核酸的提取、純化和電泳檢測實驗報告

1、分子生物學實驗 山東大學 生命科學學院核酸的提取、純化和電泳檢測摘要質粒是獨立存在于染色體外、能自主復制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，但在細菌細胞中含量最多。提取和純化質粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯度離心法等等，其中堿變性法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，是基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的，本實驗采用堿變性法提取E.coli DH5中Puc19質粒DNA，并通過RNase消化及酚-氯仿抽提除去質粒DNA溶液中的RNA以及RNase等一些可

2、溶性蛋白，最后獲得純度較高的質粒DNA。細菌基因組DNA呈環(huán)狀裸露于擬核區(qū)，本實驗中細菌染色體DNA的提取采用試劑盒的方式。本實驗的目的在于掌握堿變性法提取質粒DNA及染色體DNA提取的原理、各種試劑的作用和方法，掌握DNA的純化方法，即用RNase消化RNA以及用酚、氯仿抽提法除去質粒中的蛋白質，學習并掌握凝膠電泳進行DNA的分離純化及純度檢測的實驗原理，凝膠的制備及電泳方法及相應的方法操作。關鍵詞 質粒DNA 堿變性提取法 瓊脂糖凝膠電泳 細菌染色體DNA引言1. 核酸分離純化1.1總原則保證核酸一級結構的完整性化學損傷縮短化學試劑作用時間，以減少其對核酸的損失； 物理損傷動作輕柔以減少機

3、械剪切力；盡量低溫操作以減少高溫損傷； 生物降解加入相應酶抑制劑，防止生物降解排除其他分子的污染 蛋白質苯酚/氯仿/蛋白酶K RNA污染RNase 其他DNA區(qū)別變性與復性 有機溶劑萃取、乙醇沉淀與洗滌 金屬離子乙醇沉淀與洗滌1.2核酸純化應達到的要求 核酸樣品不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子 其他生物大分子的污染應降到最低程度 排除其他核酸分子的污染1.3核酸提取的一般過程 破碎細胞（防止核酸酶的作用） 破碎抽提核酸(裂解細胞釋放內容物)關鍵步驟 核酸的純化除去雜質（蛋白質、脂類、核酸）4°C最佳和最簡單；-70°C是長期保存的良好溫度，為一次性保存；

4、-20°C 核酸樣品的保存（主要條件時溫度和介質）-TE緩沖液最常用2. 質粒DNA的提取及純化堿變性提取法（堿裂解/變性法）RNase消化及酚-氯仿抽提2.1 質粒DNA的制備方法 質粒(Plasmid)是獨立存在于染色體外、能自主復制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，但在細菌細胞中含量最多。細菌質粒大小介于1200Kb之間，是應用最多的質粒類群，在細菌細胞內它們利用宿主細胞的復制機構合成質粒自身的DNA。 提取和純化質粒DNA的方法很多，目前常用的有：堿變性提取法、煮沸法、羥基磷灰石柱層析法、EB-氯化銫密度梯

5、度離心法和Wizard法等。其中，堿變性提取法最為經(jīng)典和常用，適于不同量質粒DNA的提取。該方法操作簡單，易于操作，一般實驗室均可進行。提取質粒DNA純度高，可直接用于酶切、序列測定及分析。EB-氯化銫密度梯度離心法，主要適合于相對分子質量與染色體DNA相近的質粒，具有純度高、步驟少、方法穩(wěn)定，且得到的質粒DNA多為超螺旋構型等優(yōu)點，但提取成本高，需要超速離心設備。少量提取質粒DNA還可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的質粒DNA中常含有RNA，但不影響限制性核酸內切酶的消化、亞克隆及連接反應等。 在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質粒分子大小、堿基組成和結構等特點以及質粒

6、DNA的用途進行選擇。本實驗選擇堿裂解法提取質粒DNA。 提取原則：盡量保持核酸的完整性，即保持天然狀態(tài)，防止核酸酶對核酸的降解（生物損傷），也要防止化學因素（酸、堿等）或物理因素（高溫、機械剪切等）引起核酸變性或破壞。最大限度減少染色體DNA的污染，去除RNA、可溶性蛋白質雜質。2.2 堿裂解法 堿裂解/堿變性法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，是基于染色體DNA（線性DNA）與質粒DNA（超螺旋DNA）的變性與復性的條件差異而達到分離目的。質粒DNA 具特定的形態(tài)結構，在特殊的環(huán)境條件下，如加熱、極端pH值、有機溶劑、尿素、酰胺試劑等會導致質粒DNA變

7、性，去除變性條件又可以使DNA復性。堿裂解法根據(jù)共價閉合環(huán)狀質粒DNA和線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質粒DNA。在細菌細胞中，染色體DNA以雙螺旋結構存在，質粒DNA以共價閉合環(huán)狀形式存在。SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能裂解細菌細胞，又能使細菌蛋白質變性。SDS處理細菌細胞后會導致細菌細胞壁破裂，從而使質粒DNA及細菌基因組DNA從細胞中同時釋放出來，但兩者變性與復性所依賴的溶液pH值不同。在pH12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而變性；共價閉合環(huán)狀質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會完全分離。當以pH4.8的KAc(或N

