微生物發(fā)酵提高玉米豆粕型日糧營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的初步研究

1、微生物發(fā)酵提高玉米豆粕型日糧營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的初步研究摘要: 對(duì)玉米 豆粕型日糧進(jìn)行混菌固態(tài)發(fā)酵，以去除其中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。研究結(jié)果表明，發(fā)酵飼料的抗原蛋白發(fā)生了大幅的降解，發(fā)酵后蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在 18 kDa 以下，小于5 kDa的小分子肽含量從發(fā)酵前的 1 35%提高到了 3 60%，蛋白質(zhì)的體外消化率提高了 4 0 個(gè)百分點(diǎn)。發(fā)酵飼料的棉子糖家族寡糖被徹底降解，其淀粉含量降低了 3 5 個(gè)百分點(diǎn)，直鏈淀粉含量提高了4 13 個(gè)百分點(diǎn)，有益的代謝產(chǎn)物乳酸等有機(jī)酸的含量達(dá)到 2 78% ，pH 下降至 4 43。關(guān)鍵詞: 玉米; 豆粕; 微生物; 發(fā)酵Abstract: Corn soyb

2、ean meal diet was fermented by mixed strains via solid state fermentation to removethe anti nutrient factor The results showed that antigen proteins in fermented feed were degraded sharp-ly The relative molecular weight of proteins after fermentation were gathered below 18 kDa，and peptidesbelow 5 kD

3、a were increased from 1 35% to 3 60% ，accordingly the protein digestibility in vitro was in-creased 4 0% Besides，raffinose family oligosaccharides were degraded thoroughly，while the starch con-tent decreased 3 5% ，the amylose increased 4 13% ，organic acids content including lactic acid reached to2 7

4、8% ，and the pH decreased to 4 43Key words: corn; soybean meal; microbe; fermentation目前，國(guó)內(nèi)飼料主要以玉米 豆粕型為主，其中玉米作為主要的能量飼料，常常占到日糧組成的60% 左右，而豆粕是動(dòng)物日糧中蛋白質(zhì)的主要來(lái)源，提供飼料工業(yè) 75% 的飼用蛋白1。豆粕和玉米中含有的多種抗?fàn)I養(yǎng)因子制約著玉米 豆粕型日糧的利用率，影響動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。玉米 豆粕型日糧中的抗?fàn)I養(yǎng)因子主要是抗原蛋白和棉子糖家族寡糖等?？乖鞍字饕谴蠖骨虻鞍? 11S) 與 伴大豆球蛋白( 7S) ，能夠引起動(dòng)物腹瀉、生長(zhǎng)受阻等過(guò)敏反應(yīng)2 4。棉

5、子糖家族寡糖主要是棉子糖和水蘇糖等低聚糖，由于動(dòng)物小腸黏液中缺乏 半乳糖苷酶，這些低聚糖不被消化而直接進(jìn)入大腸中，被結(jié)腸中的微生物發(fā)酵產(chǎn)生甲烷和二氧化碳等氣體，引起動(dòng)物胃腸脹氣5。目前，通過(guò)添加酶制劑可以有效降解此類抗?fàn)I養(yǎng)因子，2012 年 第 37 卷 第 3 期 中 國(guó) 油 脂27但由于酶底物專一性的限制和處理成本偏高，目前在大宗飼料原料的處理上使用缺乏經(jīng)濟(jì)性。因此，處理成本相對(duì)低廉的微生物發(fā)酵法日益受到人們的青睞和重視。發(fā)酵方法不但可以有效消除各類抗?fàn)I養(yǎng)因子，而且可以產(chǎn)生多種功能性和營(yíng)養(yǎng)性的乳酸、小肽等有益代謝物，既提高了飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和利用效率，還可以賦予飼料特殊氣味，提高動(dòng)物適口性。

6、本研究通過(guò)混合固態(tài)發(fā)酵法去除玉米 豆粕型日糧中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，均衡其蛋白結(jié)構(gòu)和氨基酸組成，并改善淀粉結(jié)構(gòu)組成，同時(shí)積累有益的代謝產(chǎn)物，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。1 材料與方法1 1 材料玉米粉、豆粕、麩皮購(gòu)自無(wú)錫市三里橋糧油市場(chǎng); 胃蛋白酶( 110 000) 、胰蛋白酶( 1 250) 、 淀粉酶和馬鈴薯直鏈淀粉購(gòu)自 Sigma 公司; 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自 MBI Fermentas 公司; 其他試劑均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司。預(yù)制硅膠層析板購(gòu)自青島海洋化工有限公司。枯草芽孢桿菌、酵母和乳酸菌均為本實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株。1 2 發(fā)酵飼料的制備枯草芽孢桿菌、酵母和乳酸菌分別以 5% 的接種量接種于 100

