實(shí)驗(yàn)六氨基移換反應(yīng)及其產(chǎn)物的鑒定20081215

1、實(shí)驗(yàn)十四實(shí)驗(yàn)十四氨基移換反應(yīng)及其產(chǎn)物的鑒定氨基移換反應(yīng)及其產(chǎn)物的鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笠弧?shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)鑒定氨基移換反應(yīng)的簡便方法及其原理；2、學(xué)習(xí)紙層析的原理和操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)基本原理二、實(shí)驗(yàn)基本原理1.1.氨基移換反應(yīng)：氨基移換反應(yīng)： 在氨基移換酶（轉(zhuǎn)氨酶)的催化下，氨基酸的-氨基和-酮酸的-酮基之間發(fā)生的互換反應(yīng)。 轉(zhuǎn)氨酶的種類很多，任何一種氨基酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨作用時(shí)都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化。轉(zhuǎn)氨酶的最適pH接近7.4，在各種轉(zhuǎn)氨酶中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活性最強(qiáng)。 轉(zhuǎn)氨酶廣泛存在于機(jī)體的各種組織中。在肝、心、腎等組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic pyruvi

2、c transaminase, GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,GOT）活性較高。 GPT催化下的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)為：催化下的轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)為： L谷氨酸脫氫酶在體內(nèi)特別是在肝細(xì)胞內(nèi)含量豐富，活性高，催化L谷氨酸氧化脫NH2，加碘乙酸能抑制其活性，從而可以保護(hù)氨基移換反應(yīng)的產(chǎn)物L(fēng)谷氨酸。 本實(shí)驗(yàn)用紙層析法紙層析法，檢查由丙氨酸丙氨酸和酮戊二酸酮戊二酸在肝細(xì)胞谷丙轉(zhuǎn)氨酶（谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT) 的作用下所生成的谷氨酸谷氨酸，證明組織內(nèi)的氨基移換作用。2. 2. 紙層析原理：紙層析原理： 濾紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析。利用不同物質(zhì)在兩個(gè)互不相

3、溶的溶劑中分配情況（溶解度）的不同來分離混合物的一種技術(shù)。 層析溶劑是由有機(jī)溶劑和水組成。濾紙纖維上羥基具有親水性，因此吸附一層水作為固定相，而通常把有機(jī)溶劑作為流動相。進(jìn)行分離時(shí)，由于被分離物質(zhì)的組分在兩相中的分布不同，隨著流動相的移動，物質(zhì)將在兩相間進(jìn)行連續(xù)的、動態(tài)的不斷分配，從而造成不同組分移動的速度也不相同。易溶于流動相中的組分移動快，在固定相中溶解度大的組分移動慢，于是得到分離。 溶質(zhì)在濾紙上的移動速率用Rf值表示：原點(diǎn)到溶劑前緣的距離距離原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的值 fR原點(diǎn)溶劑前沿 樣品層析斑點(diǎn)XYYXRfX原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心距離Y原點(diǎn)到溶劑前沿的距離 在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf 值

4、是常數(shù)。Rf值的大小與樣品樣品的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、溶劑系統(tǒng)溶劑系統(tǒng)（溶劑的性質(zhì)、溶劑的pH）、層析層析的溫度和層析濾紙有關(guān)。此外，樣品中的鹽分，其他雜質(zhì)以及點(diǎn)樣過多皆會影響樣品的有效分離。 用濾紙層析法分離氨基酸，是根據(jù)氨基酸樣品的R基團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)或極性大小的不同，將樣品氨基酸溶解在適當(dāng)?shù)娜軇?0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液）中，點(diǎn)樣在濾紙的一端，再選用適當(dāng)?shù)娜軇┫到y(tǒng)（酚溶液），通過毛細(xì)現(xiàn)象向另一端展層，展層完畢后，用茚三酮作為顯色劑，即可得到氨基酸樣品的分離圖譜。3. 3. 茚三酮的顯色原理：茚三酮的顯色原理： 氨基酸+茚三酮類 紫紅色復(fù)合物三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1 1、

5、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)材料 動物肝臟(牛蛙肝牛蛙肝或豬肝豬肝）2 2、實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)試劑 0.01mol/L 磷酸緩沖液（pH7.4）（轉(zhuǎn)氨反應(yīng)所需緩沖溶液） 0.1mol/L 丙氨酸 （pH7.4）（轉(zhuǎn)氨反應(yīng)底物，同時(shí)作為紙層析點(diǎn)樣時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)樣品） 0.1mol/L 酮戊二酸 （pH7.4） （轉(zhuǎn)氨反應(yīng)底物） 0.1mol/L 谷氨酸（pH7.4）（紙層析點(diǎn)樣時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)樣品） 展層溶劑酚溶液（紙層析用） 10三氯乙酸（終止酶促反應(yīng)，同時(shí)使轉(zhuǎn)氨酶及其它蛋白質(zhì)變性、沉淀下來） 0.25%碘乙酸（抑制L谷氨酸脫氫酶活性） 顯色劑（0.1%茚三酮-乙醇溶液） 四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器 勻漿器或研缽