8、aAc)高鹽緩沖液調節(jié)其pH值至中性時，因為共價閉合環(huán)狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，變性的質粒DNA恢復原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋構型，而溶解于溶液中；而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那么迅速而準確，染色體DNA不能復性而與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起形成纏連的、可見的網(wǎng)狀結構呈白色絮狀沉淀，這種沉淀通過離心，與復性的溶于溶液的質粒DNA分離。溶于上清的質粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA與RNA性質類似，乙醇沉淀DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RN

9、ase A將RNA降解。質粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質粒DNA，之后可再用超離心、電泳、離子交換柱層析等方法進一步純化質粒。 堅韌細胞壁、細胞膜染色體DNARNA、可溶性蛋白質溶菌酶、SDS變性復性條件不同蛋白酶、RNase、有機溶劑總結：堿變性法提取質粒DNA一般包括三個基本步驟：培養(yǎng)細菌細胞以擴增質粒；收集和裂解細胞；分離和純化質粒DNA。 3. 細菌染色體DNA的提取3.1細菌基因組DNA特點細菌的染色體基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成細菌的染色體相對聚集在一起，形成一個較為

10、致密的區(qū)域，稱為類核（nucleoid）。類核無核膜與胞漿分開，類核的中央部分由RNA和支架蛋白組成，外圍是雙鏈閉環(huán)的DNA超螺旋。染色體DNA通常與細胞膜相連，連接點的數(shù)量隨細菌生長狀況和不同的生活周期而異。在DNA鏈上與DNA復制、轉錄有關的信號區(qū)域與細胞膜優(yōu)先結合，如大腸桿菌染色體DNA的復制起點（OriC）、復制終點（TerC）等。細胞膜在這里的作用可能是對染色體起固定作用，另外，在細胞分裂時將復制后的染色體均勻地分配到兩個子代細菌中去。有關類核結構的詳細情況目前尚不清楚。具有操縱子結構（有關操縱子結構詳見基因表達的調控一章）其中的結構基因為多順反子，即數(shù)個功能相關的結構基因串聯(lián)在一起

11、，受同一個調節(jié)區(qū)的調節(jié)。數(shù)個操縱子還可以由一個共同的調節(jié)基因（regulatorygene）即調節(jié)子（regulon）所調控。在大多數(shù)情況下，結構基因在細菌染色體基因組中都是單拷貝但是編碼rRNA的基因rrn往往是多拷貝的,這樣可能有利于核糖體的快速組裝，便于在急需蛋白質合成時細胞可以在短時間內有大量核糖體生成。3.2細菌染色體DNA提取的原理 基因工程實驗所需要的基因組DNA通常要求分子量盡可能大，以此增加外源基因獲得率，但要獲得大片段的DNA非易事。細菌基因組是環(huán)狀DNA，在抽提過程中，不可避免的機械剪切力必將切斷DNA。因此要盡可能地溫和操作，減少剪切力，減少切斷DNA分子的可能性；分子

12、熱運動也會減少所抽提到的DNA分子量，所以提取過程也要盡可能在低溫下進行。另外細胞內及抽提器皿中污染的核酸酶也會降解制備過程中的DNA，所以制備過程要抑制其核酸酶的活性。在提取過程中EDTA的作用就是螯合二價金屬離子，起到抑制核酸酶活性的作用。 與質粒DNA相比選擇瓊脂糖凝膠濃度應低。4.瓊脂糖凝膠電泳進行DNA的分離純化4.1電泳電泳(electrophoresis)是帶電物質在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。凝膠是支持電泳介質，它具有分子篩效應。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會發(fā)生移動，

13、移動的速度可因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA片段，是分子生物學的核心技術之一。凝膠電泳技術操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠(ethidium bromide，EB)或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實驗。分子生物學中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小

14、和孔徑，也能以許多不同的構型和方位進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸(5500bp)的分離和蛋白質電泳。它的分辨率非常高，長度上相差1bp或質量上相差0.1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行DNA序列分析的分子基礎。雖然它能很快地進行電泳，并能容納較大的DNA上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物，由-D-吡喃半乳糖與3,6-脫水-L-吡喃半乳糖組成，相對分子質量為104-105。瓊脂糖加熱至90左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，其凝固點為40-45。瓊脂糖凝膠相對于聚丙烯酰胺凝

15、膠分辨率低，但它的分離范圍更大(50至百萬bp)，小片段DNA(50-20000bp)最適合在恒定輕度和方向的電場中水平方向的瓊脂糖凝膠內電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA片段，進一步純化DNA等。4.2瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳，以瓊脂糖凝膠為支持物，利用DNA 泳動時的電荷效應和分子篩效應，使不同大小的DNA分子根據(jù)分子量而分離，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠(EB)或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20 Pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。4.21瓊脂糖每一個瓊脂糖鏈含有大約8

16、00個分子，瓊脂糖聚合鏈形成螺旋狀纖維聚集成直徑20-30nm的超螺旋結構。纖維是半剛性的，瓊脂糖濃度不同，形成的纖維長度不同。固化的時候，螺旋纖維形成三維的篩網(wǎng)，瓊脂糖濃度不同，形成的通道直徑50nm到>200nm，三維結構依賴于氫鍵維持，加熱成液體狀態(tài)就破壞了氫鍵?！经傊堑哪z性是由存在的氫鍵所致，凡是能破壞氫鍵的因素都能導致凝膠性的破壞?！?.22電泳遷移速率的影響因素 糖凝膠電泳是一種常用的方法，溶液中，核酸在溶液中由于磷酸基而帶負電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移速率主要取決于下面六個因素：樣品DNA分子的大?。弘娪緯r，線性雙螺旋DNA分子是以頭尾位向前

