單個(gè)核細(xì)胞促血漿凝固活性監(jiān)測(cè)急性排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

1、單個(gè)核細(xì)胞促血漿凝固活性監(jiān)測(cè)急性排斥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究許秀芳石鏡李溫斌陳寶田 摘要目的：探討將外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)的促血漿凝固活性(PCA)用于急性排斥反應(yīng)（AGR）監(jiān)測(cè)的可能性。方法：將新西蘭白兔隨機(jī)分為3組：第1組做自體皮膚移植(8只)，第2、3組做異體皮膚移植(8、3只)，第3組于術(shù)前1 d至術(shù)后7 d皮下注射環(huán)孢霉素A 5 mg/(kg.d)。術(shù)后每天觀(guān)察移植皮片的變化。術(shù)前1 d及術(shù)后隔日取耳緣靜脈血測(cè)PCA和激活淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)取移植皮膚組織作病理檢查。結(jié)果：同種異體皮膚移植動(dòng)物在出現(xiàn)AGR前，其PBMNC離體后不經(jīng)培養(yǎng)即表現(xiàn)較強(qiáng)的促凝活性(SPCA)，經(jīng)供體抗原刺激后的P

2、CA(DAgPCA)活性也于AGR 前開(kāi)始增強(qiáng)，而且表明具有抗原特異性。結(jié)論：PCA檢測(cè)方法在AGR早期監(jiān)測(cè)方面有一定的應(yīng)用前景。 關(guān)鍵詞皮膚移植急性排斥反應(yīng)PCA 中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)R392.7 Study on monitoring acute graft rejection by PCA of MNC XU Xiu-Fang, SHI Jing, LI Wen-Bin et al. Department of Cellular Immunology, Beijing Heart Lung and Blood Vessel Institute, Beijing 100029 AbstractO

3、bjective:The sequential changes of procoagulant activity(PCA) level in mononuclear cells (MNC) of rabbits which received skin allograft were studied in the paper in order to assess it as a marker for monitoring of acute graft rejection (AGR). Methods:New Zealand white rabbits(NZW)were random divided

4、 into three groups: rabbits in group 1(control) received autogenous skin transplants; rabbits in group 2, 3 received allogenic skin transplants(a grey rabbit as a donor), and rabbits in group 3 were treated with cyclosporin A (CsA) at 5 mg/(kg.d) once daily subcutaneously for up to 9 days since the

5、day before operation. Heparinized peripheral blood was drawn from each animal on the day of the operation and every other day after the operation. MNC were separated by Ficoll-Hypaque before PCA measurement. The activated lymphocytes were counted at the same time. Morphologic changes of the skin gra

6、fts were observed every day after transplant operation. Results:PBMNC of the animals which received allograft had larger amounts of PCA before the day of AGR, in addition, donor antigen during culture of PBMNC further enhanced PCA(DAgPCA) level in animals with AGR. Conclusion:PCA may be as markers o

7、f AGR. DAgPCA is a specific marker. Key wordsSkin allograftAcute graft rejectionPCA 臟器移植面臨的一個(gè)重要問(wèn)題是急性排斥反應(yīng)(AGR)，選擇非創(chuàng)傷性的免疫檢測(cè)指標(biāo)及早期預(yù)測(cè)AGR一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。在AGR的早期，受者的淋巴細(xì)胞與移植物表面的異己抗原相遇后，T淋巴細(xì)胞受到該抗原刺激而被激活。激活的T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生凝血激酶樣物質(zhì)或稱(chēng)細(xì)胞相關(guān)因子，它是一種膜脂蛋白，能激活凝血系統(tǒng),表現(xiàn)PCA活性1。 本文擬以同種異體皮膚移植的新西蘭白兔(New Zealand white rabbits,NZW)作

8、為檢測(cè)對(duì)象，進(jìn)一步觀(guān)察發(fā)生AGR前后的免疫反應(yīng)過(guò)程中外周血單個(gè)核細(xì)胞PCA水平的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以探討PCA作為急性排斥反應(yīng)檢測(cè)指標(biāo)的可能性。 1材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚移植受者：NZW，雌雄不限，青壯年兔，19只。皮膚移植皮片供者：青紫蘭灰兔,2只。正常兔血漿供者：NZW，雌雄不限,青壯年兔，6只。以上所用27只兔均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育場(chǎng)，于一級(jí)動(dòng)物室喂養(yǎng)。無(wú)關(guān)抗原供者：大鼠，1只，約250 g，Wistar系，由本所動(dòng)物室提供。 1.2皮膚移植手術(shù)及藥物處理麻醉：氯胺酮44 mg/kg， 腹腔注射。皮膚移植2：自體皮膚移植：剪下8只白兔3 cm3 cm全層皮片分別作原

