小鼠Mcm6基因電子克隆的驗(yàn)證

1、小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-1-小鼠Mcm6基因電子克隆的驗(yàn)證摘 要 小鼠Mcm6（Mus musculus minichromosome maintenance deficient 6）基因是通過電子克隆獲得的基因。以liver,Mus.musculus為關(guān)鍵詞檢索得到UniGene 數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇其中一個(gè)EST序列D86726.1（種子序列）作為電子探針，獲得該序列的電子延伸產(chǎn)物EST重疊群。再與基因組草圖進(jìn)行序列校正，獲得了全長(zhǎng)為3191bp的cDNA序列。該基因定位于小鼠1號(hào)染色體和8號(hào)染色體上，將該基因命名為Mcm6。但這種根據(jù)“基因組草圖搜索法”獲得的全長(zhǎng)cDNA序列，最后尚

2、需要通過實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。本研究的目的就是通過實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證電子克隆基因Mcm6是否為真正具有生物學(xué)功能的基因。本實(shí)驗(yàn)從新鮮的小鼠肝臟組織中提取總 RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。根據(jù)Mcm6 的電子克隆全長(zhǎng) cDNA 序列，在同一閱讀框架終止密碼子附近及其上游設(shè)計(jì) 1 條引物,在閱讀框架起始密碼子附近及其下游設(shè)計(jì) 1 條引物。再以 cDNA 為模板，利用上述引物擴(kuò)增目的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 379bp。通過比較根據(jù)基因組草圖搜索法預(yù)測(cè)的和實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的目的片段大小，即可判斷我們是否獲得該基因的全長(zhǎng) cDNA 序列。結(jié)果證實(shí)成功克隆該基因，因而驗(yàn)證了 Mcm6 基因電子

3、克隆的正確性。本實(shí)驗(yàn)為該基因功能的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：小鼠，Mcm6，電子克隆,逆轉(zhuǎn)錄，PCR 擴(kuò)增。小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-2-Identification of sillcon cloning gene Mcm6Abstract Mcm6（Mus musculus minichromosome maintenance deficient 6）gene is obtained by sillcon cloning. First of all, they obtain a UniGene cluster which roots in Mouses brain by

4、use the key word Mus musculus ,brain to searches UniGene database,then with one EST sequence D86726.1(Seed sequence) as an electronic probe, access to the electronic extension of the EST product sequence contig. With the draft genome sequence correction, access to the full-length cDNA sequences of 3

5、191bp. The gene located in mouse chromosome 1 and chromosome 8. They named it Mcm6 gene. However, this full-length cDNA sequences under the draft genome search also needs to verify through experiments. The purpose of this study is to verify whether Mcm6 is a Biological function of genes through expe

6、riments.In this experiment we extract total RNA from fresh Mus musculus liver tissue,and synthesis cDNA by Reverse Transcription. According to the sillcon cloning sequence of full-length cDNA of Mcm6, design a primer near the stop codon and its upstream in the same reading frame, design another prim

7、er in the reading frame near the initiation codon and its downstream. We made the cDNA of mouse liver tissue of the Mus musculus as the template to amplify the aim fragment,and detect it by agarose gel electrophoresis. The length of the product is 379bp. By comparing the size according to the draft

8、genome and the aim fragment by experiments, we can identify whether we obtain the gene sequence of the full-length cDNA.The results confirmed the successful cloning of Mcm6 gene. Thus to verify the correctness of Mcm6 obtained by the sillcon cloning. This experiment laid the foundation for the futhe

9、r study of Mcm6.Keywords: Mus musculus,Mcm6, sillcon cloning,RT,PCR.小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-3-符 號(hào) 說(shuō) 明縮寫全稱中文名稱ESTExpressed Sequence Tag表達(dá)序列標(biāo)簽GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)NCBINational Center Biotechnology Information美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心BLASTBasical Local Alignment Search Tools基本局域聯(lián)配搜尋工具，一種常用的序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索工具Contig片段重疊群CDSCoding Sequence