17、遷移的，其遷移速度與分子量（所含堿基）的對數(shù)值成反比，這是因為大分子有更大的摩擦阻力。DNA分子的構象：分子量相同而構象不同的DNA分子，其遷移速率不同。在抽提質粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋的共價閉合環(huán)狀結構的質粒DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA）的一條鏈斷裂，變成開環(huán)DNA(open circle DNA, ocDNA）分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉變?yōu)榫€狀DNA (Liner DNA）分子。這三種構型的分子（圖1-3-1）有不同的遷移率。一般情況下，超螺旋型（cccDNA )遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的是開環(huán)狀（

18、ocDNA）分子。圖1不同構象DNA表1 分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度直接影響凝膠的孔徑，一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的泳動速度不同。通常凝膠濃度愈低，則凝膠孔徑愈大，DNA電泳遷移速度越快，即分子量越大，選用的凝膠濃度應越小。（分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度見圖3）電泳所用電場：低電壓條件下，線性DNA片段的遷移速率與所用電壓成正比。電壓愈高帶電顆粒泳動愈快，但隨著電場強度增加，高分子量DNA的泳動速率以不同幅度增加，因此凝膠電泳分離DNA的有效范圍隨著電壓上升而減小，為了獲得DNA片段的最佳分離效果，電場強度應小于5v/cm。

19、電泳緩沖液: 在進行分子電泳時所使用的緩沖溶液，用以穩(wěn)定體系酸堿度。常見的核酸電泳緩沖液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。緩沖液的組成和離子強度直接影響遷移率，當電泳液為無離子水（如不慎在凝膠中忘記加緩沖液，即誤用蒸餾水配置凝膠），溶液的導電性很少，帶電顆粒泳動很慢，DNA幾乎不移動；而在高離子強度下（如錯用10×電泳緩沖液），導電性極高，帶電顆粒泳動很快，產(chǎn)生大量的熱，有時甚至熔化凝膠或使DNA變性。注意：1、維持合適的pH。電泳時，正極發(fā)生氧化反應（4OH-+4e-à2H2O+O2)，負極發(fā)生還原反應（4H+4e-à 2H2)，長時間的電泳將使正極變酸，

20、負極變堿。一個好的緩沖系統(tǒng)應有較強的緩沖能力，使溶液兩極的pH保持基本不變。2、使溶液具有一定的導電性，以利于DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩沖液中應含有0.01-0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢；太高時就會造成過大的電流使膠發(fā)熱甚至熔化。3、電泳緩沖液還有一個組分是EDTA，加入濃度為1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等離子，防止電泳時激活 DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉淀。溫度：DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的行為受堿基組成和凝膠溫度影響不明顯。不同大小DNA片段的相對電泳遷移率在430內無變化，一般瓊脂糖凝膠電泳多在室溫下進行，而當瓊脂

21、糖含量少于0.5時凝膠很脆弱，最好在4下電泳以增加凝膠強度。4.23 EB染色DNA的呈現(xiàn)：瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠中的DNA可使用熒光染料溴化乙錠顯現(xiàn)并檢測。圖2 溴化乙錠（見圖2）是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的堿基之間（見圖3），并在300 nm波長的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來顯現(xiàn)凝膠中的核酸分子。在適當?shù)娜旧珬l件下，熒光的強度是同DNA片段的大小（或數(shù)量）成正比。 將已知濃度的標準樣品（如/Hind）作為對照，電泳并經(jīng)EB染色后，就可以根據(jù)DNA條帶的寬度與亮度估計出待測樣品的濃度。 脂糖凝膠電泳時，使用EB對DNA染色的方法有兩種：在制膠中與電泳緩沖液

22、中同時加入0.5 g/mL的溴化乙錠。圖3在電泳結束以后，取出瓊脂糖凝膠，放在含有0.5 g/mL的溴化乙錠的水溶液中染色10 min。此染色法能準確測定DNA的大小與濃度。4.24瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度 電泳后的瓊脂糖凝膠直接在紫外燈下拍照，只需要510 ng DNA，就可以從照片上比較鑒別。如用肉眼觀察，可檢測0.050.1g的DNA。由于電泳時所用樣品非常少，而且操作簡便，所以在基因工程中經(jīng)常被用作檢測DNA樣品。但是瓊脂糖凝膠電泳法進行定量是基于目測，所以是估計水平，不如用紫外分光光度計法精確。4.25瓊脂糖凝膠電泳鑒定核酸純度：在瓊脂糖凝膠電泳上可以觀察到染色體DNA、質粒DN

23、A和RNA的電泳區(qū)帶，跑在溴酚藍前面的就是RNA。由此可分析樣品的純度。4.26瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA分子量：在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關系。因此，該法還可用于分子量的測定。將未知分子量的DNA樣品與已知分子量大小的標準DNA片段進行電泳對照，觀察其遷移距離，就可以獲得該樣品的分子量大小。下圖是常用的DNA分子量標準物的遷移圖譜和片段大小。正文1.材料和方法1.1材料1.11、實驗材料pUC19質粒DNA樣品-菌株【E. coli DH5 (pUC19)】堿裂解法提取DNA標準分子量-超螺旋質粒DNA Marker；商品（純化的）pUC19質粒DNA (20ng