7、 g 原料( 玉米粉 60 g，豆粕 20 g，麩皮 20 g) 中，料水比為10 8，35發(fā)酵48 h，65烘干，粉碎得到發(fā)酵飼料。1 3 淀粉含量測(cè)定1 3 1 總淀粉含量測(cè)定粉碎的樣品脫脂、洗去可溶性糖后，在 淀粉酶作用下水解，再用鹽酸水解成單糖，最后按還原糖測(cè)定，并折算成淀粉含量6。1 3 2 直鏈淀粉含量測(cè)定樣品經(jīng) 1793 改良提取器脫脂，之后分散在氫氧化鈉溶液中，向一定的試樣分散液中加入碘試劑，然后使用分光光度計(jì)于 720 nm 處測(cè)定顯色復(fù)合物的吸光度7。參照馬鈴薯直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中直鏈淀粉含量。1 4 低聚糖的測(cè)定81 4 1 樣品制備準(zhǔn)確稱取粉碎玉米 豆粕型日糧(

8、 60 目)10 000 g，加入 50 00 mL 80% 的乙醇，水浴 70 浸提 1 h 以上，過(guò)濾取上清液，用 80% 乙醇洗滌 3 次，合并濾液，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至 5 mL 左右，定量轉(zhuǎn)移到 25 mL 容量瓶中，并以 80% 的乙醇定容。樣品液用低溫高速離心機(jī)于 12 000 × g、4離心 1min，4 保藏備用。1 4 2 TLC 檢測(cè)采用 TLC 方法直接觀察棉子糖和水蘇糖的降解情況，在預(yù)制硅膠層析板上點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為 5 L，點(diǎn)樣后用展開劑( 體積比1101 的正丙醇 乙酸 水) 展層，展開至離前沿 2 cm 處，用 1% 1 萘酚的含 10%正磷酸的 95%

9、乙醇溶液顯色，烘箱 100保溫 10 min。1 5 蛋白含量及氨基酸組成測(cè)定粗蛋白含量的測(cè)定: 凱氏定氮儀測(cè)定; 氨基酸的測(cè)定: 氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。1 6 抗原蛋白測(cè)定分別精確稱取發(fā)酵前和發(fā)酵后的樣品各 1 00g，用 0 03 mol / L Tris HCl 緩沖液( pH 8 0) 10 00mL 浸提 1 h，然后于 3 000 × g、4 離心 10 min，取上清液，再于 10 000 × g、4離心 10 min，4 保藏備用。SDS PAGE 按照參考文獻(xiàn)9進(jìn)行。1 7 小分子肽含量測(cè)定參考大豆肽粉的測(cè)定方法測(cè)定玉米 豆粕型日糧中肽的含量。酸溶蛋白的含

10、量減去游離氨基酸的含量即為肽的含量10。1 8 蛋白質(zhì)的體外消化率蛋白質(zhì)的體外消化率采用胃蛋白酶和胰蛋白酶兩步法測(cè)定11。1 9 總酸含量的測(cè)定總酸含量按照參考文獻(xiàn)12進(jìn)行，結(jié)果以乳酸含量計(jì)。2 結(jié)果與討論2 1 蛋白含量及氨基酸組成的變化采用凱氏定氮法測(cè)定發(fā)酵前后飼料中的粗蛋白含 量 ，結(jié) 果 表 明 粗 蛋 白 含 量 由19 16% 提 高 到20 74% 。利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定發(fā)酵前后飼料中氨基酸組成的變化，結(jié)果如表 1 所示。表 1 發(fā)酵前后飼料中氨基酸組成的變化 %組 成 發(fā)酵前 發(fā)酵后 組 成 發(fā)酵前 發(fā)酵后賴氨酸 0 76 0 88 甘氨酸 078 092蛋氨酸 0 21

