皺褶假絲酵母脂肪酶

1、皺褶假絲酵母脂肪酶的固定化方法比較研究姓名：崔瑩瑩 專業(yè)：生物工程學(xué)號(hào)：201102010129 指導(dǎo)老師：李 璟背景 脂肪酶作為最主要的工業(yè)酶制劑之一，能夠催化油脂類分解、交換、合成等酶促反應(yīng)，脂肪酶的固定化技術(shù)，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)重復(fù)利用和自動(dòng)化生產(chǎn)，亦可以大大提高酶的貯存穩(wěn)定性，使成本下降，在食品工業(yè)、纖維及造紙工業(yè)、生物能源、制藥工業(yè)、生物感應(yīng)器工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣泛。目的和意義 但目前我國(guó)脂肪酶的研發(fā)及產(chǎn)業(yè)化水平與國(guó)外存在較大差距，而且對(duì)于脂肪酶的固定化方法沒有進(jìn)行過系統(tǒng)的比較研究。 本研究采用不同方法固定化相同質(zhì)量的皺褶假絲酵母脂肪酶，通過測(cè)定游離脂肪酶及固定化酶的循環(huán)水解酶活得到

2、固定化酶對(duì)比游離酶的優(yōu)勢(shì)，并比較不同固定化酶方法的優(yōu)劣，為今后深入對(duì)微生物脂肪酶固定化的研究提供參考依據(jù)。實(shí)驗(yàn)流程 1.使用不同方法固定化相同質(zhì)量的皺褶假絲酵母脂肪酶 2.采用橄欖油乳化法測(cè)定游離酶與固定酶的循環(huán)水解酶活3.通過循環(huán)水解酶活的變化比較不同固定化酶方法的優(yōu)劣實(shí)驗(yàn)步驟1.海藻酸鈉包埋法制備固定化酶I.酶液的配制：稱取脂肪酶200mg，用pH為5.8的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液，稀釋至40mL，即配制成濃度為5g/L的酶液。II.固定化方法：將0.60g海藻酸鈉放入50mL燒杯中，加入20mL蒸餾水，35水浴加熱溶解，待溶液冷卻后，混合海藻酸鈉溶液與酶液，用針形注射器滴入

3、凝結(jié)劑（1% CaCl2）溶液中，35恒溫固定化1h，便制得固定化脂肪酶，過濾，用無菌蒸餾水淋洗4次，室溫干燥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.海藻酸鈉包埋法制備固定化酶這種固定化酶為球狀固體，顏色乳白接近透明，循環(huán)使用時(shí)只需倒掉反應(yīng)液就可以直接取出固定化酶，操作簡(jiǎn)單。實(shí)驗(yàn)步驟2.殼聚糖戊二醛交聯(lián)法制備固定化酶I.殼聚糖顆粒的制備：取1.00g的殼聚糖溶于30mL1%的乙酸溶液中，35水浴加熱使其充分溶解形成膠狀溶液，用注射器滴入凝結(jié)劑(1mol/L的NaOH溶液)中形成球狀顆粒，便制得殼聚糖顆粒。水洗至中性，室溫干燥。II.酶液的配置：200mg脂肪酶溶于40ml的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)中，制

4、得5g/L的酶液；III.固定化方法：取殼聚糖顆粒0.40g，加入0.05%戊二醛5mL交聯(lián)1h，用無菌蒸餾水淋洗載體，放入酶液，35恒溫固定化1h，過濾，用無菌蒸餾水淋洗4次，室溫干燥，便制得固定化脂肪酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.殼聚糖戊二醛交聯(lián)法制備固定化酶這種固定化酶為黃色固體顆粒，循環(huán)使用時(shí)只需倒掉反應(yīng)液就可以直接取出固定化酶，操作簡(jiǎn)單。實(shí)驗(yàn)步驟3.硅藻土吸附法制備固定化酶I.酶液的制備：將200mg酶粉溶解于40mL的0.025mol/L磷酸緩沖液(pH7.5)中，便制得濃度為5g/L的酶液。II.固定化酶的制備：將1.00g的硅藻土加入酶液中，35恒溫固定化1h后，將固定化載體用丙酮淋洗4次，