24、/µl)；純化的 DNA (10ng/µl)； pUC19 /HindIII。細菌染色體DNA-黃色黏球菌 DK1622（特性：基因組全長913Mb，代時：4小時，胞外基質富含粘多糖）1.12、溶液和試劑質粒DNA的提取堿變性提取法溶液I：50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl (pH 8.0）， 10mM EDTA (pH 8.0），高壓滅菌15min，儲存于4°C)溶液II（0.2N NaOH， 1% SDS，用2M NaOH及10%SDS現(xiàn)用現(xiàn)配）溶液III（5M醋酸鉀 KAc-HAc，pH 4.8，貯存于4°C）TE溶液（10mM Tris

25、-HCl(pH 8.0) ，1mM EDTA (pH 8.0) ）RNase母液：將RNA酶A溶于10mmol/L Tris.Cl（pH=7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100°C加熱15min，使混有的DNA酶失活，冷卻后用1.5mleppendorf管分裝成小份保存于-20°C。氨芐青霉素（Amp）儲存液：100µg/ml水溶液，過濾除菌，-20°C保存。預冷無水乙醇，70%乙醇質粒DNA的純化RNase消化及酚-氯仿抽提Tris飽和苯酚溶液苯酚：氯仿：異戊醇溶液（25：24:1）氯仿：異戊醇溶液NaAc溶液(pH=

26、5.2)70%乙醇，無水乙醇 DNA的檢測瓊脂糖凝膠電泳分離DNA瓊脂糖（agarose）。50 × TAE: 242 g Tris base、57.1 mL冰乙酸、100 mL 0.5mol/L EDTA (pH 8.0)，去離子水定容至1L。à使用濃度： 1 × TAE 溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB）：儲存液濃度10mg/mL，工作濃度0.5 µg/mL水溶液。6/10 ×上樣緩沖液：30/50%甘油、0.25% 溴酚蘭（bromophenol blue，BPB）、0.25% 二甲苯青FF。其它：LB瓊脂平板，LB液體培

27、養(yǎng)基，冰乙醇，70%乙醇細菌染色體DNA的提取試劑盒：Bacteria DNA isolation kit （Omega）1.13、儀器恒溫振蕩培養(yǎng)箱，高速冷凍離心機，漩渦振蕩儀，離心管，不同型號的吸頭，微量移液器等，培養(yǎng)皿，三角瓶，燒杯，天平，微波爐，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，電子天平，手套，紫外燈，Eppendorf管等。1.2實驗方法1.21質粒DNA的提取、純化和電泳質粒DNA的提取堿變性提取法I細菌培養(yǎng)在含有氨芐青霉素（100µg/ml）的LB瓊脂平板上挑取攜帶有質粒pUC19的E.coli 單菌落，接種（液壁交界面）于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 200rmp

28、振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)菌液以1%接種量接種到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中（Amp終濃度 (100µg/ml)），37，200rpm培養(yǎng)46h，即到達菌體生長的對數(shù)晚期。II準備工作用桌上的燒杯或搪瓷杯取一杯冰；將小燒杯放在天平上，調至平衡；每組取出一支滅菌的100ml離心管，標記上“組號-1”，稱量并記錄其重量w1IIIEcoil菌株收獲（：4°C操作） 取已稱量過且重量標記為W1的滅菌離心管，。 倒入菌液至距瓶口1/3處，兩兩配平； 6000rpm，離心5min，棄上清（二樓樓梯口右側）； 加入5ml 溶液，渦旋， 6000rpm，5min，棄上清；將離心管倒置，使上清

29、液全部流盡，用吸水紙擦干，稱重，記為w2，并計算w2-w1。IV細胞裂解提取質粒DNA （ 4°C操作）每100mg菌體量，加入 （按菌體量接近的重新分組，溶液I補平） 1.0 mL 溶液，充分渦旋振蕩，使細菌完全分散；用溶液I再次配平； 2.0 mL 溶液，輕柔顛倒混勻，冰浴3-5min； 1.5 mL 溶液，輕柔顛倒混勻，冰浴5min； 12000rpm, 15min；小心轉移上清到新的離心管內，記錄體積V。加入2V冰乙醇，顛倒混勻；-20，15min； 12000rpm，15min，棄上清；加入5mL70%乙醇，12000rpm，3min，吸棄上清。重復乙醇洗滌一次；37風干5

30、-10min。分次加入1mL TE溶液并轉移到Ep管中，得質粒DNA粗提物；質粒DNA的純化RNase消化及酚-氯仿抽提IRNase消化除去RNA向質粒DNA粗提取物中加入5l RNase A（10mg/ml)，終濃度為50g/mL，37孵育1-2小時II 酚-氯仿抽提1mL粗提取物均分于兩個Ep管中。分別加入等體積的Tris飽和苯酚溶液，渦旋，12000rpm，離心5min。轉移上清（V1）至新管，加入等體積V1 苯酚：氯仿：異戊醇溶液，渦旋，12000r/min離心5min 轉移上清（V2）液至新管， 加入等體積V2氯仿：異戊醇溶液，渦旋，12000r/min離心5min。轉移上清至新管（

