植物組織培養(yǎng)實驗報告

1、植 物 組 織 培 養(yǎng)實 驗 報 告學院：生命科學技術學院班級：11生物技術(制品)學號： 2011192017 ： 鵬 植物組織培養(yǎng)實驗報告實驗一 植物組織培養(yǎng)母液的配制一 、實驗目的1.了解植物組織培養(yǎng)基本培養(yǎng)基的組分及其作用。2.學習掌握植物組織培養(yǎng)MS培養(yǎng)基的配制方法。二 、實驗原理培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中離體組織賴以生存和發(fā)育的條件。大多數(shù)培養(yǎng)基的成分是有無機鹽、有機化合物（碳源、維生素、肌醇、氨基酸等）、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、水分和其他附加物等五大類物質(zhì)組成。無機鹽類由大量元素和微量元素組成。大量元素中，氮類化合物主要以硝酸類和銨類化合物的形式存在，但在培養(yǎng)基中多用硝酸類，也可以將硝酸類和銨

2、類混合使用；磷和硫常用磷酸鹽和硫酸鹽來提供；鉀是培養(yǎng)基中主要的陽離子；鈣、鈉、鎂的需要量較少。微量元素包括碘、錳、銅、鋅、鈷、鐵。培養(yǎng)基中的鐵離子，大多數(shù)以螯合物的形式存在，即硫酸亞鐵與乙二胺四乙酸二鈉的混合。有機化合物包括碳源、維生素、肌醇、氨基酸等。培養(yǎng)中的植物組織和細胞的光合作用較弱，因此，需要在培養(yǎng)基中附加一些碳水化合物物來提供營養(yǎng)需要。培養(yǎng)基中的碳水化合物通常為蔗糖。蔗糖除了作為培養(yǎng)基的碳源和能源外，對維持培養(yǎng)基的滲透壓也起著重要的作用。在培養(yǎng)基中加入維生素有助于細胞的分裂和增長。一般包括VB1、B6、煙酸、生物素、葉酸、泛酸鈣、VC。肌醇在糖類的相互轉化、維生素和激素的利用等方面具

3、有重要的催進作用。常用的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)包括以下三類：生長素類：吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）細胞分裂素：玉米素（ZT）6-芐基嘌呤（6-BA）和激動素（KT）。赤霉素：組織培養(yǎng)中使用的赤霉素只有一種，即赤霉酸（GA3）。培養(yǎng)基中的其他附加物包括人工合成和天然的有機物附加物。其中最為常見的為酵母提取物。瓊脂作為培養(yǎng)基的支持物，也是最常用的郵寄附加物，他可以是培養(yǎng)基呈固體狀態(tài)，以利于組織和細胞的培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)是否成功，在很大的程度上取決于培養(yǎng)基的選擇之上。目前普遍使用的是MS培養(yǎng)基。MS固體培養(yǎng)基可用于誘導愈傷組織，或用于胚胎、莖段、莖尖及花藥的培養(yǎng)等。MS

4、培養(yǎng)基的硝酸鹽、鉀和銨的含量略高于其他的培養(yǎng)基，也是它被普遍使用的原因之一。三 、實驗材料、試劑、配方和儀器設備 1試劑NH4NO3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,CaCl2·2H2O ,MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O Na2-EDTA,MnSO4·4H2O,ZnSO4·7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4·2H2OCuSO4·5H2O,CoCl2·6H2O,肌醇，甘氨酸，鹽酸硫胺素，鹽酸吡哆醇， 煙酸，蒸餾水。2.儀器設備 電子天平，燒杯（50ml、100ml、500ml）量筒（1000ml、1

5、00ml、25ml） ， 容量瓶(1000ml、500ml、100ml)，移液管（10ml，5ml，1ml）試劑瓶，玻璃棒數(shù)支，藥匙，稱量紙等。3、培養(yǎng)基配方各種母液的吸取量藥品名稱擴大倍數(shù)1L培養(yǎng)基吸取母液的量（mL）大量元素10100微量元素10010鐵鹽10010有機10010蔗糖30g瓊脂0.8gPH5.8-6.3MS培養(yǎng)基大量元素母液配制化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg/L)稱取質(zhì)量(g)NH4NO3165041.25KNO3190047.50KH2PO41704.25MS培養(yǎng)基微量元素母液配制化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg/L)稱取質(zhì)量(g)MnSO4·4H2O22.355.7Zn

