實驗步驟實驗步驟n 新鮮菠菜葉片（去葉脈）新鮮菠菜葉片（去葉脈）30g 0.35 M NaCl 150ml，組織搗碎機低，組織搗碎機低速勻漿（速勻漿（5000rpm）35min（破碎細胞）（破碎細胞） 勻漿液勻漿液 6層紗布過濾層紗布過濾 濾液濾液1000rpm離心離心2min 棄沉淀棄沉淀，上清液，上清液3000rpm離心離心5min 棄棄上清液上清液，沉淀為葉綠體（混有部分細胞核），沉淀為葉綠體（混有部分細胞

12、核） 0.35 M氯化鈉溶液懸浮氯化鈉溶液懸浮 滴片觀察滴片觀察n 取取1滴葉綠體懸液置于載玻片上，加蓋玻片后分別用滴葉綠體懸液置于載玻片上，加蓋玻片后分別用普通光學顯微鏡普通光學顯微鏡觀觀察察葉綠體的形態(tài)結構葉綠體的形態(tài)結構和和熒光顯微鏡熒光顯微鏡觀察觀察自發(fā)熒光自發(fā)熒光n 取取1滴葉綠體懸液，滴加滴葉綠體懸液，滴加1滴滴0.01%吖啶橙熒光染料吖啶橙熒光染料，加蓋玻片后，加蓋玻片后熒光熒光顯微鏡顯微鏡觀察觀察間接熒光間接熒光葉綠體的分離與熒光觀察葉綠體的分離與熒光觀察菠菜葉手切片觀察菠菜葉手切片觀察新鮮菠菜葉，刀片切出一斜面置于載玻片上新鮮菠菜葉，刀片切出一斜面置于載玻片上 滴加滴加12滴

13、滴NaCl溶液溶液 蓋上蓋片蓋上蓋片 顯微鏡下觀察顯微鏡下觀察 注意事項注意事項n葉綠體的分離應在葉綠體的分離應在等滲溶液（等滲溶液（0.35M NaCl）中進行，以免滲透壓的改變使葉綠體受到損中進行，以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。傷。n分離過程最好在分離過程最好在0-5的條件下進行；如果在的條件下進行；如果在室溫室溫下，要下，要迅速迅速分離和觀察，控制好離心速分離和觀察，控制好離心速度和時間。度和時間。n離心機使用：離心管要離心機使用：離心管要平衡平衡n棄上清時棄上清時不要把沉淀蕩起不要把沉淀蕩起，再加，再加NaCl溶液時溶液時（少加少加，以免葉綠體太稀不易觀察）用滴管，以免葉綠體太稀不

14、易觀察）用滴管吹勻混合液，吹勻混合液，力氣不能過大力氣不能過大，以免造成葉綠，以免造成葉綠體破碎。體破碎。n熒光顯微鏡使用熒光顯微鏡使用熒光顯微鏡檢要在光線盡量熒光顯微鏡檢要在光線盡量暗暗的環(huán)境下進行的環(huán)境下進行不要直接觀察激發(fā)光源，保護眼睛不要直接觀察激發(fā)光源，保護眼睛熒光染料有一定得毒性，要熒光染料有一定得毒性，要做好防護做好防護觀察熒光受多種因素的影響，如觀察熒光受多種因素的影響，如溫度、光、淬滅劑溫度、光、淬滅劑等等在熒光觀察時應在熒光觀察時應抓緊時間抓緊時間，有必要時立即拍照，有必要時立即拍照制作熒光裝片最好使用制作熒光裝片最好使用無熒光載片、蓋片和無熒光無熒光載片、蓋片和無熒光油油

15、汞燈開啟后汞燈開啟后15min內(nèi)不要關閉內(nèi)不要關閉實驗結果實驗結果n 普通光鏡下，可看到葉綠體為普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖型綠色橄欖型，高倍鏡下可看到葉綠體，高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色顆粒，即基粒。內(nèi)部含有較深的綠色顆粒，即基粒。n 菠菜葉手切片在普通光鏡下可以看到三種細胞：菠菜葉手切片在普通光鏡下可以看到三種細胞：表皮細胞表皮細胞、保衛(wèi)細保衛(wèi)細胞胞、葉肉細胞葉肉細胞。葉肉細胞呈長方形或類方形，內(nèi)含大量帶有綠色的。葉肉細胞呈長方形或類方形，內(nèi)含大量帶有綠色的葉綠體顆粒葉綠體顆粒，后者呈單一或多個排列。另外，視野下還可見到大量，后者呈單一或多個排列。另外，視野下還可見到大量散在散在的點狀或類圓狀的點狀或類圓狀葉綠體顆粒葉綠體顆粒。n 熒光顯微鏡下，選用熒光顯微鏡下，選用藍色激發(fā)濾光片藍色激發(fā)濾光片，葉綠體，葉綠體自發(fā)熒光自發(fā)熒光為為火紅色火紅色；吖啶橙染色后吖啶橙染色后間接熒光間接熒光為為橘紅色橘紅色，細胞核細胞核呈呈綠色，氣孔綠色，氣孔仍