31、V3），加入1/10 V3體積的3M NaAc溶液(pH=5.2)，再加入2 V4(V4 =1/10V3 +V3)冰乙醇，混合均勻，于-20保存30min。12000r/min離心15min，棄上清。加入70%乙醇500L洗滌，12000r/min離心2min，棄上清。重復洗滌一次，吸棄上清，37風干5min。每管加入25uLTE溶解沉淀，合并，得到50uL純化質粒DNA。質粒DNA純度檢測瓊脂糖凝膠電泳分離DNA用50× TAE配制2L1×TAE；正確組裝制膠槽+制膠板+樣品梳；取40mL1×TAE至250mL干凈紅蓋瓶中，稱0.4g瓊脂糖，倒入三角瓶混勻，輕旋

32、瓶蓋，微波爐加熱沸騰3-4次，至澄清無顆粒；冷至60左右，加入 20µl 1mg/ml的溴化乙錠（EB）溶液，使終濃度為0.5mg/ml，混勻后倒入制膠槽中，冷卻凝固待用；取2.0l 純化DNA+2 l ddH2O+1.0l 上樣緩沖液（6×loading buffer），吹吸混勻；將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中，添加1×TAE至高出膠面約1mm。將上述混合好的DNA樣品，按照下表順序，點樣到凝膠中。泳道12345678樣品超螺旋markerpUC19pUC19/HindIII12345樣量6(µl)5.0(µl)5.0(µl)5.

33、0(µl)同前5.0(µl)泳道91011121314151617樣品超螺旋marker6（+）6（-）78910pUC19/HindIIIpUC19樣量6.0(µl)同前5.0(µl)5.0 (µl)5.0(µl)電泳儀使用操作：1.首先用導線將電泳槽的兩個電極與電泳儀的直流輸出端聯(lián)接，注意極性不要接反。2.電泳儀電源開關調至關的位置，電壓旋鈕轉到最小，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。（100-120V）3.接通電源，緩緩旋轉電壓調節(jié)鈕直到達到的所需電壓（一般是5V/cm），設定電泳終止時間，此時電泳即開始進行，DNA樣

34、品從負極向正極移動，待觀察到負極有氣泡升起方可離開。4. 當前沿DNA接近膠的前端時，切斷電源，停止電泳（大約1h，100V），工作完畢后，應將各旋鈕、開關旋至零位或關閉狀態(tài)，并撥出電泳插頭，（未向凝膠中加入EB時，應取出凝膠用于染色）用凝膠成像儀觀察，記錄結果。1.22.染色體DNA的提取、純化和電泳I細菌培養(yǎng)將黃色黏球菌菌液32 200rmp振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)菌液以1%接種量接種到液體培養(yǎng)基中，32，200rpm震蕩20h，即可收集菌體提取DNA。II菌體收集 將培養(yǎng)液倒入1.5mlEp管中，10.000rpm，2min，棄上清； 重復收集一次，3.0ml/組 菌體沉淀中加入500&

35、#181;lTE，充分渦旋重懸；（同時收集兩管，TE重懸后合并） 10，000rpm，離心2min，盡可能吸棄上清III 細胞裂解 菌體沉淀中加入200µl BTL buffer，渦旋重懸； 加入25µl proteinase K溶液，渦旋混勻 55°C水浴45min；期間每15-20min 震蕩混勻一次IV DNA純化 加入25µl RNase A，顛倒混勻； 37°C水浴 30min； 12,000rpm，5min 沉淀不溶性細胞碎片； 小心轉移上清到一新的Ep管中； 加入220µlBDL buffer，顛倒混勻； 65°

36、;C水浴10min，促進DNA溶解； 加入220µl無水乙醇，充分渦旋，確保沒有任何沉淀； 將DNA純化柱（藍色）組裝到2ml收集管上； 將上述樣品全部、小心轉移到柱子中； 12，000rpm，1min使DNA結合，棄流出液； 將柱子組裝到第二個收集管上，加入500µl buffer HB； 12，000rpm，1min，棄流出液；將柱子組裝到同一個收集管中，加入700µl wash buffer 12，000rpm，1min，棄流出液； 重復洗滌一次； 使用同一收集管，13000rpm，2min，以去除殘留的乙醇； 將柱子組裝到新的EP管上，加入50µ

37、l65°C 預熱的Elution Buffer，室溫靜置5min； 12，000rpm，1min，收集DNA； 重復收集一次；IV 0.8%瓊脂糖凝膠制備正確組裝制膠槽+制膠板+樣品梳；取40mL1×TAE至250mL干凈紅蓋瓶中，稱0.3g瓊脂糖，倒入三角瓶混勻，輕旋瓶蓋，微波爐加熱沸騰3-4次，至澄清無顆粒；冷至60左右，加入 20µl 1mg/ml的溴化乙錠（EB）溶液，使終濃度為0.5mg/ml，混勻后倒入制膠槽中，冷卻凝固待用（不少于30min）；V 電泳上樣取1.0l 純化DNA+4.0 l ddH2O+1.0l 上樣緩沖液（6×loadin