6、SO4·7H2O8.621.5H3BO36.211.5KI0.8320.75Na2MoO4·2H2O0.256.25CuSO4·5H2O0.00250.625CoCl2·6H2O0.00250.625MS培養(yǎng)基鐵鹽母液配制化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg/L)稱取質(zhì)量(g)FeSO4·7H2O27.86.95Na2-EDTA37.39.32MS培養(yǎng)基有機物質(zhì)母液的配制化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg/L)稱取質(zhì)量(g)肌醇1002甘氨酸20.2煙酸硫胺素0.48鹽酸吡哆醇0.510煙酸0.510MS培養(yǎng)基鈣鹽和鎂鹽母液的配制化合物名稱培養(yǎng)基濃度(mg/L)

7、稱取質(zhì)量(g)CaCl2·2H2O44011MgSO4·7H2O3709.25四、 實驗步驟1 、計算：計算各化學成分所需要的量。大量、微量和鹽類按擴大50倍，定容500ml的配制計算。有機和肌醇按擴大100倍，定容200ml的配制計算。計算后制成配方表。2、制定標簽：裁取適當大小的牛皮紙，用鉛筆寫上MS，種類，并標明此類母液所含物質(zhì)，質(zhì)量，定容體積，擴大倍數(shù)吸取量，制備人，制備日期以大量為例如圖： MS鈣鹽母液CaSO4·2H2O定容 500ml吸取量 20mL/L制備人： 李 鵬配制日期： 2013.10.63、大量元素母液的配制 ：先用量筒量取300ml蒸餾

8、水放入 500ml 燒杯中，按照配方表中用量依次分別稱?。?NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 , 待第一種化合物完全溶解后再 加入第二種化合物，溶解過程用玻璃棒攪拌，當最后一種化合物完全溶解后，將溶液轉移至 500ml 容量瓶中，并用蒸餾水將燒杯和玻璃棒洗滌3次，每次約50ml，而后用蒸餾水定容至 500ml，然后轉移至細口試劑瓶中，貼上標簽，并置于冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?、微量元素母液的配制按照配方表中用量用電子天平依次稱取 MnSO4·4H2O, ZnSO4·7H2O， H3BO3, KI, Na2MoO4·2H2O。CuSO4·5H2O和

9、CoCl2·6H2O先稀釋后用移液管吸取,按制備母液 I 的方法逐個溶 解，轉移至容量瓶中，洗滌燒杯，然后定容至 500ml，轉入細口試劑瓶中，貼上標簽，注明 母液名稱，放大倍數(shù)，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、 鐵鹽母液的制備 把 FeSO4·7H2O 和 Na2-EDTA 分別置于適量蒸餾水中，加熱攪拌使之完全溶解，保持加熱，把 FeSO4 倒入 Na2-EDTA 溶液中并攪拌，接近沸騰時停止加熱，冷卻后調(diào) PH 到 5.5，將溶液轉移至 500ml 容量瓶中，洗滌后用蒸餾水定容至 500ml，轉入細口試 劑瓶中，用力振蕩 12min，貼上標簽，注明母液名稱

10、，放大倍數(shù)，配制日期， 配制人，并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、 有機化合物母液的制備按配方表中用量依次稱?。蝴}酸硫胺素,鹽酸吡哆醇，煙酸, 甘氨酸，用蒸餾水溶解后，定容200ml轉入細口試劑瓶中，貼上標簽，注明母液名稱，放大倍數(shù)，配制日期，配制人， 并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?、植物生長物質(zhì)母液制備 NAA 母液:準確稱取 10mg,用少量 1mol/L NaOH 溶解后加蒸餾水定容至 100ml,即 配制成 0.1mg/ml 的 NAA 母液，轉入細口試劑瓶中，貼上標簽，注明母液名稱， 放大倍數(shù)，配制日期，配制人，并置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?6BA 母液配制方法相似，濃度為 2mg/ml五、試驗結果分析