10、編碼區(qū)序列KozakKozak （A/GNNATGG）Kozak 提出的起始密碼子前后的固定的堿基序列Mus musculus小鼠RNADeoxyribonucleic acid核糖核酸dNTPDeoxynudeaside triphosphate脫氧核糖三磷酸ORFOpen Reading Frame開放性閱讀框架PCRPolymerase chain reaction多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCRReverse Transcription-PCR逆轉(zhuǎn)錄 PCRUniGeneUniGene專門收集非冗余性的基因來(lái)源的 clusters 數(shù)據(jù)Nr databasenon-redundant dat

11、abase非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)Mcm6Minichromosome maintenance deficient 6DEPCDiethyl pyrocarbonate焦碳酸二乙酯DnaseDeoxyribonuclease DNA 酶EDTAEthylene diamine tetra-acetic acid乙二胺四乙酸bpBase pair 堿基對(duì)RnasinRNase inhibitor十二烷基磺酸鈉小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-4-引 言1生物信息學(xué)簡(jiǎn)介生物信息學(xué)以計(jì)算機(jī)、網(wǎng)絡(luò)為工具，采用數(shù)學(xué)和信息科學(xué)的理論、方法和技術(shù)重點(diǎn)研究落核酸和蛋白質(zhì)的序列、結(jié)構(gòu)和功能。以基因組 DNA 序列信息分析

12、作為出發(fā)點(diǎn)，找到基因組序列中代表蛋白質(zhì)和 RNA 基因的編碼區(qū)。同時(shí)，闡明基因組中大量存在的非編碼區(qū)的信息實(shí)質(zhì)，破譯隱藏在 DNA 序列中的遺傳語(yǔ)言規(guī)律。利用計(jì)算機(jī)來(lái)協(xié)助克隆基因，稱為“電子”基因克?。╯illcon cloning） ，即采用生物信息學(xué)的方法延伸 EST 序列，以獲得基因部分乃至全長(zhǎng)的 cDNA 序列。EST（Expressed Sequence Tag） 即表達(dá)序列標(biāo)簽，是從 cDNA 的 5 或 3 端獲取的短的 DNA 片段。表達(dá)序列標(biāo)簽(EST) 已成為人類尋找未知功能的新基因, 以及克隆不同時(shí)空差異表達(dá)基因和疾病相關(guān)基因的重要標(biāo)志物 。獲得感興趣的 EST 最有途徑

13、是使用 BLAST 檢索程序?qū)ふ彝葱蛄校缓髮z出序列組裝為重疊群（contig） ，以此重疊群為被檢序列，重復(fù)進(jìn)行 BLAST 檢索與序列組裝，延伸重疊樣系列，重復(fù)以上過程，直到?jīng)]有更多的重疊 EST 檢出或者說(shuō)重疊群序列不能繼續(xù)延伸，有時(shí)可獲得全長(zhǎng)的基因編碼序列。獲得這些 EST 序列數(shù)據(jù)后，再與 GeneBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性檢測(cè)， ，假如具有精確匹配基因，將 EST 序列數(shù)據(jù)據(jù) EST 六種閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)，接著與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析?；蚍治龅慕Y(jié)果大致有三種：第一是已知基因，是研究對(duì)象為人類已鑒定和了解的基因；第二是以前未經(jīng)鑒定的新基因；第三是未知基因，這部分基因

14、之間無(wú)同種或異種基因的匹配。2.RT-PCR 簡(jiǎn)介RT-PCR 是將 RNA 的反轉(zhuǎn)錄（RT）和 cDNA 的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用從 RNA 合成 cDNA，再以 cDNA 為模板，擴(kuò)增目的片段。RT-PCR 技術(shù)靈敏用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列。RT-PCR 把低豐度的 mRNA 擴(kuò)增放大，易于檢測(cè)。運(yùn)用此方法可檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中少于 10 個(gè)拷貝的特異 RNA。小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-5-應(yīng)用：（1）分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；（2）克隆 cDNA 及合成 cDNA 探針、改造cD

15、NA 序列等。3PCR 簡(jiǎn)介中文譯為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或 DNA 序列的方法，其擴(kuò)增效率之高就像核裂變的“鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”那樣。經(jīng)過數(shù)小時(shí)后，就能將極微量的目的基因或某一特定的 DNA 片段擴(kuò)增數(shù)十萬(wàn)倍，乃至千萬(wàn)倍，而無(wú)需通過煩瑣費(fèi)時(shí)的基因克隆程序便可獲得足夠數(shù)量的精確的 DNA 拷貝，又稱為無(wú)細(xì)胞分子克隆法。這種技術(shù)操作簡(jiǎn)單，容易掌握，結(jié)果也較為可靠。為基因的分析與研究提供了一種強(qiáng)有力的手段，是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中的一項(xiàng)富有革命性的創(chuàng)舉，對(duì)整個(gè)生命科學(xué)的研究與發(fā)展，都有著深遠(yuǎn)的影響。在基因分析方面，PCR 技術(shù)能夠快速、靈敏地放大被測(cè)試的目的基因，可用于鑒定由基因缺失、突

16、變、轉(zhuǎn)位及致病基因所引起的各種疾病。PCR 技術(shù)已廣泛地用于遺傳病的基因分析和產(chǎn)前診斷、傳染病原體的檢測(cè)、癌基因的臨床分析等方面。PCR 結(jié)合的分子雜交技術(shù)等分析方法，可進(jìn)一步的提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。4.本實(shí)驗(yàn)的研究意義前研究以小鼠(mouse)的肝臟(liver )為檢索詞，通過電子克隆獲得了一個(gè)新基因 Mcm6。但該基因是否為真正的具有生物學(xué)功能的基因，最后尚需通過實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)證實(shí)。通過比較根據(jù)人類基因組草圖搜索法預(yù)測(cè)的和實(shí)際擴(kuò)增的目的片段大小，即可判斷我們是否獲得該基因的全長(zhǎng) cDNA 序列。本研究的任務(wù)就是通過實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證此電子克隆基因 Mcm6 是否為真正具有生物學(xué)功能的基因。本實(shí)驗(yàn)

17、運(yùn)用 RT-PCR 技術(shù)克隆該基因，分析了 PCR 條件對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。從新鮮的小鼠肝臟組織中提取總 RNA，然后用 Oligo(dT) 為引物，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用合成 cDNA。根據(jù)此新基因的電子克隆全長(zhǎng) cDNA 序列，在該終止密碼子附近及其上游設(shè)計(jì)了引物,在閱讀框架起始密碼子附近及其下游設(shè)計(jì)了引物，再以逆轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA 為模板，擴(kuò)增，得到大量目的基因片段，電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果證實(shí)該基因被成功克隆，驗(yàn)證了此電子克隆基因 Mcm6 的正確性。本研究為該基因功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-6-第一章 材料及儀器1.1 組織標(biāo)本新鮮小白鼠肝臟組織，取出后立即液氮

18、研磨或液氮灌中保存待用。1.2 所需試劑及配制(1)RNA 的提?。郝确?，異丙醇，70%的乙醇，無(wú) RNase 的水，0.1%二乙基焦碳酸脂（DEPC） ，Trizol 試劑，液氮。(2)RNA 的檢測(cè)：5TBE 緩沖溶液的配置：54gTris 堿，23.5g 的硼酸，0.5mol/L EDTA(pH=8.0)20mL，補(bǔ)足水至 1L。1.0%的瓊脂糖；10mg/M EB 溶液。(3)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：MgCl2 (25mmol/L)；Reverse Transcription 10Buffer；dNTPs(10mmol/L)；RNasin(40U/L)；AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(24U/L)；Oliga

19、(dT)；Nuclease-free-water；(4)cDNA 的 PCR 擴(kuò)增試劑盒： 10PCR Buffer；Taq DNA 聚合酶；d NTPs(10mmol/L)；dH2O；小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-7-(5)電泳：DNA marker （100bp） Loading Buffer 1.3 引物設(shè)計(jì)前研究以小鼠(mouse)的小腦(liver )為檢索詞，從 GenBank 中篩選出的EST 序列，通過電子延伸，對(duì) EST 序列進(jìn)行修正、聚類、拼接和組裝，獲得cDNA 序列。實(shí)驗(yàn)在終止密碼子附近及其上游設(shè)計(jì)了引物,在閱讀框架起始密碼子附近及其下游設(shè)計(jì)了引物。在計(jì)算機(jī)上利用

20、 PCRDESN 引物設(shè)計(jì)軟件，引物設(shè)計(jì)結(jié)果如下：GGGGGTAAAGGGAGAGAGGGAGGGGTTAGCTCCTCAAGCCAAAACAACCAGAGGGTGGG Primer-FTGCGACTACATTGCGCATGGGCAAAAGCTTCATGGCGTATGCTTTTGGCGCGAAAAGTGCGTGCGGTGGGCGGGGCTCTGTACGGAACCGCCATTGATTGGACGGGTTTGGCGCGAAGTAGCTCAGCTCCTACCCTGTTATTGGCTGAGGTGAGAGGGCGGGGCTAGCCGGAGGCGCGCGCTACGCGTGGAACCTGCGGCCGGGCTA

21、TCTGCAGCTGCGGACTCTCCTCCGCGGTGGTCTTCCCTCAGCAGCGCGTACTCTCGGCGCCGCCATGGACCTCGCAGCGGCCGCGGAGCCCGGCGCCGGAAGCCAGCACCCGGAGGTGCGCGACGAGGTGGCCGAGAAATGCCAGAA Primer-RGCTGTTCCTAGACTTCCTGGAAGAGTTCCAGGGTAGTGATGGAGAAATTAAATACTTGCAGTTTGCAPrimer Mcm6-F: 5-CAAAACAACCAGAGGGTGGG-3 Tm: 59.85Primer Mcm6-R:5-ACAGCTTCTGGC

22、ATTTCTCGG-3 Tm: 59.95擴(kuò)增片段大?。?79 bp引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-8-1.4 儀器與設(shè)備高速冷凍離心機(jī) 5417R； 紫外凝膠成像分析系統(tǒng)；低溫高速臺(tái)式離心機(jī)； PCR 儀 FTGENE2D（PCR 管） ；電泳儀（水平式電泳槽） ； 制冰機(jī) AF100A；電熱鼓風(fēng)干燥箱 101 型； 高壓滅菌鍋 YXQ-LS-30；電子天平 BS124S； 陶瓷研缽；試劑瓶； Eppendorf 微量離心管；移液槍（槍頭） ； 鋁合金盒；液氮罐； 超凈工作臺(tái)；電熱恒溫培養(yǎng)箱 303 型； 量筒；微波爐； 玻璃棒； 燒杯； 手套

23、口罩；鑷子； 剪刀；小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-9-第二章 方法與步驟2.1 RNA 的提取(1)勻漿：取 50100mg 凍存的組織放在研缽中液氮凍結(jié)，碾碎完全，加入適量的Trizol 試劑(100mg/1mL)裂解組織，冰上放置 5min。(2)RNA 的分離：將液體吸入 1.5mL 的離心管中，加入 0.2mL 氯仿/mLTrizol 試劑，蓋好離心管，搖動(dòng)混勻，放置冰上 5min，然后于 2-8于 10000g 離心 10min。離心后混合物分三相:最下層是紅色的酚-氯仿相，中間相以上層水相，RNA 絕大多數(shù)留于此水相。(3)RNA 的沉淀：取上清液移到一新的離心管（約 600

24、mm） ，在其中加入等體積的異丙醇，每 1mL Trizol 加入 0.5mL 的異丙淳；混合均勻，以沉淀 RNA，在冰上放置10min；然后在 2-8于 10000g 離心 15min。(4)RNA 的洗滌：去掉上清，加 70%的乙醇洗滌 RNA 沉淀，1ml Trizol 試劑加 1mL70%的乙醇，然后 2-87500g 離心 5min，棄上清，RNA 沉淀倒立在濾紙上空氣干燥5-10min。(5)RNA 的溶解：RNA 沉淀空氣干燥 5-10min，加入不含 RNase 的水溶解(約 16ul),-20保存。2.2 RNA 的檢測(cè)(1)配制 0.5TBE 電泳緩沖液：小鼠 Mcm6 基

25、因電子克隆的驗(yàn)證-10-5TBE 緩沖液的成分是：54gTris 堿、23.5g 硼酸、0.5mmolL EDTA（PH8.0）20ml，補(bǔ)足水 1 升。(2)制膠：膠的濃度為 1.0%，即稱取 1.0g 瓊脂糖加 100mL 0.5TBE，微波爐中微火溶解至透明。(3)冷卻至 60加入溴化乙錠(EB)(10mg/mL 的終濃度為 0.5mg/mL)。(4)洗凈有機(jī)玻璃制膠槽，放入梳子，倒膠厚度一般為 3-5mm，待凝固。(5)取出梳子，將膠槽放入電泳槽中加 0.5TBE，倒入同濃度的緩沖液,使液面高于膠面約 1mm。(6)點(diǎn)樣：5ul RNA+1ul Loading Buffer。(7)電泳

26、條件設(shè)定： 80V 電壓,2030min。(8)檢測(cè)：紫外燈下觀察結(jié)果，照相。2.3 逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng) （20L 體系）(1)打開制冰機(jī)備用；(2)取 9.8uL 先前用無(wú) RNase 的水溶解的 RNA 于 0.5mLPCR 管中，PCR 儀設(shè)定7010min，預(yù)變性。預(yù)變性之后，取出輕輕彈幾下,放置冰上(防止復(fù)性)；(3)補(bǔ)足 RT 反應(yīng)液 20L，反應(yīng)所需要的試劑如下：MgCl2 (25mmol/L) 4L；10Buffer 2L；dNTPs(10mmol/L) 2L；RNasin(40U/L) 0.5L；AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(24U/L) 0.6L；Oligo(dT) 1L;(4) 加完

27、以上試劑后,輕輕的彈幾下，混勻。在 PCR 儀中設(shè)定 42，1h；95, 5min；完成后-20冰箱保存。2.4 聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-11-(1)取 PCR 管，依次加入下列試劑(反應(yīng)體系共 20uL)：10PCR 緩沖液 2L；Taq DNA 聚合酶 0.4L；dNTPs(10mmol/L) 0.4L；20mol/L 上下游混合引物 0.5L組織 cDNA 1 L； 補(bǔ)足無(wú)菌雙蒸水 15.7L 至 20L。PCR 儀中設(shè)定，條件如下：95，預(yù)變性 3min；94，變性 40s ，58，退火 40s，72，延伸50s，28 個(gè)循環(huán)；72，10min 最后

28、延伸。4保存。（2）電泳鑒定：PCR 產(chǎn)物于 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB 染色，紫外燈下觀察結(jié)果，照相。小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-12-第三章 結(jié) 果 3.1 小鼠肝臟組織 RNA 提取檢測(cè)結(jié)果新鮮小鼠肝臟組織提取的總 RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測(cè)結(jié)果有三條清晰的 rRNA 帶：28S，18S 和 5S，表明 RNA 未降解（圖 1） 。 圖 1. 1.0% 總 RNA 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果3.2 目的片段 cDNA 擴(kuò)增結(jié)果以小鼠肝臟組織 cDNA 為模版，根據(jù)電子克隆的 cDNA 全長(zhǎng)設(shè)計(jì)的特異引物擴(kuò)增的目的基因片段，PCR 產(chǎn)物用 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

29、 ，檢測(cè)結(jié)果如下(圖 2)：小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-13- M：DNA maker 1：目的基因條帶 圖 2. PCR 產(chǎn)物的 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA marker、目的片段條帶清晰，無(wú)其他雜帶。擴(kuò)增片段大小約 400bp，與理論大小相符。第四章 討 論4.1 RNA 提取質(zhì)量討論4.1.1 RNA 提取準(zhǔn)備工作（1）實(shí)驗(yàn)用的試劑瓶、槍頭、離心管、鑷子、剪刀、電泳槽，燒杯等用必須洗凈后用 RNA 酶的抑制劑 0.1%的 DEPC(焦碳酸二乙酯)浸泡 12 以上，然后滅菌去除 DEPC，或?qū)⒉Ａ髅笥?200干烤 5 小時(shí)以上，以去除 RNAase 污染

30、。（2）實(shí)驗(yàn)用的試劑必須用 0.1%的 DEPC 處理過的水配制，然后滅菌去除DEPC。雙蒸水(ddH2O)應(yīng)該用 DEPC)進(jìn)行處理:每 100mL 溶液或水中加入 0.1mL DEPC 原液,放在搖床上充分混勻并在 37下作用數(shù)小時(shí).然后將溶液高壓滅菌15min 使 DEPC 失活.4.1.2 RNA 提取流程注意事項(xiàng)（1）最好是新鮮組織，這樣 RNA 提取的效果比較好，要放到液氮預(yù)冷過的陶瓷研缽中，再研磨。（2）一定要注意冰上操作，低溫離心，離心機(jī)要預(yù)冷。 小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-14-（3）RNA 提取過程中操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換手套，去任何

31、東西都要帶著手套去取，提取過程中要盡量少說(shuō)話，減少人員走動(dòng)。設(shè)置 RNA 操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。 （4）每次取器材的時(shí)候都要用鑷子去夾，鑷子要在酒精燈上燒一下。（5）異丙醇等都保證沒有被 RNA 酶污染，不能用沒有泡過 DEPC 的槍頭去提取液體，一定要用 DEPC 浸泡過的槍頭去吸。如果發(fā)現(xiàn)試劑有可能被污染了，要立即更換。 （6）最后用 75%的酒精洗一次就可以，盡量減少 RNA 提取時(shí)間。 （7）最后一步，用 DEPC 水溶解 RNA，不要用太多的體積，以保證 RNA 的濃度。RNA 沉淀在 70%乙醇中可在 4保存一周，-20保存一年。提取完后，電泳觀察結(jié)果，如果上面的兩條

32、帶都比較清楚的話，說(shuō)明 RNA 提取的不錯(cuò)，可以一次多逆轉(zhuǎn)錄幾管。不要把 RNA 凍存，以后在逆轉(zhuǎn)錄的效果不好，盡量盡快地逆轉(zhuǎn)錄。RNA 在低量存在時(shí)非常容易降解，任何保存方法都比不上不保存。對(duì) RNA 的電泳圖譜檢測(cè)，目的在于檢測(cè)其 28S 和 18S 條帶的完整性。一般如果 28s 和 18S 條帶明亮、清晰，條帶邊緣清晰，并且 28S 的亮度在 18S 條帶的兩倍以上，則認(rèn)為是好的（圖 3） 。RNA(18s 和 28s) 條帶模糊可能表明由RNA 酶引起的 RNA 的降解。圖 3. 1瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總 RNA 的質(zhì)量4.2 PCR 引物設(shè)計(jì)原則PCR 擴(kuò)增引物，是指與待擴(kuò)增的靶 D

33、NA 區(qū)段兩端序列互補(bǔ)的人工合成的寡核苷酸短片段。引物的設(shè)計(jì)在整個(gè) PCR 擴(kuò)增中占十分重要的地位，引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定 PCR 反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。若引物設(shè)計(jì)不合理，PCR小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-15-反應(yīng)的特異性及擴(kuò)增效率均會(huì)降低。引物設(shè)計(jì)的基本原則是最大限度的提高擴(kuò)增效率和特異性，同時(shí)盡可能的抑制非特異性的擴(kuò)增。好的引物所具有的特點(diǎn)是：（1）典型的引物為 18-24 個(gè)核苷酸。引物需要足夠長(zhǎng)，保證序列的獨(dú)特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但長(zhǎng)度大于 24 核苷酸的引物并不意味著有更高的特異性，較長(zhǎng)的序列可能會(huì)與錯(cuò)誤的配對(duì)序列雜交，降低了特異性，而且比

34、較短的序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。（2）引物要與靶 cDNA 的兩側(cè)序列互補(bǔ)，但不能自我互補(bǔ)相互結(jié)合形成二聚體。（3）引物的堿基應(yīng)盡可能的隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，選擇 GC 含量為 40%-60%。（4）設(shè)計(jì) 5端和中間區(qū)為 G 或者 C 的引物，這會(huì)增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。（5）避免引物對(duì) 3末端存在互補(bǔ)序列，這會(huì)形成引物二聚體抑制擴(kuò)增。（6）避免引物 3末端富含 GC，設(shè)計(jì)引物時(shí)保證在最后 5 個(gè)核苷酸中含有 3個(gè) A 或者 T。（7）兩條引物還要有匹配的 GC 含量和相似的退火溫度。引物所對(duì)應(yīng)模板序列的 Tm 值最好在 72左右。以公式（4G/C

35、 + 2A/T-5）計(jì)算 Tm 值。選擇較低 Tm 值的引物的退火溫度為反應(yīng)的退火溫度。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用 Pcrdesn 引物設(shè)計(jì)軟件對(duì) Mcm6 電子克隆獲得的全長(zhǎng) cDNA 序列設(shè)計(jì)了 2 條引物，引物的核酸序列和長(zhǎng)度見 1.3 節(jié)。4.3 PCR 常見的問題（1）假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR 反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及，PCR 循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。（2）假陽(yáng)性，出現(xiàn)的 PCR 擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高?？赡苁且镌O(shè)計(jì)不合適，靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-16-（3

36、）出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是 Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及 PCR 循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。（4）出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。4.4 PCR 反應(yīng)條件討論4.4.1 溫度與時(shí)間的設(shè)置(1)變性溫度與時(shí)間變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致 PCR 失敗的最主要原因。一般情況下，95C 變性 20-30S 即可使雜合的 RNA-DNA

37、 分子完全變性，若低于 93則 需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或 PCR 產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致 PCR 失敗。對(duì)于富含 G、C 的模板應(yīng)適當(dāng)?shù)奶岣咦冃缘臏囟取?(2)退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間退火溫度是影響 PCR 特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板 DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng) 度。對(duì)于 20 個(gè)核苷酸，G+C 含量約 50%的引物，55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的

38、復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度： Tm 值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T) 復(fù)性溫度=Tm 值-(510) 在 Tm 值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高 PCR 反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為 3060sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 (3)延伸溫度與時(shí)間Taq DNA 聚合酶的生物學(xué)活性： 小鼠 Mcm6 基因電子克隆的驗(yàn)證-17-7080 150 核苷酸/S/酶分子 70 60 核苷酸/S/酶分子 55 24 核苷酸/S/酶分子 高于 90時(shí)， DNA 合成幾乎不能進(jìn)行。 PCR 反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 7075之間，常用溫度

39、為 72，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR 延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定，一般 1Kb 以內(nèi)的 DNA 片段，延伸時(shí)間 1min 是足夠 的。延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。 (4)循環(huán)次數(shù): PCR 循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA 的濃度，一般為 25-35 次。循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 4.4.2 PCR 試劑盒（1）DNA 聚合酶DNA 聚合酶的濃度和效率是影響 PCR 反應(yīng)的重要因素。增加酶的量會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的特異性下降，酶量過少，則影響反應(yīng)產(chǎn)量，此外，擴(kuò)增片段的 GC 含量，長(zhǎng)度的不同對(duì)酶的種類選擇

40、不同，一般使用 Taq DNA 聚合酶，但如果 GC 含量過高(70%)則要選擇適合的酶. 如果擴(kuò)增片段 GC 含量高用 GCbuffer 效果要好，也可以用甘油、DMSO 代替 GCbuffer。la taq 對(duì) gc 含量較高的引物有較好的擴(kuò)增效果。（2）引物的濃度引物的濃度一般為 0.1-0.5umol/L，濃度過高會(huì)引起模板與引物的錯(cuò)配，PCR 反應(yīng)的特異性下降，同時(shí)形成引物二聚體的幾率擴(kuò)大，一旦形成引物二聚體，引物二聚體就可非常有效的被擴(kuò)增，并有可能成為主要 PCR 產(chǎn)物。一對(duì)引物間的 3端互補(bǔ)能促進(jìn)引物二聚體的形成，即使兩引物的 3端互補(bǔ)序列在低復(fù)性溫度、高酶濃度，高引物濃度條件下，只要有足夠