38、g buffer），吹吸混勻；將凝膠連同制膠板一同放入電泳槽中，添加1×TAE至高出膠面約1mm。將上述混合好的DNA樣品，按照下表順序，點樣到凝膠中。泳道1234567樣品DNA/HindIII 12345作用MarkerMarker樣量5.0(µl)5.0(µl)6.0(µl)泳道891011121314樣品DL5000678910/HindIII作用MarkerMarker樣量5.0(µl)6.0(µl)5.0(µl)2.實驗結果及分析2.1質粒DNA的提取、純化和電泳2.11實驗現(xiàn)象記錄及分析經(jīng)過細菌培養(yǎng)與菌體收集后

39、共得到0.170g菌體實驗步驟堿變性提取法RNase消化及酚-氯仿抽提試劑溶液溶液溶液冰乙醇Tris飽和苯酚溶液苯酚：氯仿：異戊醇溶液氯仿：異戊醇溶液NaAc溶液、冰乙醇現(xiàn)象渾濁粘稠狀，較透明白色絮狀沉淀沉淀溶液分成兩層，下層為黃色，上層為無色，兩層交界處有白色沉淀析出溶液分成兩層，下層為黃色，上層為無色，兩層交界處有少量白色沉淀析出分上下兩層，均為無色透明液體，但有較為清晰的分相面有沉淀產(chǎn)生分析渦旋振蕩，使細胞完全分散，而溶液為等滲溶液，又使細胞不至于破裂SDS使細胞膜破裂，內容物釋放絮狀物成分：蛋白質、染色體DNA、部分RNA。線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，不能復性而與不穩(wěn)

40、定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起形成纏連的、可見的網(wǎng)狀結構呈白色絮狀沉淀，白色是蛋白質的顏色，DNA為無色。無水乙醇是DNA 的沉淀劑，奪去DNA周圍的水分，使DNA失水而易于聚合，形成沉淀酚是強的蛋白變性劑,可以蛋白質變性析出，由于酚的密度大位于下層，呈黃色有機相，溶解有質粒DNA的無色水相位于上層，中間析出的白色沉淀為變性的蛋白質。氯仿可以使蛋白質變性同時可以抽提苯酚，異丙醇消除氣泡有助于分相。由于氯仿密度大于水，下層為氯仿，上層為溶有質粒DNA的水溶液NaAc溶液中Na+中和DNA分子表面的負電荷，使其不帶電荷而聚集，乙醇與水親和力強于DNA，奪走DNA結合的水分子使DNA分

41、子聚集生成沉淀2.12實驗結果圖示染色體DNA片段雜質蛋白質雜質與染色體DNA復合體凝膠成像1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17儀拍照如下bp 1184910085802361225026399730492087圖1. 堿裂解法提取質粒pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠電泳RNA污染（未加入RNase對照）1：超螺旋marker ；2：pUC19（2686bp）；3：pUC19/HindIII；4-8,10-15: 提取質粒（其中11為提純過程中未加入RNase的對照組）；9：超螺旋marker；16：pUC19/HindIII；17：pUC19本組為

42、6組，所提取的質粒DNA電泳結果對應10泳道2.13電泳結果及分析電泳結果（分泳道）描述及分析泳道2：超螺旋構型的pUC19，分子量為2868bp，介于超螺旋marker最下方（分子量最?。﹥蓷l帶之間，由于點樣量為100ng，因而亮度為超螺旋marker電泳條帶中除5026分子量片段（150ng）外其他片段（50ng）亮度的2倍。泳道3：pUC19/HindIII，被HindIII切過的pUC19質粒應絕大多數(shù)因DNA雙鏈被切開而成為線性構型。質粒的不同構型雖然分子量相同，但是構型不同會導致電泳遷移速率的差異，運動最快的是未被切開的超螺旋構型，遷移量最大，條帶位于最下方，其次是線型，最慢的是開

43、環(huán)狀分子，位于最上方，圖中可見的只有最下方的超螺旋構型條帶和位于最上方的開環(huán)狀分子條帶，且超螺旋構型條帶亮度更大，說明比例更高，而本應占絕大比例的線狀構型則幾乎沒有，說明此次酶切效率較低，甚至可能此次實驗所用的HindIII已不具有活性。泳道10：為本組提取pUC19質粒電泳結果，自下而上分別為蛋白質-DNA復合物，染色體DNA雜帶，超螺旋質粒DNA帶與泳道2超螺旋構型的pUC19電泳結果相對比，提取的質粒DNA與商品的pUC19質粒DNA不在同一條帶上，而在商品pUC19質粒DNA條帶的下面，可見出現(xiàn)了最下方電泳遷移速率快于超螺旋構型的pUC19的物質，不符合預期的結果，由于本實驗中質粒片段

44、化的可能性極低，而且此現(xiàn)象出現(xiàn)在所有的組中，因而排除個人操作問題，可能的解釋是質粒pUC19由于某種原因構型發(fā)生變化，螺旋程度更高，因而電泳遷移速率更快，遷移量更大。pUC19質粒構型改變的原因可能是提取pUC19質粒的E.coli DH5菌種存在變異，培養(yǎng)過程中丟失了部分序列，或者是試劑的原因,使質粒DNA鏈螺旋化程度增加。具體原因需要進一步酶切鑒定。本次實驗中只有10組有成帶系的超螺旋構型的pUC19，本組即6組因為量較少，超螺旋構型pUC19雖然可辨但是不成帶系。遠離下方超螺旋構型pUC19條帶（位于中間偏上）的白色亮區(qū)是由于加入溶液II或溶液III后過度震蕩使大腸桿菌基因組DNA斷裂形