11、0 29 蘇氨酸 050 057天冬氨酸 1 68 1 90 精氨酸 100 115谷氨酸 3 34 3 76 丙氨酸 092 110絲氨酸 0 84 0 94 酪氨酸 047 050組氨酸 0 43 0 45 半胱氨酸 018 020亮氨酸 2 37 2 75 纈氨酸 085 098脯氨酸 2 42 2 83 苯丙氨酸 087 099異亮氨酸 1 07 1 22 總計(jì) 1603 18262 8CHINA OILS AND FATS 2012 Vol. 37 No. 3從表 1 可以看出，發(fā)酵后氨基酸總量從原來(lái)的16 03% 提高到 18 26% ，各種氨基酸成分也比發(fā)酵前均有所提高，其中賴氨

12、酸提高了 15 79%，蛋氨酸提高了 38 01%。2 2 抗原蛋白的變化豆粕中的蛋白質(zhì)主要包括大豆球蛋白( 11S) 和 伴大豆球蛋白( 7S) ，其中 伴大豆球蛋白包括、'和 3 種亞基。這些抗原蛋白及各種抗?fàn)I養(yǎng)因子影響動(dòng)物的生長(zhǎng)率、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響腸內(nèi)環(huán)境導(dǎo)致過(guò)敏，造成的免疫反應(yīng)導(dǎo)致氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性等13。采用 SDS PAGE 電泳法測(cè)定發(fā)酵后抗原蛋白降解情況，結(jié)果如圖 1 所示。從圖 1 可以看出，發(fā)酵后大分子蛋白特別是抗原蛋白明顯降解，而小分子蛋白含量增加。在 SDS PAGE 電泳圖的基礎(chǔ)上考察了發(fā)酵前后玉米 豆粕型日糧中相對(duì)分子質(zhì)量在 5

13、kDa 以內(nèi)的小分子肽含量的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后小分子肽含量從1 35% 提高到 3 60% 。小分子肽能完整地通過(guò)腸黏膜細(xì)胞進(jìn)入體循環(huán)14，它的吸收具有轉(zhuǎn)運(yùn)速度快、耗能低、載體不易飽和等優(yōu)點(diǎn)15，此外小分子肽還具有促進(jìn)肌紅細(xì)胞復(fù)原，促進(jìn)微量元素吸收，能提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能16。2 3 蛋白質(zhì)體外消化率的變化微生物發(fā)酵后，大分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化以及小分子蛋白質(zhì)含量的提高都會(huì)影響動(dòng)物的消化率。采用胃蛋白酶 胰蛋白酶兩步法測(cè)定發(fā)酵前后飼料蛋白質(zhì)的體外消化率，結(jié)果如圖 2 所示。從圖 2 可以看出，日糧中蛋白質(zhì)的體外消化率從發(fā)酵前的85 9% 提高到 89 9% 。說(shuō)明小分子肽和氨基酸含量的提高，

14、以及大分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化都有助于提高蛋白的消化率。2 4 淀粉含量與組成的變化玉米中碳水化合物含量在 70% 以上，因此玉米具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種重要的能量飼料。但是玉米淀粉中含有非淀粉多糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子，動(dòng)物食用后需在體內(nèi)多種淀粉酶作用下水解為可利用的糖類，才能被吸收利用，因此淀粉在動(dòng)物消化道內(nèi)可能會(huì)因?yàn)榈貌坏胶芎玫卣{(diào)控而限制了其營(yíng)養(yǎng)作用的充分發(fā)揮，甚至?xí)斐蓜?dòng)物吸收利用慢、利用率低等問題1。發(fā)酵前后飼料中淀粉和直鏈淀粉的含量如表 2 所示。表 2 發(fā)酵前后淀粉含量的變化 %項(xiàng) 目 發(fā)酵前 發(fā)酵后淀粉含量 57 9 54 4直鏈淀粉含量 8 39 12 52從表2 可以看出，發(fā)酵后淀粉含

15、量降低了35 個(gè)百分點(diǎn)，而直鏈淀粉含量提高了 4 13 個(gè)百分點(diǎn)。在微生物作用下玉米淀粉部分水解為糖類，并被微生物所利用，產(chǎn)生乳酸等小分子含碳物質(zhì)，這類物質(zhì)更容易被動(dòng)物消化、吸收利用，有助于改善能量飼料的品質(zhì)，提高飼料適口性，動(dòng)物采食后可為其持續(xù)供應(yīng)能量。同時(shí)，微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的異淀粉酶等淀粉水解酶將支鏈淀粉切割成不同的直鏈淀粉片斷，改變了淀粉的分子結(jié)構(gòu)，使直鏈淀粉含量增加，改善了飼料的營(yíng)養(yǎng)成分，相應(yīng)提高了飼料的單位能量值。2 5 棉子糖家族寡糖的變化微生物發(fā)酵可以有效地降解引起動(dòng)物脹氣的棉子糖家族寡糖，發(fā)酵前后棉子糖和水蘇糖的 TLC分析結(jié)果如圖 3 所示。從圖 3 可以看出，發(fā)酵后棉子

