動物分子遺傳育種學(xué)(-2)

1、第二講 基因組序列詮釋5. 轉(zhuǎn)錄物組6. 蛋白質(zhì)組問題細(xì)胞周期的不同時期個體發(fā)育不同階段不同的器官和組織不同的外界環(huán)境下 各種基因的表達(dá)與否、量的差異、表達(dá)部位如何5. 轉(zhuǎn)錄物組5.1 Northern雜交雜交主要步驟： 提取總RNA不同組織、不同器官 變性電泳 制備目的基因探針 轉(zhuǎn)移尼龍膜 放射性 或 化學(xué)標(biāo)記法 雜 交 掃描或放射自顯影 依據(jù)雜交信號的強弱、有無判斷基因的表達(dá)部位、 表達(dá)量、表達(dá)時期等 5.2 SAGESAGE serials analysis of gene expression基因表達(dá)系列分析 1995 Velculescu 及其同事年創(chuàng)立SAGE特點：進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物組研究

2、，也就是轉(zhuǎn)錄水平的研究；通過快速和詳細(xì)分析成千上萬個EST來尋找出表達(dá)豐度不同的SAGE標(biāo)簽序列，從而接近完整地獲得基因組的表達(dá)信息； SAGE區(qū)別于差異顯示、消減雜交等其它技術(shù)的主要特點是可用于尋找那些較低豐度的轉(zhuǎn)錄物，最大限度地收集基因組的基因表達(dá)信息，這使之成為從總體上全面研究基因表達(dá)、構(gòu)建基因表達(dá)圖譜的首選策略；SAGE可用于在不同環(huán)境、不同生理狀態(tài)及不同生長階段的細(xì)胞和組織表達(dá)圖譜構(gòu)建，對不同狀態(tài)下基因表達(dá)水平的定量或定性比較，特別是對疾病組織與正常組織的比較開展迅速； SAGE 技術(shù)的主要理論依據(jù)：來自轉(zhuǎn)錄物內(nèi)特定位置的一小段寡核苷酸序列911bp含有鑒定一個轉(zhuǎn)錄物特異性的足夠信息

3、，可作為區(qū)別轉(zhuǎn)錄物的標(biāo)簽tag；通過簡單的方法將這些標(biāo)簽串聯(lián)在一起，形成大量多聯(lián)體concatemer，對每個克隆到載體的多聯(lián)體進(jìn)行測序，并應(yīng)用SAGE軟件分析，可確定表達(dá)的基因種類，并可根據(jù)標(biāo)簽出現(xiàn)的頻率確定基因的表達(dá)風(fēng)度abundance。 1. 將5g含有oligo dT（引物）的磁珠與RNA混合。2. 合成雙鏈cDNA。3. 用Nla酶消化形成一條鏈末端有標(biāo)簽的產(chǎn)物。4. 將樣品分成兩份，連接成含有識別序列的產(chǎn)物，以備用BsmF1消化。5. 用Mme I切割每一個樣品形成約60bp的標(biāo)簽。SAGE 步驟6. 延伸5秒，連接成約130bp的雙鏈標(biāo)簽。7. PCR擴增。8. 用Nla 酶切

4、130bp產(chǎn)物釋放34bp雙鏈標(biāo)簽。9. 連接片斷形成串聯(lián)體。10. 克隆到pZErO-1+里，并測序。SAGE實例5.3 基因芯片何為生物芯片? 生物芯片主要指通過平面微細(xì)加工技術(shù)在固體芯片外表構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。 它是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠(yuǎn)意義 的科學(xué)技術(shù)革命。生物芯片分類 基因芯片技術(shù)是指通過微陣列(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相外表，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測

5、等方面研究的最新革命性技術(shù)?；蛐酒蛐酒_展歷史Southern & Northern BlotDot BlotMacroarrayMicroarray基因芯片的主要應(yīng)用基因表達(dá)檢測 擬南芥、酵母基因表達(dá)研究等突變檢測 BRCA基因外顯子、CFTR基因、-地中海貧血、酵母突變菌株、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因等的突變檢測等基因組多態(tài)性分析 人類基因組單核苷酸多態(tài)性的鑒定及分系析，人線粒體16.6kb基因組多態(tài)性的研究等基因文庫作圖 通過確定重疊克隆的次序從而對酵母基因組進(jìn)行作圖 Types of DNA Chips基因芯片研制的總體藍(lán)圖 研制方向確實定基因組序列分析與待檢基因探針序列確實