45、成的可溶于水的較小片段。由于分子量較大進入膠后無法繼續(xù)運動。留滯于孔內和孔的附近的白色區(qū)域是提取質粒DNA過程中未除干凈的蛋白質，其與DNA纏繞因而也顯色。本實驗中未能將蛋白質除凈的原因可能是在酚-氯仿抽提時未能充分渦旋使酚和氯仿充分與蛋白質接觸，因而殘留一部分未變性而滯留于水溶液中的蛋白質，或者在吸取上清液時吸入少量已經(jīng)變性沉淀的蛋白質，在電泳時，與大分子染色體DNA碎片結合，由于蛋白質帶相反電荷，有向相反方向運動的趨勢，因而無法進膠電泳而留滯于孔中。開環(huán)質粒DNA和線性質粒DNA的電泳條帶不清晰，因此樣品中含有少量線形和環(huán)狀DNA.泳道11：未加入RNase除RNA雜質的pUC19質粒電泳

46、結果，最下方高亮白色區(qū)域為RNA，由于RNA分子量較小，性質與質粒DNA相似，若不用RNase降解則無法與質粒RNA分離，在電泳過程中電泳遷移速率最快，遷移距離最遠，位于最下方，RNA片段大小不一，因而呈片狀分布而不是清晰的帶狀。由此可知RNase 降解RNA效率較高，若不用RNase處理則RNA雜質對最終結果影響較大。結論及分析提取質粒的電泳結果并不符合預期，提取的質粒DNA的遷移距離大于相應pUC19質粒的商品標準的遷移距離，原因可能有兩個，提取的質粒DNA分子量小于pUC19質粒的商品標準，問題可能出于菌株的變異。提取質粒的帶型并不正常，不屬于基本帶型中超螺旋型、線型和開環(huán)型的任何一種，

47、而是在分子量不改變的前提下，螺旋程度高于超螺旋構型，可能的原因一是菌株變異，二是試劑的影響。提取質粒的質量（純度）：分離純化的質粒DNA樣品中含有殘存染色體DNA片段，圖中可從（位于中間偏上）白色亮區(qū)觀察得知，是由于加入溶液II或溶液III后過度震蕩（時間較長或動作力度過大）使細菌染色體DNA斷裂形成可溶于水的較小片段（但仍大于質粒DNA），為了避免染色體DNA斷裂殘留雜質，應注意在加入溶液II或溶液III后顛倒混勻時應動作輕柔且要注意控制時間。分離純化的質粒DNA樣品中并不含有殘存RNA，可以通過對比泳道11（未加入RNase處理），沒有位于下方的小分子條帶，說明RNA雜質去除較為徹底。分離

48、純化的質粒DNA樣品中含有蛋白質雜質，可從孔中和孔附近的白色亮區(qū)觀察得知，原因可能是在酚-氯仿抽提時未能充分渦旋使酚和氯仿充分與蛋白質接觸，應注意在用有機試劑抽提蛋白質時充分混勻使反應充分進行，另一方面在進行酚-氯仿抽提時，吸取上清液時可能吸入少量的蛋白質，應注意在取上清液時不可求快，剩余少量時換小量程減小抽力，控制好槍尖的位置，慢速進行操作。提取質粒的相對定量，估計樣品的濃度 =75ng / µ l （利用已知質量的商品DNA為依據(jù)，如泳道1中的超螺旋質粒DNA Marker或者泳道2的 100ng pUC19 質粒DNA）。溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或R

49、NA分子的堿基之間，并在300 nm波長的紫外光照射下放射出熒光，所以可用來顯現(xiàn)凝膠中的核酸分子。在適當?shù)娜旧珬l件下，熒光的強度是同DNA片段的大?。ɑ驍?shù)量）成正比。 將已知濃度的標準樣品作為對照，電泳并經(jīng)EB染色后，就可以根據(jù)DNA條帶的寬度與亮度估計出待測樣品的濃度。已知濃度的標準樣品：Supercoiled DNA Ladder Marker(濃度 : 500 ng/ 6l )：由 8種超螺旋的質粒DNA 構成，DNA Size大小如表，每次取6 l 電泳時，每條帶的DNA量約為50 ng，其中5 kbp條帶的DNA量約為其他條帶的3倍 (150 ng)，顯示亮帶。大?。╞p）2,087

50、3,0493,9975,0266,1228,02310,08511,849DNA量（ng） 50505015050505050上樣量直接上樣：6l泳道10為本組提取的質粒DNA，與泳道1的超螺旋Marker相對照，本組提取質粒DNA電泳發(fā)光后的亮度與超螺旋Marker中分子量為5,026（150ng）超螺旋條帶的亮度相近，估計值為150ng，加樣量中純化DNA的量為2µl，則估計樣品的濃度 =總質量估計值/加樣量中純化DNA量=150ng/2µl=75ng / µ l 2.2細菌染色體DNA的提取、純化和電泳：2.21實驗現(xiàn)象記錄及分析實驗步驟細胞裂解試劑BTL