9、位移植，為第1組。同種異體皮膚移植：將灰兔皮膚3 cm3 cm大小分別移植在11只白兔背部皮床，其中8只不給免疫抑制藥為第2組，3只于術(shù)前1 d至術(shù)后7 d每天皮下注射環(huán)孢霉素A 5 mg/(kg.d)為第3組。 1.3檢查方法 1.3.1肉眼觀(guān)察及照相移植后每天早晚各觀(guān)察皮片1次并攝像記錄。移植皮片存活的表現(xiàn)：粉紅色、皮薄、質(zhì)柔軟；發(fā)生AGR時(shí)皮片的表現(xiàn)：皮片變硬、點(diǎn)狀或片狀發(fā)黑3。觀(guān)察同時(shí)照相。 1.3.2移植皮片病理標(biāo)本檢查移植后隔日取全層皮片少許置于10%福爾馬林中固定，待做普通病理檢查。 1.3.3PCA的測(cè)定操作實(shí)驗(yàn)用的血漿制備和PCA測(cè)定參照武建國(guó)的方法4。單個(gè)核細(xì)胞懸液制備：移

10、植術(shù)當(dāng)天及術(shù)后1、3、5、7、9、11、13 d取移植受者NZW耳緣靜脈血各2 ml分離單個(gè)核細(xì)胞，加RPMI 1640，制成1107 ml-1細(xì)胞懸液4。供體抗原的制備：用供體耳靜脈血，分離MNC制備出供體抗原。大鼠抗原的制備：以大鼠脾臟MNC制備大鼠抗原（RAg）。MNC的處理：1107 ml-1MNC懸液加于微孔培養(yǎng)板孔內(nèi)，每只動(dòng)物的MNC分裝8孔，分為4組（a 、b 、c 、d），每組2孔。a組細(xì)胞即刻測(cè)PCA；b組細(xì)胞孔內(nèi)加RPMI 1640；c組細(xì)胞孔內(nèi)加供體抗原；d組細(xì)胞孔內(nèi)加大鼠抗原，b 、 c 、d 3組細(xì)胞置37水浴溫育2 h。PCA測(cè)定：a 、b 、c 、d 各組細(xì)胞1

11、000 r/min，離心20 min，棄盡上清后，分別加混合血漿和CaCl2，立即記時(shí)，記錄血漿凝固時(shí)間（以秒為單位）。各組的血漿凝固時(shí)間分別以a 、 b 、 c 、 d表示。血漿復(fù)鈣時(shí)間（A）測(cè)定：混合血漿加CaCl2后，立即記時(shí)，記錄血漿凝固時(shí)間4。 1.3.4PCA百分率計(jì)算方法自然PCA（Spontaneous PCA, SPCA） 1.4激活淋巴細(xì)胞百分率（Actlym%）測(cè)定MNC懸液制備完成后立即涂片，顯微鏡下觀(guān)察計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞率。 1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理各組動(dòng)物各時(shí)間段的SPCA%及Actlym%、DAgPCA%、RAgPCA%等測(cè)值及出現(xiàn)AGR時(shí)間以均值標(biāo)準(zhǔn)差表示,SPCA與CPCA

12、和SPCA與Actlym作直線(xiàn)相關(guān)和直線(xiàn)回歸分析。 2結(jié)果 2.1移植皮片生長(zhǎng)情況 確定AGR的肉眼觀(guān)察指標(biāo)是移植皮片變硬及出現(xiàn)黑點(diǎn)。自體皮片移植組,皮片生長(zhǎng)良好,8 d傷口痊愈,皮片顏色和硬度始終正常,未出現(xiàn)AGR；同種異體移植皮片發(fā)生AGR的時(shí)間:未給CsA的第2組為(7.750.71) d，給CsA的第3組為(11.670.58) d。 2.2各組SPCA%、CPCA%、Actlym%和DAgPCA%的水平動(dòng)態(tài)第1組受者術(shù)后SPCA%、CPCA%和Actlym% 3項(xiàng)指標(biāo)始終無(wú)明顯升高；第2組和第3組受者術(shù)后SPCA%、CPCA% 、Actlym%和DAgPCA%在AGR出現(xiàn)前23 d開(kāi)