6、試管及試管架 恒溫水浴箱（37、100） 鉛筆、尺和圓規(guī) 毛細(xì)管（直徑0.5mm) 新華定性濾紙（直徑11cm） 剪刀和鑷子 電吹風(fēng) 滴管 康氏皿 噴霧器 烘箱（80 ）五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟1、酶液的制備 取新鮮牛蛙肝或豬肝約3g，剪碎放入勻漿器中加12ml磷酸緩沖液，將肝臟勻漿液或或用研缽將肝臟碾碎，加3ml磷酸緩沖液迅速碾磨，加9ml磷酸緩沖液，用兩層紗布過濾，收集漿液或?yàn)V液即得轉(zhuǎn)氨酶提取液備用。2、氨基移換反應(yīng)取4支潔凈、干燥的試管，按表表1 1操作 管號 試劑、操作1234轉(zhuǎn)氨酶提取液 （ml）11110.25%碘乙酸 （ml）0.50.50.50.5預(yù)溫滴加1

7、0三氯乙酸溶液2滴， 1005min置37恒溫水浴保溫5min0. 1mol/L 丙氨酸 pH7.4 （ml）1110. 1mol/L 酮戊二酸 pH7.4（ml）1110.01mol/L 磷酸緩沖液 pH7.4 （ml）1221酶促反應(yīng)混勻，置37恒溫水浴保溫40min（經(jīng)常搖動）終止酶反應(yīng)滴加10三氯乙酸溶液2滴，置100恒溫水浴保溫5min表表1 13 3、層析、層析 準(zhǔn)備：取新華定性濾紙（直徑直徑11cm11cm）一張，找出圓心，用圓規(guī)畫一直徑2 cm的細(xì)圓圈（保持干凈），并按圖圖1 1作出點(diǎn)樣位置。找出圓心，用鉛筆尖用鉛筆尖在圓心處截一小孔（孔徑約0.2cm)。另取2cm2cm濾紙，

8、先將下端剪成須狀，卷成“燈芯”，備用。 點(diǎn)樣：用毛細(xì)管依次點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)丙氨酸(Ala)、 谷氨酸(Glu)各點(diǎn)2次，其余14號管樣液各點(diǎn)23次。點(diǎn)樣時(shí)，要待前次點(diǎn)樣干燥（可用電吹風(fēng)吹干）后方可再次點(diǎn)樣，點(diǎn)樣直徑不超過0.3cm。1234561 11號管反應(yīng)樣液（ 丙氨酸 ）2 22號管反應(yīng)樣液（ 丙氨酸 ）3 33號管反應(yīng)樣液4 44號管反應(yīng)樣液（ 丙氨酸 、谷氨酸）5 5標(biāo)準(zhǔn)樣液：丙氨酸 6 6標(biāo)準(zhǔn)樣液：谷氨酸圖圖11層析濾紙示意圖層析濾紙示意圖5.5cm1cm 展層、顯色 將下端剪成須狀,卷成的“燈芯”，然后將上端插入層析濾紙圓心處的小孔中, 平放在盛有展層溶劑的康氏皿中,使“燈芯”下端須狀浸入展層溶劑中,再在濾紙上蓋上另一康氏皿（圖圖2 2）。展層劑沿?zé)粜纳仙綖V紙,再向四周擴(kuò)散,待溶劑前沿距康氏皿外槽內(nèi)緣0.5cm(約需半小時(shí))，取出濾紙，用鑷子拔出燈心，濾紙用電吹風(fēng)吹干，再用噴霧器向?yàn)V紙均勻噴灑0.1%茚三酮乙醇溶液，用電吹風(fēng)熱風(fēng)吹干或放入烘箱（80 ）中顯色3min。432圖圖2層析裝置示意圖層析裝置示意圖1. 康氏皿 2. 展層溶劑 3. “燈芯” 4. 層析濾紙1谷氨酸谷氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸氨基酸樣品的分離圖譜氨基酸樣品的分離圖譜溶劑前沿溶劑前沿原點(diǎn)651234氨基酸樣品的分離圖譜氨基酸樣品的分離圖譜六、結(jié)果分析