6、定檢測樣品 的制備探針陣列的準(zhǔn)備檢測設(shè)備的研制雜交檢測與數(shù)據(jù)分析表達(dá)芯片的制備檢測流程表達(dá)芯片實例PCR法從外周血淋巴細(xì)胞cDNA文庫擴增產(chǎn)物擴增產(chǎn)物點樣于包被的玻片上DNA 芯片熱擊T細(xì)胞cDNA未處理的細(xì)胞cDNA 雜交 雜交激光共聚焦掃描發(fā)現(xiàn)17個差異表達(dá)基因,11個被熱誘導(dǎo),6個被熱抑制,發(fā)現(xiàn)其中3個為未發(fā)現(xiàn)的新基因6. 蛋白質(zhì)組 DNAmRNAPROTEIN(活性)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(transcriptional control)翻譯水平調(diào)控(Translational control)翻譯后水平調(diào)控(Post-translational control)6.1蛋白質(zhì)組(Proteome

7、) Proteome來源于 Proteins和 genome 兩個詞的組合,意思是Proteins expressed by a genome,即基因組表達(dá)的蛋白質(zhì).蛋白質(zhì)組定義 廣義上是指某種細(xì)胞或組織中基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì); 狹義上, 可以指不同時期細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化.蛋白質(zhì)組學(xué)定義 研究蛋白質(zhì)組結(jié)構(gòu)和功能的領(lǐng)域稱為蛋白質(zhì)組學(xué).蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容: 分析全部蛋白質(zhì)組所有成分以及它們的數(shù)量; 確定各種組分所在的空間位置、修飾方法、互作機制、生物活性和特定功能等 6.2 蛋白質(zhì)組分析復(fù)雜性蛋白質(zhì)有許多加工方式,如磷酸化、糖基化、乙?；?、泛素化等；mRNA 的可變剪接、程序性移碼和可控突變，

8、1個基因可編碼許多不同的蛋白質(zhì)，常常表現(xiàn)為組織特異性；蛋白質(zhì)之間存在大量的相互作用，如形成同源或異源二聚體、三聚體或多聚體，不同的結(jié)合狀態(tài)有不同的活性；1種蛋白質(zhì)可參與多種反響，或多種蛋白質(zhì)參與1種反響。6.3蛋白質(zhì)組研究技術(shù) 蛋白質(zhì)組主要研究技術(shù)： 雙向電泳 生物質(zhì)譜技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片 酵母雙雜交6.3.1 雙向凝膠電泳 樣品制備包括蛋白質(zhì)的溶解、變性及復(fù)原，從而去除非蛋白質(zhì)雜質(zhì)等 第一向等電聚焦根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異進(jìn)行別離 第二向SDS-PAGE以蛋白質(zhì)分子量差異為根底蛋白質(zhì)的檢測用考馬斯亮藍(lán)、銀染、銅染等方法圖譜數(shù)字化分析圖象掃描、確定每個蛋白質(zhì)點的等電點和分子量，尋找差異蛋白6.3.2 蛋

9、白質(zhì)組分析技術(shù) 主要蛋白質(zhì)組分析技術(shù)： 質(zhì)譜方法 蛋白質(zhì)序列分析 氨基酸組成分析質(zhì)譜技術(shù)的根本原理： 樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)核比m/z的差異來別離并確定分子量。質(zhì)譜儀組成： 進(jìn)樣裝置、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。質(zhì)譜技術(shù)在蛋白組研究中的應(yīng)用：A 肽質(zhì)譜和肽序列分析 蛋白質(zhì)經(jīng)雙向電泳后，別離到的蛋白質(zhì)被切割下來，進(jìn)行膠內(nèi)酶解，或轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，進(jìn)行膜上膜解，然后上樣進(jìn)行測序。 但目前質(zhì)譜法還不能夠取代Edman降解法測序，可是其測定速度較快。B 鑒定翻譯后修飾的蛋白質(zhì) 質(zhì)譜可通過特征離子監(jiān)測的方法很快確定磷酸化肽，通過串聯(lián)質(zhì)譜確定磷酸化位點； 質(zhì)譜可與蛋白

10、酶解和糖苷酶酶解結(jié)合，尋找糖肽，鑒定糖基化位點； 質(zhì)譜還參與糖鏈組成、結(jié)構(gòu)甚至分支情況等的分析。 C 質(zhì)譜技術(shù)的其他作用 質(zhì)譜可對蛋白質(zhì)二硫鍵進(jìn)行定量和定位，分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，以及蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)等。6.4蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的建立和生物信息學(xué) 數(shù)據(jù)庫的建立是蛋白質(zhì)組研究的最重要的一個方面。 蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫包括： 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫 雙向電泳圖譜數(shù)據(jù)庫 有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫 6.5 與疾病相關(guān)蛋白質(zhì)研究的根本策略6.6 蛋白質(zhì)組研究的目的建立蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)為人們了解生物體的各個生長、發(fā)育期的各個蛋白質(zhì)有機組成、協(xié)作，更完整的解釋各種生命現(xiàn)象奠定根底

11、促進(jìn)人類疾病的治療本章要點一個DNA片段，如何預(yù)測其開放讀碼框?RACE技術(shù)的根本原理是什么?動物園雜交的原理基因剔除法RNAi的作用原理及應(yīng)用酵母雙列雜交的原理SAGE 的根本原理及技術(shù)路線什么是蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)組學(xué)，以及蛋白質(zhì)組的研究目的和意義？第三章 物理作圖(physical mapping)物理作圖: 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)直接將DNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組的實際位置物理圖的距離: 依作圖方法而異,輻射雜種作圖的計算單位為厘鐳(cR);限制性片段作圖與克隆作圖的圖距單位為堿基對(bp)物理作圖的方法 限制酶作圖(Restriction Mapping) 依靠克隆的基因組作圖(c

12、lone-based mapping) 熒光原位雜交(Fish, Fluorescent in situ hybridization) 序標(biāo)位作圖 (STS，Sequence taged site)1. 限制性作圖 它是將限制性酶切位點標(biāo)定在DNA分子的相對位置. 其只能應(yīng)用于較小的DNA分子,其上限取決于作圖分子中限制酶位點的頻率. 通常采用的6堿基對識別順序的限制酶僅適合50Kb以下DNA分子的精確作圖.1.1 限制酶作圖(Restriction Mapping)根本原理1Kb EcoR I待檢的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBH H EH H H H E+BEB6

13、KbEH 4KbEB 5KbBH 跨疊克隆群(Contig)酶切位點1.2 限制酶作圖的改進(jìn)脈沖凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis)稀有切點限制圖繪制稀有切點限制圖繪制本卷須知: 識別順序越長產(chǎn)生的片段越大; 識別位點堿基的組成影響限制性片段的大小; 如人類基因組A/T比例接近60/%,選用高比例A/T位點限制酶,產(chǎn)生的片段多于高比例G/C識別位點酶 有些限制酶識別位點較長 如酵母的-Sce識別順序為18bp, 如果高等真核生物基因組中無此序列,可通過轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座和噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將其引入代測基因組中. 基因組DNA 的甲基化狀態(tài) 如人類活細(xì)胞基因組中大量

14、5-CG-3順序的胞嘧啶被甲基化,使許多含有5-CG-3順序的內(nèi)切酶很少找到可切位點.2.1 大片段DNA的克隆載體 YAC: 酵母人工染色體 230-1700Kb BAC: 細(xì)菌人工染色體 300Kb PAC: P1人工染色體 300Kb Fosmids: 30Kb2. 基于克隆的基因組作圖2.2 重疊群組建重疊群:相互重疊的DNA片段組成的物理圖.重疊群的組建方法 染色體步移法 指紋作圖法 指紋:系指確定DNA樣品所具有的DNA片段; 一個克隆的指紋表示了該克隆所具有的限定的順序特征. 常用的指紋分析方法: A 限制性帶型(restriction patterns)指紋 B 重復(fù)順序DNA

15、指紋(repetitive DNA fingerprints) C STS目錄作圖(STS content mapping) D 重復(fù)DNA PCR(repetitive DNA PCR)或分散重 復(fù)順序PCR(interspersed repeat element PCR, IRE- PCR)指紋3. 熒光原位雜交(Fish, Fluorescent in situ hybridization)將探針用熒光標(biāo)記，與細(xì)胞分裂中期的染色體雜交，用熒光顯微鏡觀察信號所處的位置，將探針標(biāo)定在連鎖圖上。用DNA纖維分析水稻第4號染色體 4. 序標(biāo)位作圖 (STS, Sequence Taged Sit

16、e)長度: 100-500 bp序列, 可以設(shè)計PCR反響單拷貝, 在染色體上的位置是唯一的EST(Expressed sequence tag) 大局部可以作STS4.1 STS作圖原理4.2 尋找STS的方法:表達(dá)順序標(biāo)簽(expressed sequence tag，EST) 從cDNA中找到的小段順序, 但基因家族成員間共有的序列不能用于STS。SSLPsimple sequence length polymorphisrns，SSLPs隨機基因組順序EST1990年，Brenneer等首先提出人類基因組大規(guī)模cDNA測序方案以來，Adams等最先采納并最早建立了表達(dá)序列標(biāo)記技術(shù)，他們隨機挑選cDNA克隆進(jìn)行單向、一步大規(guī)模測序，將所獲得的局部cDNA序列稱為。EST是一個cDNA克隆快速大規(guī)模測序后所獲得的端和端局部cDNA隨機片段，每個EST長度約200600bp,代表了一個單拷貝基因的局部cDNA表達(dá)序列。由于大多數(shù)的長度缺乏400bp,說明一個基因轉(zhuǎn)錄本的cDNA序列可能包含多個序列重疊的EST，由于一個基因mRNA剪接點不同可以獲得多個cDNA克隆，因此EST既可能對應(yīng)于一個cDNA的某一局部，又可能代表mRNA的不同剪接方式。4.3 STS的物理圖定位輻