16、糖和水蘇糖被完全降解。另外，棉子糖和水蘇糖的降解對(duì)提高飼料的代謝能和蛋白質(zhì)消化率都有好處，Irish等17研究發(fā)現(xiàn)，消除棉子糖家族寡糖后，飼料的代謝能可以提高 7% ，氮存留可以提高 4 4% 。2012 年 第 37 卷 第 3 期 中 國(guó) 油 脂292 6 總酸含量的變化發(fā)酵飼料中乳酸菌的大量增殖提高了乳酸含量，會(huì)對(duì)飼料有酸化作用，可降低動(dòng)物胃腸道 pH，抑制病原菌繁殖，調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)動(dòng)物健康等18。通過(guò)測(cè)定發(fā)酵前后飼料的 pH 和總酸含量后發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵飼料的 pH 從原料的 6 24 下降到4 43，乳酸含量達(dá)到了 2 78% 。3 結(jié) 論采用微生物發(fā)酵玉米 豆粕型日糧不但成

17、本低，對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)成分破壞小，還可以同時(shí)去除多種抗?fàn)I養(yǎng)因子。研究表明，發(fā)酵玉米 豆粕型日糧，淀粉含量降低了 3 5 個(gè)百分點(diǎn)，直鏈淀粉含量提高了4 13個(gè)百分點(diǎn)。抗原蛋白和棉子糖家族寡糖發(fā)生了大幅的降解，發(fā)酵后蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在 18 kDa 以下，小于 5 kDa 的小分子肽含量從發(fā)酵前的 1 35%提高到了 3 60%，蛋白質(zhì)的體外消化率提高了 4 0 個(gè)百分點(diǎn)。氨基酸的組成和含量也有一定的變化和提高。有益的代謝產(chǎn)物乳酸的含量達(dá)到2 78% ，pH 下降至 4 43，創(chuàng)造的酸性環(huán)境可以有效抑制飼料中病原菌的生長(zhǎng)。發(fā)酵后的玉米 豆粕型日糧的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到明顯改善，其動(dòng)物飼養(yǎng)方面有待進(jìn)一

18、步深入研究。參考文獻(xiàn):1趙敏，李長(zhǎng)忠 非淀粉多糖酶在家禽玉米 豆粕型日糧中的應(yīng)用J 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35( 11) : 3269 3270，32732何學(xué)軍，齊德生 大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子及豆粕的質(zhì)量評(píng)價(jià)J 飼料研究，2006( 5) : 32 343周風(fēng)珍，張玲華，鄺哲師，等 不同處理方法對(duì)豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子的消除效果研究J 廣東飼料，2005 ( 5) :35 364ZEECE M G，BEARDSLEE T A，MARKWELL J P，et alIdentification of an IgE binding region in soybean acidicglycinin G1J Foo

19、d Agr Immunol，1999，11( 1) : 83 905陳斌 微生物發(fā)酵對(duì)豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響D 杭州: 浙江大學(xué)，20056GB/T 5009 92008，食品中淀粉的測(cè)定方法S7 GB/T 156832008，大米直鏈淀粉含量的測(cè)定方法S8蔡國(guó)林，楊旭，曹鈺，等 微生物發(fā)酵對(duì)豆粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的影響J 中國(guó)油脂，2008，33( 10) : 21 249陸健 蛋白質(zhì)純化技術(shù)及應(yīng)用M 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社，200510GB/T 224922008，大豆肽粉S11王濰波，趙國(guó)琦，韓慶廣，等 胃蛋白酶 胰蛋白酶體外消化豆粕適宜條件的研究J 中國(guó)飼料，2009( 2) :41 4312蔡國(guó)林，鄭兵兵，王剛，等 微生物發(fā)酵提高花生粕營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的初步研究J 中國(guó)油脂，2010，35( 5) :31 3413SONG Y S，PREZB V G，PETTIQREW J E，et al Fer-mentation of soybean meal and its inclusion in diets fornewly weaned pigs reduced diarrhea and measures of im-munoreactivity in the plasma J Anim Feed Sci Techn-ol，2010，15: