微生物工程(發(fā)酵)第三章培養(yǎng)基制備與滅菌

1、第三章第三章 培養(yǎng)基的制備與滅菌培養(yǎng)基的制備與滅菌3學時思考題： 培養(yǎng)基有哪些化學成分組成？這些成分的來源有哪培養(yǎng)基有哪些化學成分組成？這些成分的來源有哪些（尤其是些（尤其是C、N源）？各成分的作用是什么？源）？各成分的作用是什么？ 前體物質(zhì)、抑制劑、促進劑的概念前體物質(zhì)、抑制劑、促進劑的概念 發(fā)酵工業(yè)原料的選擇原則有哪些發(fā)酵工業(yè)原料的選擇原則有哪些 發(fā)酵培養(yǎng)基設計的基本原則有哪些發(fā)酵培養(yǎng)基設計的基本原則有哪些 發(fā)酵培養(yǎng)基設計和優(yōu)化步驟發(fā)酵培養(yǎng)基設計和優(yōu)化步驟 常用的滅菌方法有哪些？常用的滅菌方法有哪些？ 發(fā)酵工程培養(yǎng)基滅菌的主要滅菌方法及其各自的優(yōu)發(fā)酵工程培養(yǎng)基滅菌的主要滅菌方法及其各自的優(yōu)

2、缺點；缺點；按純度按純度 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 : 原料其化學成分明確、穩(wěn)定原料其化學成分明確、穩(wěn)定 q 適合于研究菌種基本代謝和過程的物質(zhì)變化規(guī)律適合于研究菌種基本代謝和過程的物質(zhì)變化規(guī)律 q 培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè)培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè) 生產(chǎn)生產(chǎn) 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基: 采用天然原料采用天然原料 q 原料來源豐富原料來源豐富(大多為農(nóng)副產(chǎn)品大多為農(nóng)副產(chǎn)品)、價格低廉、適于工業(yè)、價格低廉、適于工業(yè) 化生產(chǎn)化生產(chǎn) q 原料質(zhì)量等方面不加控制會影響生產(chǎn)穩(wěn)定性原料質(zhì)量等方面不加控制會影響生產(chǎn)穩(wěn)定性 培養(yǎng)基概述培養(yǎng)基概述固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基 :適合于菌

3、種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn)用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn) 半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基: :即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為一般用量為0.5%0.8% ,主要用于微生物的鑒定。主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基:80%90%是水，其中配有可溶性的或不溶性是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。 根據(jù)生產(chǎn)流程和作用來區(qū)分根據(jù)生產(chǎn)流程和作用來區(qū)分 斜面培養(yǎng)基或孢子培養(yǎng)基

4、 種子培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組成及來源 五大元素： 水、碳源、氮源、無機鹽、生長因子3.1.1 五大營養(yǎng)要素及其主要來源 3.1.1.1 水分： 占細胞重量的80-90%； 對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關重要的，因為在對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大 水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。 3.1.1.2 碳源 可以作為微生物細胞和代謝產(chǎn)物中

5、碳素來源的營養(yǎng)物質(zhì)； a. 純糖原料 葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等 b. 淀粉質(zhì)原料 直鏈淀粉（聚合度 100-6000） 支鏈淀粉 （1000-3000000） 薯類原料：紅薯、木薯； 谷物原料：玉米 野生植物原料：橡果、葛根、蕨根 輔助原料：麩皮、米糠 淀粉、糊精淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、缺點：難利用、 發(fā)酵液比較稠、一般發(fā)酵液比較稠、一般2.0%時加入一定的時加入一定的-淀粉酶，淀粉酶， 成分比較復雜等等。成分比較復雜等等。優(yōu)點：來源廣泛、價格底優(yōu)點：來源廣泛、價格底 可以解除葡萄糖效應可以解除葡萄

6、糖效應 c. 糖蜜原料： 制糖工業(yè)中的副產(chǎn)物； 甘蔗、甜菜糖蜜使用的注意點：糖蜜使用的注意點：除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，許多都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利的除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，許多都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進行預處理。影響，需要進行預處理。例：谷氨酸發(fā)酵例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結晶）、鈣鹽（結晶）有害物資：膠體成分（起泡、結晶）、鈣鹽（結晶） 生物素（發(fā)酵控制）生物素（發(fā)酵控制）例：檸檬酸發(fā)酵例：檸檬酸發(fā)酵有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導致異檸檬酸的生成）有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導致異檸檬酸的生成）d. 纖維質(zhì)原料：農(nóng)作物秸稈；纖維素、半纖維素、木質(zhì)素3.1.1.3 氮源 被微生物利用

7、以構成細胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中的氮素的營養(yǎng)物質(zhì)； a. 無機氮源 氨水、硝酸鹽、銨鹽 特點：吸收快，速效氮源。但無機氮源的迅速特點：吸收快，速效氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起利用常會引起pH的變化如：的變化如： (NH4)2SO4 2NH3 + 2H2SO4 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH q滿足菌體生長滿足菌體生長q 穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH b. 有機氮源 玉米漿、豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、魚粉、酵母浸出液成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機 鹽及生長因子。鹽及生長因子

8、。例例 玉米漿：玉米漿： 可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸 較多的乳酸較多的乳酸 硫、磷、微量元素等硫、磷、微量元素等 有機氮源成分復雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響 3.1.1.4 無機鹽 酶活中心的組成部分酶活中心的組成部分 維持生物大分子和細胞結構的穩(wěn)定性維持生物大分子和細胞結構的穩(wěn)定性 調(diào)節(jié)并維持細胞的滲透壓平衡調(diào)節(jié)并維持細胞的滲透壓平衡 控制細胞的氧化還原電位控制細胞的氧化還原電位 作為某些微生物生長的能源物質(zhì)作為某些微生物生長的能源物

9、質(zhì)3.1.1.5 生長因子 凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。稱生長因子。 有機氮源是生長因子的重要來源；有機氮源是生長因子的重要來源；3.1.1.6 前體物質(zhì)、抑制劑和促進劑 前體物質(zhì)指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼前體物質(zhì)指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼微生物在生物合成過程中合成到微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物產(chǎn)物物分子中去，而其自身物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有的結構并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體

10、而有較大的提高。較大的提高。青霉素：分子量青霉素：分子量356苯乙酸苯乙酸:分子量分子量136 前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利長不利 苯乙酸，一般基礎料中僅僅添加苯乙酸，一般基礎料中僅僅添加0.07% 前體相對價格較高，添加過多，容易引前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化起揮發(fā)和氧化3、產(chǎn)物促進劑、產(chǎn)物促進劑 產(chǎn)物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前產(chǎn)物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑 促進劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方促進劑提高產(chǎn)量的機

11、制還不完全清楚，其原因是多方面的。面的。 有些促進劑本身是酶的誘導物；有些促進劑本身是酶的誘導物； 有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善 細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產(chǎn)，細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產(chǎn)， 也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用；也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用； 有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。抑制劑：能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白質(zhì)抑制劑：能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白質(zhì)變性的物質(zhì)；變性的物質(zhì)；可用透析或超濾的方式去除；可用

12、透析或超濾的方式去除； 在培養(yǎng)基中添加抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，在培養(yǎng)基中添加抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時會使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需要同時會使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需要的某一終產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間產(chǎn)物積的某一終產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間產(chǎn)物積累起來累起來;3.1.2 發(fā)酵工業(yè)原料的選擇原則 因地制宜，就地取材；因地制宜，就地取材； 營養(yǎng)豐富，濃度恰當；營養(yǎng)豐富，濃度恰當； 資源豐富，容易收集；資源豐富，容易收集； 易于儲藏；易于儲藏； 理化性質(zhì)穩(wěn)定，成分間無反應；理化性質(zhì)穩(wěn)定，成分間無反應； 不影響通氣、攪拌、產(chǎn)物分離，廢物處理方便不影響通氣、

13、攪拌、產(chǎn)物分離，廢物處理方便 不含毒副作用的物質(zhì)不含毒副作用的物質(zhì) 價格低廉價格低廉3.1.4 原料的預處理和加工淀粉質(zhì)原料的預處理和加工預處理：原料除雜、粉碎；加工：液化 淀粉糊精、低聚糖 糖化 產(chǎn)生葡萄糖加工：糊化、液化 淀粉糊精、低聚糖 糖化 產(chǎn)生葡萄糖淀粉顆粒受熱并吸水膨脹，體積迅速增大，固態(tài)結構被破壞，形成粘稠的液體，稱為糊化；糊化的淀粉在酶的作用下，分子鏈被切斷，相對分子量變小，粘度迅速降低的過程稱為液化；經(jīng)液化后的料液中加入一定量的糖化酶（葡萄糖淀粉酶），使糊精或低聚糖水解為葡萄糖，稱之為糖化。 糖蜜原料的預處理 去除雜質(zhì)、膠體、灰分（鈣質(zhì)）及產(chǎn)酸細菌； 方法：加酸酸化； 加熱滅

14、菌； 靜止沉淀； 脫鈣； 纖維素原料的預處理及加工： 預處理： 用化學、物理、生物學的方法，去除半纖維素和木質(zhì)素，破壞纖維素的結構； 加工： 酸水解 酶水解3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的設計和優(yōu)化 目前還不能完全從生化反應的基本原理來目前還不能完全從生化反應的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學、細胞生物學、微生物學只能用生物化學、細胞生物學、微生物學等的基本理論，參照前人所使用的較適合等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗配方，再結合所用菌種某一類菌種的經(jīng)驗配方，再結合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型和產(chǎn)品的特性

15、，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設備，按照一定的實驗設計和實驗方發(fā)酵設備，按照一定的實驗設計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基法選擇出較為適合的培養(yǎng)基3.2.1發(fā)酵培養(yǎng)基設計的基本原則發(fā)酵培養(yǎng)基設計的基本原則 根據(jù)生產(chǎn)菌株的營養(yǎng)特征配置培養(yǎng)基；根據(jù)生產(chǎn)菌株的營養(yǎng)特征配置培養(yǎng)基； 營養(yǎng)成分的配比適當；營養(yǎng)成分的配比適當； 滲透壓適宜滲透壓適宜 pH值適當值適當 各成分的加入次序及步驟適當；各成分的加入次序及步驟適當；3.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基設計和優(yōu)化步驟發(fā)酵培養(yǎng)基設計和優(yōu)化步驟 各成分最適的濃度（正交實驗設計）各成分最適的濃度（正交實驗設計） 根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分初步確定可能的培養(yǎng)根據(jù)前人的經(jīng)驗和

16、培養(yǎng)基成分初步確定可能的培養(yǎng)基成分；基成分； 通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健原培養(yǎng)基: 初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例) 通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進一步：乙酸鈉的濃度2%比較好結果：碳源：乙酸鈉 0. 2%氮源：氯化銨 0.2% 酵母膏0.03%無機鹽: 復合無機鹽0.05% 正交設計確定優(yōu)化的配方改進后培養(yǎng)基的發(fā)酵結果例： 青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(N

17、H4)SO4 0.8% 輕質(zhì)碳酸鈣1%發(fā)酵罐:葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量4-8% 補加硫酸、前體等搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和罐的基礎培養(yǎng)差別很大搖瓶優(yōu)化配方：菌種篩選，反應器研究的基礎3.3 培養(yǎng)基及設備的滅菌3.3.1常見滅菌方法： 加熱滅菌 過濾滅菌 輻射滅菌 化學滅菌 熏蒸滅菌 1）干熱滅菌）干熱滅菌烘箱內(nèi)熱空氣滅菌烘箱內(nèi)熱空氣滅菌火焰灼燒火焰灼燒干熱滅菌干熱滅菌160，2小時小時1、高溫滅菌、高溫滅菌2）濕熱滅菌）濕熱滅菌1）巴斯德消毒）巴斯德消毒2）煮沸消毒）煮沸消毒3）丁達爾滅菌）丁達爾滅菌4）常規(guī)高壓滅菌）常規(guī)高壓滅菌121，15分鐘；分鐘；115，30分鐘；分鐘；135-

18、150135-150，5-155-15秒，工業(yè)上發(fā)酵培養(yǎng)基秒，工業(yè)上發(fā)酵培養(yǎng)基135-150135-150，2-62-6秒，牛奶或其它液態(tài)食品秒，牛奶或其它液態(tài)食品過濾除菌過濾除菌 對不耐熱液體培養(yǎng)基和空氣滅菌進行過濾除對不耐熱液體培養(yǎng)基和空氣滅菌進行過濾除菌；菌； 硝酸纖維素膜和醋酸纖維素膜硝酸纖維素膜和醋酸纖維素膜 （0.22 0.45m） 核孔濾器（聚碳酸膠片）核孔濾器（聚碳酸膠片）紫外滅菌紫外滅菌 紫外線：誘導核酸形成胸腺嘧啶二聚體，紫外線：誘導核酸形成胸腺嘧啶二聚體，從而干擾了核酸的復制；從而干擾了核酸的復制； X射線和射線和射線能使其它物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自射線能使其它物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基破壞和改變生物大分子的結構，以抑由基破壞和改變生物大分子的結構，以抑制或殺死微生物。制