11、及注意事項1、配制母液時注意藥品只能出不能進。2、制作標簽時只能能用鉛筆寫，防止油性筆字跡在高壓滅菌后模糊不清。實驗二、培養(yǎng)基的制備與滅菌一 、 實驗目的1、學習母液法配制培養(yǎng)基。2、學習用牛皮紙包三角瓶口的防污染方法。3、學習并熟悉自動化滅菌鍋的操作和保護。二 、 實驗原理 為防止組織培養(yǎng)各物質(zhì)發(fā)生反應所以把微量和鐵鹽混在一起，為了避免物質(zhì)的反應，所以要迅速倒入沸騰的蒸餾水中，瓊脂應慢慢倒入，并邊攪拌邊倒入。組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基含有植物生長所必需的各類營養(yǎng)物質(zhì)， 同時也是微生物繁殖的極好場所，因此必須對培養(yǎng)基滅菌處理，以確保無菌操作的順利進行。三 、 實驗材料、試劑和儀器設備1.試劑： 瓊脂

12、，蔗糖，蒸餾水，1mol/L NaOH,各類母液2.儀器設備：電子天平，燒杯，量筒，移液管，玻璃棒，藥芍，稱量紙，PH 試紙，錐形瓶，牛皮紙，棉塞等。四、 實驗步驟1.準備 將所需的各種母液按順序放好，將潔凈的各種玻璃器皿放在指定置。2 .大量的量取 取 50ml量筒一個，將大量、有機、肌醇、鎂鹽，鈣鹽、按配方表中的用量依次稱取并倒入500ml燒杯中。3 .微量鐵鹽的量取 取 50ml 量筒一個，將微量和鐵鹽按配方表中的用量稱取并倒入100ml燒杯中。 4.培養(yǎng)基配制 取瓷盆一個，加入 1.5L 蒸餾水，置于電磁爐上加熱，將稱量好的所有母液倒入瓷盆中，用玻璃棒不斷攪拌。再稱量瓊脂 16 克，白

13、砂糖 60 克，依次倒入瓷盆中，邊倒入邊攪拌，待瓊脂和白砂糖完全溶解后，并定容至 2L。5、調(diào)PH 用 1mol/L NaOH 和1molL HCl調(diào) PH 至 6.0。6、 分裝 把培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，每瓶約50ml，用棉塞塞好再用牛皮紙，細繩包扎好，待滅菌。7、滅菌 將所有的三角瓶整齊的放在滅菌鍋的鐵絲籃中，將溫度調(diào)為121滅菌20min。滅完后擺放在水平的實驗桌上勿動。五、 試驗結果分析及注意事項 1、配制培養(yǎng)基前先大致估計一下藥品數(shù)量，不夠時提前配制。 2、三角瓶滅菌時注意要放干凈冷空氣。3、加的藥品種類較多，切忌加錯。4、注意把三角瓶用棉塞塞好和用牛皮紙包好。5、滅完菌的三角瓶勿動

14、，等待培養(yǎng)基冷卻凝固。6、瓊脂不可加太快，以防加太快瓊脂結塊。 實驗三 無菌植株的建立一 、 實驗目的1、通過實驗，初步掌握外植體材料的消毒。2、學習超凈工作臺滅菌方法和操作要求。3、學習掌握無菌接種操作技術。二 、 實驗原理 植物細胞具有全能型，其外植體接種在無菌的人工培養(yǎng)基上，給予適當?shù)臈l件能長成完整的無菌植株。三 、 實驗材料、試劑和儀器設備豌豆，1% 84消毒液，0.5升汞溶液，超凈工作臺、培養(yǎng)基，鑷子，酒精燈，噴霧器。四、 實驗步驟1.準備 打開超凈工作臺，將鑷子酒精燈放如超凈工作臺中，用紫外燈照 20min后關閉紫外燈，同時將豌豆種子用自來水沖20min關閉紫外燈后在臺上點燃 2

15、個酒精燈，用棉球?qū)㈣囎訜?次，超凈作臺少2次。將滅菌溶液，無菌水， 豌豆，大燒杯等放入超凈工作臺。 2.滅菌 在超凈工作臺上取經(jīng)浸泡處理的豌豆，先用酒精倒入種子瓶中約23消毒一次（1-2s）接著用無菌水沖洗一次。再用84 消毒液搖晃清洗清洗 3 次，每次 5 分鐘，清洗完后用無菌水沖洗一次。而后用 0.5%HgCI 泡8min，處理 2 次，每次 5 分鐘。后用無菌 水搖晃清洗 4-5次。3.接種 將所要用的三角瓶用75的酒精噴濕，接著把手噴濕并把三角瓶帶入超凈工作臺。接著將滅菌處理好的材料在超凈工作臺上用鑷子靠近酒精燈的外焰放入向下傾斜的錐形瓶杯中，每個瓶裝 4 粒豌豆，接種過程中錐形瓶應一

16、直保持向下傾斜，直到接種完畢蓋上棉塞。4.標記 接種完畢后，用棉線綁好用鉛筆在牛皮紙標上制作人，日期和“隴豌一號”，放入有光的培養(yǎng)架上。五、 試驗結果分析及注意事項1.豌豆在自來水下不能沖洗太長，以免影響發(fā)芽率。2.在豌豆滅菌時注意升汞、酒精滅菌時間應嚴格注意， 過長會對種子活性造成影響。3.升汞有劇毒，操作要小心。4.接種時瓶口一定要在酒精燈火焰上方，瓶口要朝下以減少污染率。實驗四 脫分化培養(yǎng)基的制備一、 實驗目的1、 學習脫分化培養(yǎng)基的制備。2、 熟悉MS培養(yǎng)基與脫分化培養(yǎng)基的異同。二、 實驗原理 脫分化所用到的化學物質(zhì)與MS培養(yǎng)基最大的區(qū)別是需要激素誘導。所以脫分化培養(yǎng)基需要在MS培養(yǎng)基

17、的基礎上添加激素進行愈傷誘導。三 、實驗材料、試劑和儀器設備 MS培養(yǎng)基的大量，微量，鈣鹽，鎂鹽，鐵鹽，有機，肌醇和0.1mg/ml 的 2，4-D，0.1mg/ml的6-BA，瓊脂，糖，1molL的NaOH，1molL的HCl，三角瓶，棉塞，牛皮紙，燒杯，量筒，移液管，玻璃棒，PH試紙。四、實驗步驟1.準備 將所需的各種母液按順序放好，將潔凈的各種玻璃器皿放在指定置。2 .大量的量取 取 50ml量筒一個，將大量、有機、肌醇、鎂鹽，鈣鹽、按配方表中的用量依次稱取并倒入500ml燒杯中。3 .微量，鐵鹽的量取 取 50ml 量筒一個，將微量和鐵鹽按配方表中的用量稱取并倒入100ml燒杯中。4.

18、激素的量取 用移液管量取6ml 0.1mgmL的6-BA ，用量筒量取30ml 0.1mgL的2，4-D一并到入50ml的小燒杯中。4.培養(yǎng)基配制 取瓷盆一個，加入 2L 蒸餾水，置于電磁爐上加熱，將稱量好的所有母液倒入瓷盆中，用玻璃棒不斷攪拌。接著把激素加入，邊倒入邊攪拌再稱量瓊脂 15克，白砂糖 90克，依次倒入瓷盆中，邊倒入邊攪拌，待瓊脂和白砂糖完全溶解后，并定容至 3L。5、調(diào)PH 用 1mol/L NaOH 和1molL HCl調(diào) PH 至 6.0。6、 培養(yǎng)基分裝 把培養(yǎng)基分裝到60個三角瓶中，每瓶約50mL，用棉塞塞好再用牛皮紙，細繩包扎好，待滅菌。7、滅菌 將所有的三角瓶整齊的放在滅菌鍋的鐵絲籃中，將溫度調(diào)為121滅菌20min。滅完后擺放在水平的實驗桌上勿動，等待凝固。五、試驗結果及注意事項 注意事項1、三角瓶滅菌時注意要放干凈冷空氣。2、加的藥品種類較多，切忌加錯。3、注意把三角瓶用棉塞塞好和用牛皮紙包好。4、滅完菌的三角瓶勿動，等待培養(yǎng)基冷卻凝固。5、瓊脂不可加太快，以防加太快瓊脂結塊。實驗五 豌豆莖、葉愈傷組織的建立一 、實驗目的1、學習組培接愈傷操作技術。2、了解最佳接愈傷的植物組織部位。3、通過誘導豌豆莖、葉形成愈傷組織學習愈傷組織的建立方法。二 、實驗原理植物細胞具有全能性，已經(jīng)分化的植物細胞在適宜條件下可脫分化形成愈傷組