5、每次淋洗后4000r/min離心收集固體，使載體顆粒分散，室溫干燥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.硅藻土吸附法制備固定化酶這種固定化酶為白色粉末狀固體，循環(huán)使用時(shí)可以用過濾、離心等方法取出固體的固定化酶，操作比較簡(jiǎn)單。實(shí)驗(yàn)步驟橄欖油乳化法是使用最普遍的測(cè)定酶活方法，本實(shí)驗(yàn)采取此方法測(cè)定酶活性及酶活回收率。酶活計(jì)算公式：U=(V-V)nkm/tU樣品的酶活力；V滴定樣品時(shí)消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/ml；V滴定對(duì)照組時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/ml；n酶液的稀釋倍數(shù)；k指1mL堿中所含有的OH的微摩爾數(shù)；m固定化初始加入微生物脂肪酶的質(zhì)量；t反應(yīng)時(shí)間/min。實(shí)驗(yàn)步驟4.游離酶的循環(huán)轉(zhuǎn)脂酶活測(cè)定：取兩個(gè)三角瓶

6、，分別加入橄欖油乳化液5mL，pH緩沖液（0.05mol/L 甘氨酸NaOH緩沖液）4mL，35水浴加熱5min（預(yù)熱）后，取其中一個(gè)三角瓶加入200mg酶粉，反應(yīng)10min，加入15mL 95%乙醇中止反應(yīng)。另一個(gè)三角瓶先加15mL95%乙醇后再加200mg酶粉；兩個(gè)三角瓶各加入2滴酚酞溶液作指示劑，用NaOH溶液滴定，直至反應(yīng)液微紅色并保持30s不退色為終點(diǎn)。用pH計(jì)測(cè)定此時(shí)溶液的pH值，對(duì)照組滴定終點(diǎn)便是此pH（9.0）。記錄消耗NaOH溶液的體積。實(shí)驗(yàn)步驟4.游離酶的循環(huán)轉(zhuǎn)脂酶活測(cè)定：將所有反應(yīng)液倒入50ml離心管，4000r/min離心10min，倒出上清液將沉淀用無菌蒸餾水淋洗2次

7、（每次洗滌過后都要再4000r/min離心10min），然后將沉淀（游離酶）加入另一個(gè)含新鮮乳化液的三角瓶中，反應(yīng)10min，測(cè)定水解酶活。上述操作重復(fù)10次，計(jì)算游離酶的酶活回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.游離酶的循環(huán)轉(zhuǎn)脂酶活測(cè)定結(jié)果：如圖所示，游離酶在循環(huán)利用8次后，酶活由初始的80.4U/mg變?yōu)?3.0U/mg，反應(yīng)至第10次的酶活更是降至13.2U/mg。實(shí)驗(yàn)步驟5.固定化酶的循環(huán)水解酶活測(cè)定：實(shí)驗(yàn)共制得三種固定化酶，按照游離酶循環(huán)水解酶活的測(cè)定方法分別滴定三種固定化酶，記錄消耗的NaOH溶液的體積，并計(jì)算固定化酶的水解酶活。注意將固定化酶全部取出，即固定化酶含有脂肪酶的質(zhì)量為200mg。重復(fù)操

8、作，直至酶活明顯降低，計(jì)算固定化酶的酶活回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.固定化酶的循環(huán)水解酶活測(cè)定結(jié)果：如圖所示，海藻酸鈉包埋法制取的固定化酶在循環(huán)利用第14次后，酶活由初始的78.0U/mg變?yōu)?6.0U/mg，反應(yīng)至第16次后殘余酶活還有33.6U/mg；殼聚糖戊二醛交聯(lián)法制取的固定化酶在循環(huán)利用第17次后，酶活由初始的75.6U/mg變?yōu)?3.6U/mg，反應(yīng)至第19次后殘余酶活還有45.0U/mg；硅藻土吸附法制取的固定化酶在循環(huán)利用第10次后，酶活由初始的57.0U/mg變?yōu)?5.6U/mg，反應(yīng)至第16次后殘余酶活還有25.2U/mg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 6.游離與固定化脂肪酶循環(huán)水解酶活的比較游離酶初始酶活最高，海藻酸鈉包埋法和殼聚糖戊二醛交聯(lián)法制備的固定化酶次之，硅藻土吸附法固定化的脂肪酶酶活最低；游離酶循環(huán)水解酶活下降迅速，在反應(yīng)至第5次時(shí)就開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，而海藻酸鈉包埋法和殼聚糖戊二醛交聯(lián)法和硅藻土吸附法制備的固定化酶出現(xiàn)下降趨勢(shì)分別是在第14次、第17次和第10次。結(jié)論1.脂肪酶的固定化操作過程會(huì)造成酶活性的損失。2.通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用海藻酸鈉包埋法和殼聚糖戊二醛交聯(lián)法制備的固定化酶的水解酶活相對(duì)硅藻土吸附法較高，分別為78.0U/mg和75.6U/mg。3.使用殼聚糖戊二醛交聯(lián)法制備的固定化酶的重復(fù)使用率最高，