51、bufferproteinase K現(xiàn)象渦旋后溶液由黃色粘液狀變成較清的黃色溶液，產(chǎn)生較多氣泡，有沉淀產(chǎn)生。黃色變淡分析BTL buffer中含有SDS產(chǎn)生較多氣泡，使細胞膜溶解，溶液變澄清，同時也釋放色素，溶液變?yōu)辄S色。沉淀為不溶性細胞碎片降解蛋白質，使細胞裂解，與SDS一起作用活性較高，色素被降解而黃色變淡2.22實驗結果圖示蛋白質雜質與染色體DNA復合體1413121110987654321凝膠成像儀拍照如下完整染色體DNAbp 2313094166557436123222027bp 2313094166557436123222027圖1. 堿裂解法提取質粒pUC19 DNA的瓊脂糖凝膠

52、電泳bp 20001000750500250100圖2. 黃色黏球菌提取染色體DNA的瓊脂糖凝膠電泳 1：DNA Marker；2：/HindIII；3-7,9-13: 提取的染色體DNA；8：DL2000 Marker;14：/HindIII Marker本組為6組，所提取的染色體DNA電泳結果對應9泳道泳道1：DNA Marker，DNA是噬菌體中的DNA，呈線狀。分子量為，與/HindIII Marker分子量為23130的條帶處于同一水平線上，DNA的分子量顯然大于其片段，但是由于瓊脂糖凝膠濃度選擇范圍限制，0.8%分離范圍僅為0.220kb，大于20kb的DNA片段不可被分離而相互堆

53、疊。泳道2：/HindIIIDNA呈線狀且有7個HindIII酶切位點，切割后應形成8個分子量各不相同的DNA片段，但圖中之可見6個片段，DNA片段的分子量從上到下（遷移距離增加）亮度依次減弱，分子量最大的亮度最大，缺失了兩條分子量最小的條帶。分析原因同樣分子數(shù)條件下，分子量越大結合EB越多，顯像越亮，相反分子量越小結合EB少，EB在電場作用下向相反方向運動，分子量小的DNA片段運動快，與EB充分接觸機會少，而且由于遷移距離大，最終所到達的位置EB含量較少，因此顯色暗，甚至無法從圖中辨別。若要使小分子片段DNA顯像，需要提高加樣量。條帶向上彎曲原因：上樣量較多；電泳液、膠中離子濃度不同；孔不光

54、滑，可能是拔梳子時有縱向滑動。泳道8/14：DL2000 Marker，最上方為分子量2000的DNA片段，與/HindIII分子量為2027的條帶位置相近。泳道9：為本組（6組）提取的細菌染色體DNA，2、4、5組點樣孔中有明顯的熒光（該熒光應為染色體DNA提取物中殘留的蛋白質與DNA交聯(lián)所致）。說明蛋白質降解不徹底，可能是proteinase K或BDL buffer處理時間較短不充分，或者使用buffer HB、wash buffer清洗雜質不夠徹底。在點樣孔下放距離很近的膠中可以觀察到少量的熒光，據(jù)推測這部分應為較完整的染色體DNA。因為真正完整的染色體DNA由于分子量大應與蛋白質纏繞

55、留滯于孔中或者入膠但由于分子量較大（黃色黏球菌基因組全長達913Mb，在0.8%的瓊脂糖凝膠中幾乎無法遷移）無法繼續(xù)運動而位于孔的附近，但本組結果中孔及孔附近的亮度較低，說明完整的染色體DNA較少，染色體DNA在提取時有丟失或者破裂程度較高。圖中所示的亮條帶并非只是一種分子量的DNA片段，由于染色體DNA隨機斷裂成分子量不一的片段，但是受到0.8%的瓊脂糖凝膠分離范圍的限制，只可分離0.220kb的DNA片段，大于20kb的DNA片段會超過分辨范圍而相互堆積。造成染色體DNA斷裂程度較高的原因可能是DNA釋放后，操作過程中混勻的動作較為劇烈，應注意一旦染色體已經(jīng)釋放，動作要輕柔謹慎。由于瓊脂糖

56、凝膠濃度選擇范圍限制，0.8%分離范圍僅為0.220kb，低于0.6%會使凝膠易脆，又由于細菌染色體分子量較大以Mb計量，即使是染色體DNA的片段也很大，因而不能用常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳確定提取的染色體DNA片段大小。分子量較小、遷移量較大的DNA片段在圖中并未充分顯像，但這并不代表染色體DNA斷裂沒有形成較小分子量的片段，在調整亮度的過程中隱約可見亮帶以下部分有彌散分布的灰白色暗區(qū)，推測為有隨機斷裂形成的分子量較小的不均勻DNA片段，分子量較小、遷移量較大的DNA片段在圖中并未充分顯像是由于在同樣分子數(shù)條件下，分子量越大結合EB越多，顯像越亮，相反分子量越小結合EB少，EB在電場作用下向相反方向運動，分子量小的DNA片段運動快，與EB充分接觸機會少，顯色暗，甚至無法從圖中辨別。若要使分子量較小的片段顯像，需要提高加樣量。2.3質粒DNA與細菌染色體DNA提取實驗的比較2.31實驗結果電泳顯像后，要的目的條帶不同，質粒DNA提取純化