13、始升高，于AGR當(dāng)天或前1 d達(dá)高峰，該4項(xiàng)指標(biāo)在此之前均維持在基礎(chǔ)水平，見(jiàn)圖1。 圖13組動(dòng)物DAgPCA%變化時(shí)間曲線(xiàn) Fig.1Changes of DAgPCA% in three groups Note:vertical line shows the time of AGR 對(duì)19只動(dòng)物共112次的測(cè)定值所作的相關(guān)分析表明SPCA%和Actlym%呈顯著正相關(guān)（r=0.923,P0.001,Y=1.244X+2.268）。 SPCA%與CPCA%測(cè)值呈顯著正相關(guān)(r=0.972,P 0.001,Y=1.641X-10.341),回歸方程顯示SPCA較CPCA敏感。 2.3RAgPCA

14、%的水平動(dòng)態(tài)各組術(shù)后RAgPCA%均保持在基礎(chǔ)水平，無(wú)升高趨勢(shì)。 2.4病理檢查病理報(bào)告同種移植術(shù)后第1天和自體移植術(shù)后第1天相似,都是無(wú)明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),同種移植皮片于AGR發(fā)生前23 d血管增多,有散在的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn),AGR發(fā)生時(shí)即第2組術(shù)后第7天和第3組術(shù)后第11天可見(jiàn)真皮廣泛的單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn);自體移植皮片于術(shù)后第7天無(wú)明顯單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)。 3討論 器官移植術(shù)后須監(jiān)測(cè)AGR的發(fā)生,對(duì)于某些器官（例如心臟）移植受者,目前還主要依靠心肌心內(nèi)膜活檢來(lái)診斷AGR。 免疫學(xué)工作者們?cè)谥铝τ谔接懫鞴僖浦睞GR的無(wú)創(chuàng)傷性免疫學(xué)監(jiān)測(cè)指標(biāo),例如血清白細(xì)胞介素2受體（sIL-2R）等，但是至今尚未被臨床工

15、作者采納，其原因可考慮這些免疫指標(biāo)測(cè)定值個(gè)體差異甚大,不易劃出正常值和AGR參考值之間的界限，而且在感染時(shí)這些指標(biāo)也升高,迄今所見(jiàn)文獻(xiàn)上發(fā)表的免疫指標(biāo)除CD4/CD8之外都不能鑒別AGR和感染。本文期望采用經(jīng)改進(jìn)PCA法來(lái)找出解決上述問(wèn)題的途徑。 有人認(rèn)為MNC經(jīng)體外培養(yǎng)后產(chǎn)生PCA活性，本文稱(chēng)這種PCA為CPCA。我們的實(shí)驗(yàn)表明剛分離出來(lái)的PBMNC即可測(cè)出PCA，本文稱(chēng)之為SPCA，并發(fā)現(xiàn)SPCA與CPCA呈顯著正相關(guān)。因?yàn)镾PCA有所需時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便及反應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn),所以今后可選用SPCA。由于SPCA屬于非特異性指標(biāo)，所以單根據(jù)SPCA升高并不能確認(rèn)AGR的發(fā)生。SPCA與其他免疫學(xué)指標(biāo)一樣，由于其基礎(chǔ)測(cè)值個(gè)體差異較大，使臨床工作者難于判斷某一次檢測(cè)結(jié)果的臨床意義。本文的數(shù)據(jù)顯示出，各個(gè)體的SPCA時(shí)間曲線(xiàn)圖形很相似，可考慮將某個(gè)體的基礎(chǔ)測(cè)值即術(shù)后第1天的測(cè)值作為自身正常參照值，用以衡量以后的測(cè)值是否升高及升高的幅度。 我們用供體抗原刺激PBMNC 2 h（37）之后測(cè)定PCA（DAgPCA),結(jié)果顯示自體移植受者的DAgPCA都不升高,而同種移植的第2組動(dòng)物在AGR發(fā)生前23 d DAgPCA就開(kāi)始升高,并迅速達(dá)到高峰,第3組動(dòng)物在用CsA期間DAgPCA不升高，而在停藥后出現(xiàn)AGR前23 d測(cè)值升高，在A